O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar células dendríticas e células epiteliais do timo humano. Isso é realizado primeiramente fragmentando o tecido dissecado por meio de disruptura mecânica. Em seguida, os fragmentos de tecido são digeridos enzimaticamente para produzir uma suspensão de células simples.

Por fim, a suspensão celular é enriquecida pela fração de células de baixa densidade por meio da separação em gradiente de Percoll. Em última análise, as células dendríticas e epiteliais podem ser isoladas dessa fração por meio de separação magnética ou ordenação por FACS, ou uma combinação de ambos os métodos. O método que apresentamos aqui fornece um procedimento eficiente, reprodutível e econômico para o isolamento bem-sucedido e o subsequente estudo de populações celulares raras, como células dendríticas e células epiteliais timicas encontradas no timo humano.

Um estudante de pós-graduação do nosso laboratório demonstrará o procedimento para você. Comece colocando o tecido timo em uma placa de Petri contendo PBS estéril à temperatura ambiente e remova qualquer sangue residual. Em seguida, adicione PBS fresco à placa de Petri e utilize pinça e tesoura para remover coágulos sanguíneos, tecido conjuntivo e gorduroso, bem como quaisquer partes do tecido que não pareçam saudáveis.

Uma vez que o tecido timo esteja limpo, pese-o para referência e, em seguida, corte o tecido em pedaços uniformes de um centímetro cúbico. Agora, cubra os pedaços com PBS e coloque-os sobre gelo. Em seguida, use a parte traseira do êmbolo de uma seringa estéril de 10 a 20 mililitros para aplicar rapidamente uma pressão suave sobre o tecido, removendo a maior parte dos timócitos e reduzindo o volume total do tecido a ser digerido.

A solução ficará visivelmente turva. À medida que os timócitos forem liberados, agite suavemente o recipiente e, em seguida, use um aspirador de vidro para remover o sobrenadante contendo os timócitos, tomando cuidado para não aspirar acidentalmente os fragmentos de tecido. Pode ser útil usar um raspador estéril para cultura celular para concentrar todos os fragmentos de tecido em um lado do recipiente e, em seguida, inclinar o recipiente em um ângulo de 45 graus e aspirar o sobrenadante remanescente.

Lave o recipiente com PBS fresco e continue a coletar o sobrenadante até que o PBS fique relativamente transparente. Realize uma lavagem final com RPMI e, em seguida, use tesoura afiada para picar os fragmentos de tecido da forma mais fina possível, pelo menos pequenos o suficiente para entrar em uma pipeta de cinco mililitros, a fim de isolar células dendríticas ou dc. Primeiro, coloque até 10 gramas de fragmentos de tecido em malha em tubos de 50 mililitros com 10 mililitros de solução de colagenase DNA e 10 mililitros de RPMI para cada cinco gramas de tecido.

Em seguida, incube a suspensão tecidual por 40 minutos sob rotação lenta em uma incubadora térmica a 37 graus Celsius. A solução enzimática ficará turva à medida que as células forem liberadas nela. Ao final da digestão, centrifugue a suspensão celular por dois minutos a 110 G e temperatura ambiente para sedimentar os fragmentos de tecido, colete o sobrenadante e, em seguida, péllete a suspensão celular.

Neste momento, descarte o sobrenatante e ressuspenda as células em 10 a 50 mililitros de RPMI completo. Dependendo do tamanho do pellet, determine o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano e, em seguida, coloque a suspensão celular a 37 graus Celsius com tampa solta para isolar as células epiteliais timicas ou t. Em seguida, ressuspenda os restos de tecido em 10 mililitros de solução fresca de colagenase e DNA, mais 10 mililitros de RPMI e tripsina-EDTA.

Digira os fragmentos de tecido por mais 40 minutos a 37 graus Celsius com rotação suave. Durante os últimos 10 a 15 minutos da incubação, adicione soro de bezerro fetal em uma proporção de um para cinco para neutralizar a tripsina. Após o centrifugamento dos fragmentos de tecido, colete o sobrenadante e centrifugue novamente a suspensão celular.

