Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

O objetivo geral deste procedimento é medir simultaneamente o receptor e a ligação e observar a sinalização de cálcio induzida pela ligação em uma única célula. Isso é feito primeiro isolando a biotina e ajustando a osmolaridade dos glóbulos vermelhos humanos ou hemácias para usá-los como um transdutor de força ultrassensível. O segundo passo é funcionalizar as esferas de vidro em microescala, o que inclui limpeza, dilatação e revestimento de ligante.

Em seguida, as células T são isoladas e incubadas com o corante de cálcio menos 2:00 AM, o que permite a observação da concentração intracelular de íons cálcio. A etapa final é preparar as micropipetas em câmara experimental que são especialmente necessárias para a configuração do experimento. Em última análise, a sonda de força de biomembrana de fluorescência ou técnica BFP é usada para mostrar a adesão de uma célula a um grânulo revestido com ligante, medir a cinética de ligação do ligante do receptor e, enquanto isso, monitorar o nível de cálcio intracelular.

Essa técnica é útil para entender como a força mecânica é detectada pelas células T por meio do reconhecimento de andrógenos. Uma grande vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que o FBIP pode medir a cinética de ligação ao ligante do receptor e uma sinalização intracelular simultaneamente. As partes desafiadoras deste protocolo incluem a produção manual de caminhos micro pep dos diâmetros corretos, pegando células e abelhas com micro PEPs e montando a sonda de força, que pode falhar no início, Embora ele não pudesse estar aqui para a demonstração deste vídeo.

O co-autor Arnold G, que concluiu recentemente seu doutorado em meu laboratório, contribuiu significativamente para a validação inicial da fabricação do protocolo FBAP. Obtenha oito a 10 microlitros de sangue de uma picada no dedo e adicione a um mililitro de bicarbonato de carbonato, jato tampão deixe o vórtice ou pipete a mistura e centrifugue por um minuto a 900 G. Descarte o sobrenadante antes de realizar o tampão de carbonato de bicarbonato. Lave mais uma vez.

Em seguida, misture 10 microlitros do pacote de hemácias resultante, 171 microlitros de tampão de bicarbonato e 1049 microlitros de biotina. Solução de ligante PEG NHS e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Usando os mesmos procedimentos de lavagem antes de lavar a mistura de hemácias resultante uma vez com tampão de bicarbonato e depois duas vezes com N dois tampão de 5%.

Em seguida, dilua a nistatina em N dois tampão de 5%. Para fazer uma concentração final de 40 microlitros por mililitro, misture cinco microlitros de hemácias biotiniladas com 71,4 microlitros de solução de nistatina e incube por uma hora a zero graus Celsius. Finalmente, lave as amostras duas vezes com N dois 5% de tampão e armazene as hemácias biotiniladas com N dois 5% de tampão mais 0,5% BSA na geladeira, monte um pedaço de micropipeta de três polegadas no extrator de micropipeta.

Clique no botão de puxar para que o meio do capilar seja aquecido pela máquina e o capilar seja puxado nas duas extremidades para fazer dois capilares com pontas afiadas, que são as pipetas cruas. Em seguida, monte uma pipeta bruta no suporte da pipeta da micropipeta Forje o calor para derreter a esfera de vidro na forja. Insira a ponta da pipeta crua dentro da esfera de vidro.

Resfrie a esfera de vidro e puxe a pipeta crua para quebrá-la por fora, deixando sua ponta dentro da esfera. Repita este procedimento até que o orifício de ponta desejado seja obtido para construir a câmara celular cortada primeiro em uma lamínula de 40 milímetros por 22 milímetros por 0,2 milímetros usando um cortador de vidro em dois pedaços de 40 milímetros por 11 milímetros por 0,2 milímetros. A câmara celular é construída sobre a base de um suporte de câmara caseiro que consiste em duas peças de quadrados de metal e uma alça que os une.

Usando a graça, cole uma lamínula na parte inferior do suporte da câmara de forma que ela faça a ponte entre os dois quadrados de metal. Da mesma forma, cole a outra lamínula na parte superior, que formará uma câmara de célula de lamínula paralela. Em seguida, use a pipeta para injetar 200 microlitros de tampão experimental entre as duas lamínulas.

Certifique-se de que o buffer esteja conectado a ambas as lamínulas. Gire e agite suavemente a câmara para permitir que o tampão toque ambas as extremidades da câmara. Em seguida, injete cuidadosamente óleo mineral em ambos os lados da câmara, flanqueando a zona tampão experimental, selando assim o tampão ao ar livre.

