Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

O objetivo geral deste procedimento é permitir a análise de lapso de tempo de diversos processos de desenvolvimento usando um microscópio de dissecação fluorescente com estratégias simples de realinhamento após deriva em qualquer direção. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do desenvolvimento, pois permite a observação direta do desenvolvimento de tecidos e órgãos em embriões vivos por várias horas. A principal vantagem desse método é que ele é uma alternativa acessível e fácil de usar às técnicas mais complexas normalmente usadas para registro de tecidos e órgãos em desenvolvimento, como varredura a laser ou microscopia de luz.

Embora este método possa fornecer informações sobre alterações espaciais e temporais que ocorrem durante o desenvolvimento de embriões e larvas de peixes varredores, ele também pode ser aplicado para investigar processos iniciais de desenvolvimento e outros organismos modelo. Além disso, é adequado para observar processos dinâmicos em organismos adultos, como cicatrização e regeneração radicular. Na preparação, identificar peixes adultos altamente reprodutivos da linhagem transgênica que expressa GFP.

Na tarde anterior à microinjeção da planta, coloque cinco pares macho-fêmea de peixes reprodutivos em cinco recipientes de reprodução. Nos recipientes, mantenha o macho e a fêmea separados por uma peneira removível durante a noite. Na manhã seguinte, logo após as luzes se acenderem, coloque um macho e uma fêmea juntos acima da peneira, o que os impedirá de comer seus ovos.

Agora, observe os peixes enquanto eles desovam. Quando o par produzir cerca de 50 ovos, separe-os. Em seguida, transfira os ovos usando uma pipeta Pasteur para uma placa Petrie cheia de água embrionária para uma primeira rodada de injeção.

Repita esse processo para cada par acoplado. Se forem necessários ovos adicionais, os mesmos pares de acasalamento podem ser reunidos e separados várias vezes. Para a microinjeção, a preparação avançada de pratos e agulhas de injeção é feita de maneira bastante padronizada.

Os detalhes podem ser encontrados no protocolo de texto. Comece carregando uma agulha de injeção preparada. Usando uma ponta de microcarregador, preencha a agulha com dois microlitros de solução de trabalho MO e, em seguida, prenda a agulha em um micromanipulador.

Em seguida, a ponta da agulha pode ser aberta. Ao visualizá-lo com o microscópio de dissecação, use uma pinça para abrir a extremidade ou empurre a ponta contra uma superfície rígida. Em seguida, calibre o volume de injeção injetando a solução de MO em uma gota de óleo mineral em uma retícula.

Ajuste a injeção para fazer gotas de 75 mícrons, o que corresponderá a cerca de 200 picolitros de solução. Em seguida, prepare os embriões a serem injetados. Disponha os cerca de 21 embriões em estágio celular ao longo da ranhura da placa de microinjeção com o pólo vegetal orientado para a abordagem da agulha de microinjeção, que está em um ângulo de 45 graus em relação à ranhura.

Agora, injete os embriões. Com a agulha, perfure o córion e a gema e, em seguida, injete a solução de Morpholino carregada na gema. Isso funciona para embriões no estágio de uma ou duas células.

Depois de injetar todos os embriões, use um Pasteur de calibre largo para coletá-los. Transfira os embriões injetados para placas de Petri cheias de água embrionária e incube-os a 28,5 graus Celsius. No final da tarde, retire os embriões mortos e substitua a água do embrião.

Na manhã seguinte, depois que os embriões passarem por gastrulação, iniba sua melanização substituindo a água por água embrionária contendo um traço de PTU. Tenha cuidado, o PTU interromperá o desenvolvimento adequado antes da gastrulação. Mais tarde, no estágio de desenvolvimento desejado, descorione os embriões com uma pinça afiada.

Usando o microscópio, pegue o córion com uma pinça e tente agarrar o outro lado do córion com uma segunda pinça. Em seguida, separe cuidadosamente a pinça sem interromper o embrião. Em seguida, anestesiar os embriões com tricaína e prosseguir com a incorporação dos embriões e agarose em uma grade de realocação de 15 mícrons colocada em uma microplaca com fundo de vidro de cobertura.

