O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar células dendríticas e células epiteliais do timo humano. Isso é realizado inicialmente fragmentando o tecido dissecado por ruptura mecânica. Em seguida, os fragmentos de tecido são ainda mais digeridos enzimaticamente para produzir uma suspensão de células únicas.

Finalmente, a suspensão celular é enriquecida para a fração de baixa densidade de células por separação perca. Por fim, as células dendríticas e epiteliais podem ser isoladas desta fração por classificação magnética ou de fato, ou uma combinação de ambos. O método que apresentamos aqui fornece um procedimento eficiente, reproduzível e econômico para o isolamento bem-sucedido e o estudo subsequente de populações celulares raras, como células dendríticas e células epiteliais tímicas encontradas no timo humano.

I rotta, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório, demonstrará o procedimento para você. Comece colocando o tecido do timo em uma placa de Petri contendo PBS estéril à temperatura ambiente e enxágue qualquer resíduo de sangue. Em seguida, adicione PBS fresco à placa de Petri e use pinças e tesouras para limpar quaisquer coágulos sanguíneos, tecido conjuntivo e gordura, e quaisquer partes do tecido que não pareçam ser saudáveis.

Uma vez que o tecido do timo esteja limpo, pese-o para referência e depois corte o tecido em pedaços de um centímetro cúbico de tamanho uniforme. Agora cubra os pedaços com PBS e coloque-os no gelo. Em seguida, use a parte de trás de um êmbolo de seringa estéril de 10 a 20 mililitros para aplicar rapidamente uma pressão leve no tecido para remover a maior parte dos timócitos e reduzir o volume geral do tecido a ser digerido.

A solução ficará visivelmente turva. À medida que os timócitos são liberados, mexa o prato suavemente e depois use um aspirador de vidro para remover o sobrenadante contendo tim, tomando cuidado para não aspirar acidentalmente as peças de tecido. Pode ser útil usar um raspador estéril de cultura celular para concentrar todas as peças de tecido para um lado do prato e, em seguida, inclinar o prato em um ângulo de 45 graus e aspirar o sobrenadante restante.

Lave o prato com PBS fresco e continue a coletar o sobrenadante até que o PBS esteja relativamente transparente. Realize uma lavagem final com RPMI e, em seguida, use tesouras afiadas para picar os pedaços de tecido o mais fino possível, pelo menos pequenos o suficiente para entrar em uma pipeta de cinco mililitros para isolar células dendríticas ou dc. Primeiro, coloque até 10 gramas de peças de tecido em malha em tubos de 50 mililitros com 10 mililitros de solução de colagênio DNA e 10 mililitros de RPMI por cinco gramas de tecido.

Em seguida, incube a suspensão de tecido por 40 minutos sob rotação lenta em um incubatório térmico a 37 graus Celsius. A solução enzimática ficará turva à medida que as células são liberadas nela. No final da digestão, centrifugue a suspensão celular por dois minutos a 110 G e temperatura ambiente para sedimentar os fragmentos de tecido, colete o sobrenadante e, em seguida, pelete a suspensão celular.

Dessa vez, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 a 50 mililitros de RPM completo. Dependendo do tamanho do pelete, determine o número de células viáveis ​​pela exclusão de azul de triano e, em seguida, coloque a suspensão celular a 37 graus Celsius com uma tampa solta para isolar as células epiteliais tímicas ou t. Próximo Resus, suspenda os restos de tecido em 10 mililitros de solução de colagênio DNA fresco, mais 10 mililitros de RPMI e tripsina EDTA.

Continue digerindo os fragmentos de tecido por 40 minutos a 37 graus Celsius com rotação suave. Durante os últimos 10 a 15 minutos da incubação, adicione soro fetal de bezerro em uma proporção de um para cinco para neutralizar a tripsina. Após peletar os fragmentos de tecido, colete o sobrenadante e centrifugue novamente a suspensão celular.

Dessa vez, aspire cuidadosamente e descarte o sobrenadante, tomando cuidado para preservar o pelete solto. Após contar o número de células viáveis, coloque esta suspensão celular também a 37 graus Celsius. Para enriquecer a fração de baixa densidade ou células LDF, comece peletando as suspensões celulares previamente reservadas para enriquecimento de DC e tech enquanto as células estão sedentificando.

Configure um gradiente de densidade por chamada de 1,07 grama por mililitro. De acordo com esta tabela, resus suspenda ambos os peletes até um por dez das nove células em seis mililitros da solução por chamada preparada. Misture a solução celular suficientemente para obter uma suspensão homogênea e, em seguida, transfira as soluções para tubos de centrífuga de policarbonato Oakridge de 50 mililitros com tampa de parafuso.

Em seguida, use uma pipeta para depositar lentamente 30 mililitros de RPM completo por tubo no topo da suspensão celular perca. Tendo cuidado para não misturar as camadas, transfira cuidadosamente os tubos para uma centrífuga pré-resfriada com um rotor de ângulo fixo e separe as células por 35 minutos. Em seguida, use pipetas posteriores estéreis para transferir cuidadosamente as frações celulares enriquecidas de baixa densidade da interface entre o per call e o meio para tubos de 50 mililitros contendo RPM completo frio.

Então, preencho os tubos com RPM adicional completo para diluir o per call restante. Finalmente, lave as células enriquecidas duas vezes em RPM incompleto, em seguida, ressuspenda o pelete em meio fresco e determine o número de células viáveis. Nesta primeira figura, é mostrado um pedaço de tecido de nove centímetros bastante grande obtido de uma criança de 6 anos, conforme demonstrado.

Um passo importante inicial é limpar o tecido de partes indesejáveis. Conforme indicado pelos setas brancas, uma suspensão única de células do tecido do timo foi então obtida e enriquecida para células de fração de baixa densidade. Enquanto uma suspensão única típica contém aproximadamente 3%de células H-L-A-D-R positivas após a separação por gradiente de densidade, esse percentual aumenta para 15 a 40%nas células de grande porte.

Fração de baixa densidade na fração de alta densidade, que consiste principalmente de pequenos timócitos uniformes. Não existem praticamente tais células. Tímicas.

As células dendríticas mieloides podem ser identificadas pela expressão de vários marcadores de superfície, incluindo CD 11 C. Esta figura mostra a isolação eficiente de células CD 11 C positivas usando um protocolo modificado de separação magnética de células após o isolamento. A pureza das DC CD 11 C positivas foi de 93%conforme estabelecido pela imunocoloração das células isoladas. Em média, a recuperação das células CD 11 C positivas isoladas é de cinco vezes 10 ao cinco a cinco vezes 10 ao seis células dendríticas mieloides para 10 ao nove células tímicas totais.

Nesta tabela, dados representativos obtidos de várias amostras de timo individual de diferentes idades e peso de tecido com uma faixa de suspensões únicas de células de entrada, bem como números totais de células de fração de baixa densidade e o rendimento e pureza subseqüente de CD 11 C positivos são mostrados na fração enriquecida de células apresentadoras de antígeno apenas. Aproximadamente 0,5%das células são CD 45, EPCA positivo de baixa ou CD 45 negativo EPAM positivo, células epiteliais corticais e células epiteliais medulares podem ser classificadas das células estromais enriquecida