Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

O objetivo geral deste procedimento é isolar, identificar e purificar células epiteliais tímicas ou tecnologia. Isso é feito primeiro enzimaticamente, digerindo e interrompendo mecanicamente o timo para dissociar a tecnologia em uma única suspensão celular. Em seguida, a tecnologia pode ser analisada por citometria de fluxo ou enriquecida por meio de uma estratégia de panorâmica.

Em última análise, os subconjuntos epiteliais tímicos podem ser purificados por classificação celular ativada por fluorescência. Este método pode ajudar a responder a muitas questões-chave no campo do desenvolvimento de células T, como, por exemplo, como as células epiteliais tímicas promovem a seleção tímica? O que causa a disfunção tímica em animais idosos e como podemos alcançar a reconstituição de células T in vitro?

As principais vantagens desta técnica são a alta recuperação de células germinativas emêmicas variáveis, o enriquecimento imparcial das células epiteliais êmicas e a alta pureza que pode ser alcançada pela classificação celular. Para isolar as células estromais tímicas, primeiro identifique o timo, que fica logo abaixo das costelas e se parece com dois lobos brancos finos sobrepostos ao coração. Em seguida, desconecte o tecido conjuntivo ao redor do timo e use uma pinça serrilhada curva para puxar e remover suavemente os lobos tímicos.

Coloque os lóbulos em uma placa de seis poços contendo cinco mililitros de meio e corte qualquer gordura e tecido conjuntivo circundantes. Em seguida, transferiu os lóbulos aparados para um novo poço contendo cinco mililitros de solução enzimática recém-preparada e usou uma tesoura fina para fazer pequenas incisões no tecido. Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius.

Após 20 minutos, pipete suavemente o tecido para cima e para baixo várias vezes com uma pipeta de cinco mililitros para dissociar a pasta em uma única suspensão celular. Colete a fração sobrenadante em um tubo de 50 mililitros contendo 10 mililitros de tampão rico em albumina fria no gelo para neutralizar as enzimas. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de solução enzimática ao tecido restante.

Incube a placa por 15 minutos. Depois disso, agite suavemente o tecido com uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de 18 genes para quebrar quaisquer agregados. Em seguida, transfira o para o tubo de coleta.

Em seguida, adicione 2,5 mililitros de solução enzimática ao tecido restante. Incube a placa por 15 minutos. Após a terceira incubação, repita a agitação mecânica com uma agulha 20 5G.

Depois de incubar o tecido por cinco a 10 minutos finais, transfira o sobrenadante para o tubo de coleta para centrifugação para identificar a tecnologia recuperada por citometria de fluxo Seguindo os procedimentos padrão de coloração de anticorpos, execute as amostras em um citômetro de fluxo multiparâmetro e analise os dados usando o software de análise de fax apropriado para enriquecer ainda mais a tecnologia pelo método panning. Primeiro, incube as células com o anticorpo apropriado para o enriquecimento. Em seguida, adicione a suspensão da célula a uma placa panorâmica pré-codificada e, em seguida, gire a placa e incubada à temperatura ambiente.

Após 30 minutos, agitar vigorosamente a placa e transferir o sobrenadante para um tubo cónico. Enxágue o prato duas vezes com água fresca, média, acumulando as lavagens no tubo de coleta. Em seguida, depois de girar as células, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio fresco e transfira a suspensão celular para uma nova placa panorâmica, coletando as células após girar e incubar como acabamos de demonstrar para purificar ainda mais a tecnologia enriquecida em seus subconjuntos de células tímicas.

Após a rotulagem com os anticorpos apropriados, classifique o técnico através de um bico de 100 micrômetros por classificação de células ativadas por fluorescência, coletando as células em 30% de volume por volume FBS em meio. Nesta estratégia de gating representativa para identificação de tecnologia por citometria de fluxo, a expressão de epca, mas não de CD 45 pela técnica, pode ser observada. Assim, a tecnologia pode ser fechada de acordo com sua tecnologia de expressão ep, camm e CD 45 é composta por subconjuntos epiteliais tímicos corticais ou CEC e medulares ou mtech.

Esses subconjuntos podem ser distinguidos pelo anticorpo 51 vivo, que reconhece a glutamil aminopeptidase G expressa por ctec e a lectina UEA, que se liga à mtech tanto ctech quanto Mtech expressa MHC Classe dois em suas superfícies. Embora a mtech possa ser classificada em populações mtech low e mtech high, dependendo do nível de expressão de MHC dois, aproximadamente oito vezes mais tecnologia pode ser recuperada usando o protocolo baseado em enzima de liase recém-demonstrado em comparação com um protocolo com colagenase e espaço em disco com cerca de nove vezes 10 elevado ao quinto, capaz de ser recuperado de apenas um timo de camundongo para diminuir o tempo de classificação e aumentar a viabilidade do células estromais recuperadas. O panning pode ser usado, como acabamos de demonstrar, para esgotar os locais dos timócitos em comparação com as células inteiras do timo preparadas.

A proporção de tecnologia aumenta de menos de 0,5% para mais de 15% na população de células pós-enriquecidas. Após o movimento panorâmico, as proporções dos subconjuntos de tecnologia não são alteradas, sugerindo que nenhum dos subconjuntos é seletivamente perdido durante o movimento panorâmico. Em comparação com a amostra de enriquecimento preen, a taxa de recuperação da tecnologia é de cerca de 85%Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como enriquecer as células germinativas temáticas de mais do que por pânico, bem como identificar e purificar mais subsídios epiteliais temáticos por citometria de fluxo.