Neste momento, aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante, tomando cuidado para preservar o pellet solto. Após contar o número de células viáveis, coloque esta suspensão celular também a 37 graus Celsius. Para enriquecer a fração de baixa densidade ou células LDF, comece pela centrifugação das suspensões celulares previamente separadas para enriquecimento de DC e tech enquanto as células estão sendo centrifugadas.

Prepare um gradiente de densidade de 1,07 grama por mililitro da solução por célula. De acordo com esta tabela, re-suspenda ambos os pellets até um vezes 10 das nove células em seis mililitros da solução preparada por célula. Misture bem a solução celular para obter uma suspensão homogênea e, em seguida, transfira as soluções para tubos cônicos de poli carbonato de 50 mililitros com tampa de rosca tipo Oakridge.

Em seguida, utilize uma pipeta para sobrepor lentamente 30 mililitros de RPMI completo por tubo sobre a suspensão de células perca. Tendo o cuidado de não misturar as camadas, transfira cuidadosamente os tubos para uma centrífuga previamente resfriada com rotor de ângulo fixo e separe as células por 35 minutos. Em seguida, utilize pipetas estéreis para transferir cuidadosamente as frações enriquecidas de células de baixa densidade da interface entre as células perca e o meio para tubos de 50 mililitros contendo RPMI completo frio.

Em seguida, preencho os tubos com RPMI completo adicional para diluir o restante por célula. Por fim, lavo as células enriquecidas duas vezes com RPMI incompleto, ressuspendo o pellet em meio fresco e determino o número de células viáveis nesta primeira figura. Um pedaço de tecido relativamente grande, com nove centímetros, obtido de uma criança de 6 anos, é mostrado conforme acabou de ser demonstrado.

Uma etapa inicial importante é limpar o tecido das partes indesejáveis. Como indicado pelas setas brancas, obteve-se então uma suspensão de células únicas do tecido timo e enriqueceu-se a fração de células de baixa densidade. Enquanto uma suspensão típica de células únicas contém aproximadamente 3% de células positivas para H-L-A-D-R após separação por gradiente de densidade, esse percentual aumenta para 15 a 40% nas células de maior tamanho.

Fração de baixa densidade na fração de alta densidade, que consiste principalmente em timócitos pequenos e uniformes. Existem praticamente nenhum desses timócitos.

As células dendríticas mieloides podem ser identificadas pela expressão de diversos marcadores de superfície, incluindo CD11c. Esta figura mostra o isolamento eficiente de células positivas para CD11c utilizando um protocolo modificado de separação magnética de células após o isolamento. A pureza das células dendríticas positivas para CD11c foi de 93%, conforme determinado por imunomarcação das células isoladas. Em média, o rendimento de células positivas para CD11c isoladas é de cinco vezes 10 à quinta a cinco vezes 10 à sexta células dendríticas mieloides por 10 à nona células tímicas totais.

Nesta tabela, são apresentados dados representativos obtidos de várias amostras individuais de timo de diferentes idades e pesos teciduais, com uma variedade de suspensões simples de células de entrada, bem como o número total de células da fração de baixa densidade e o respectivo rendimento e pureza positivos para CD11c na fração enriquecida em células apresentadoras de antígeno. Aproximadamente 0,5% das células são CD45, células epiteliais corticais positivas para EPCA de baixa densidade ou células epiteliais medulares positivas para EPAM, que podem ser separadas das células estromais enriquecidas em CD45 de baixa densidade negativas, digeridas com tripsina, como EPAM baixo e positivo para CD2 ou EPAM alto e negativo para CD2, respetivamente. A obtenção de células dendríticas e subpopulações de células epiteliais timicas a partir de timo humano.

É um procedimento sensível ao tempo. Quanto mais rápida for a etapa de ululação, melhor será a condição das células. Uma vez dominado este protocolo, as células dendríticas podem ser isoladas em cinco a seis horas e as células epiteliais timicas em oito a dez horas.

Após assistir a este vídeo hoje, você deverá ter uma compreensão muito boa de como manipular tecido do timo humano para o isolamento bem-sucedido de células dendríticas e células epiteliais timicas. As células isoladas podem então ser utilizadas em diversas aplicações posteriores para estudos subsequentes, com o objetivo de caracterizar melhor as células e compreender mais profundamente sua biologia.