Em seguida, carregue alíquotas de um mililitro de agarose derretida em tubos de reação de 1,5 mililitro. Coloque os tubos em blocos de calor ajustados para 36 graus Celsius e espere que esfriem. Em seguida, usando uma pipeta de diâmetro largo, transfira um embrião para a microplaca.

Retire o excesso de água do embrião e cubra o embrião com agarose. Enquanto a agarose ainda estiver líquida, use duas pequenas pontas de pipeta para orientar os embriões. Posicione a estrutura de interesse, neste caso, o pronefro, o mais próximo possível do fundo do vidro e próximo à grade.

A grade não deve se sobrepor à estrutura de interesse. É vantajoso incorporar até quatro embriões em diferentes microplacas e planejar a imagem do melhor. A incorporação adequada precisa de alguma prática.

Enquanto a agarose ainda é líquida, o embrião deve ser orientado na posição desejada. Se for um pronephros próximo ao fundo do vidro e a uma distância adequada da grade de realocação. Verifique a agarose rotineiramente.

Quando estiver duro o suficiente para segurar os embriões, deixe-o repousar por mais dois a três minutos. Em seguida, cubra o embrião incorporado com água embrionária contendo vestígios de PTU e tricaína. Transvase ou sifone o excesso de água do embrião e trave a tampa para evitar a evaporação.

O resultado não deve ter bolhas de ar. O embrião agora pode ser fotografado com o fundo de vidro voltado para a lente objetiva. Usando a preparação para fazer imagens de lapso, por exemplo, tirando imagens Z-stack periodicamente ao longo de várias horas, é necessário corrigir o desvio focal.

Se possível, aplique uma estratégia de foco automático. Alterne a opção de foco automático no controle do software. Para o canal de referência, escolha o canal de campo brilhante da luz transmitida para minimizar a fototoxicidade.

Também é essencial escolher uma faixa de pesquisa dependente da amostra suficientemente grande para que o foco automático funcione corretamente. Antes de coletar imagens, posicione um ponto específico da grade impressa próximo à estrutura de interesse na mira do software e salve essa posição usando uma captura de tela. Em seguida, pouco antes de cada intervalo de tempo de imagem terminar, consulte a captura de tela e reajuste a posição da platina e o foco se o foco automático não estiver em uso.

O método apresentado foi utilizado para analisar o desenvolvimento renal em embriões morfizados WT1A de uma linhagem transgênica de peixe-zebra. Durante o início do nefrógeno, esta linha escolheu fluorescência verde no mesoderma intermediário, onde surgem os progenitores renais, e mais tarde durante o desenvolvimento nos túbulos em formação e primórdios de néfrons. A imagem de lapso de tempo revelou nefrogênese normal nos embriões injetados com morfolino controle.

Às 20 horas após a fertilização, os túbulos pronéfricos em desenvolvimento eram visíveis. Em suas pontas anteriores, um acúmulo esférico de células representando os primórdios dos néfrons em formação pôde ser detectado. Durante as horas seguintes, os túbulos e os primórdios dos néfrons cresceram e os primódios começaram a se fundir na linha média.

Em contraste, a nefrogênese foi severamente interrompida nos mutantes. Embora as estruturas tubulares positivas para GFP fossem visíveis 20 horas após a fertilização, elas eram difusas e subdesenvolvidas. A imagem de lapso de tempo mostrou que a primorgia do néfron nunca se formou, e um número impressionante de células fluorescentes localizadas fora dos pronefrônios em desenvolvimento migrou ventralmente, deixando o campo pronéfrico.

Ao tentar este protocolo, é importante lembrar que a ausência de equipamentos adicionais, como controle de temperatura ou tabelas antievaporação, requer verificações regulares de desvios e reajustes. Após esse procedimento, os embriões de imagem podem ser processados para realizar outros métodos, como imuno-histoquímica, incetrohipertização ou PCR em tempo real, a fim de identificar componentes específicos de células, tecidos ou avaliar a expressão gênica.