Injete suspensões de prob. Os grânulos são bcs e alvos nas regiões superior, média e inferior da zona de amortecimento, respectivamente. Para iniciar o experimento BFP, ligue o microscópio e a fonte de luz.

Coloque a câmara no microscópio principalstage O próximo passo é instalar todas as três micropipetas do BFP. A sonda à esquerda é pegar um RBC.

O alvo à direita é agarrar a célula e o ajudante no canto inferior direito serve para pegar um cordão para instalar, use um micro injetor para preencher uma micro pipeta com tampão experimental. Retire a micropipeta do porta-pipetas e segure-a em um local mais baixo para permitir que o líquido escorra da ponta. Insira rapidamente a micropipeta na ponta do suporte, certificando-se de que nenhuma bolha de ar entre na micropipeta.

Durante a inserção, aperte o parafuso do suporte e, em seguida, monte cada porta-pipeta em seu micromanipulador correspondente. Empurre a micropipeta em direção à câmara para que suas pontas entrem na área tampão da câmara. Ajuste a posição da micropipeta e encontre-a sob o campo de visão do microscópio.

Mova-se pelo estágio do suporte da câmara para encontrar as colônias dos três elementos. Um por um, ajuste a posição da micropipeta correspondente girando os botões dos manipuladores para permitir que a ponta da micropipeta se aproxime de uma célula ou cordão, aspire a célula ou cordão. Ao ajustar a pressão dentro da micropipeta correspondente, todas as três micropipetas capturarão seus elementos correspondentes.

Percorra o palco do suporte da câmara para encontrar um espaço aberto longe das colónias dos elementos injetados onde a experiência será realizada. Mude o modo visual do microscópio para visualizar a imagem no programa de computador. Mova todos os três elementos nas pontas da pipeta para o campo de visão do programa.

Em seguida, alinhe o cordão da sonda e as hemácias e manobre cuidadosamente o cordão da sonda até o ápice da hemácia. Agora, impinga brevemente o cordão no eritrócitos e retraia suavemente, ajuste a pressão da micropipeta auxiliar para soprar suavemente o cordão para que fique colado no ápice do eritrócitos. Afaste a pipeta auxiliar e alinhe o alvo e o cordão de prob no programa.

Na janela do campo de visão, use as ferramentas do programa para medir os respectivos raios da micropipeta da sonda, as hemácias e a área de contato circular entre as hemácias e o cordão da sonda. Esses valores permitem estimar a constante de mola da hemácia pela equação listada no protocolo de texto. Depois de inserir a constante de mola RBC desejada no programa, desenhe uma linha horizontal no ápice RBC, que produzirá uma curva na janela adjacente indicando o brilho de cada pixel.

Ao longo dessa linha, arraste a linha de limite para ficar em torno da metade da profundidade da curva. Em seguida, selecione o modo de experimento desejado, ensaio de frequência de adesão de ensaio de flutuação térmica ou ensaio de grampo de força. Defina os parâmetros conforme desejado.

Clique em iniciar, que permite que o programa mova a pipeta alvo e conduza o alvo para dentro e para fora do contato com a sonda, a coleta de dados será realizada e paralela, que registra a posição do cordão pro em tempo real. Pare o programa clicando no botão parar experimento em que uma janela aparecerá. Para permitir salvar os dados adquiridos para usar a função de fluorescência do sistema BFP ligado a fonte de luz de excitação e a câmera de fluorescência, que são controladas por um programa separado.

Em seguida, selecione os parâmetros para a imagem de fluorescência, incluindo exposição de ganho e canais de excitação. Siga todos os preparativos no protocolo de experimento BFP, incluindo o alinhamento da sonda e do alvo para permitir a visualização da imagem fluorescente ao vivo da célula-alvo que é excitada por luz de excitação de 340 nanômetros ou 380 nanômetros. Use a ferramenta de seccionamento para seccionar aproximadamente a área dentro da qual a célula permanecerá durante todo o período de gravação.

Em seguida, clique simultaneamente em gravar e comece a clicar. O registro permite que uma luz de 340 nanômetros e 380 nanômetros excite alternadamente a matriz de fluorescência intracelular. Um par de imagens de fluorescência correspondentes será registrado alternadamente cerca de uma a cada segundo.

Clicar em iniciar inicia o experimento BFP para análise da interação molecular e o experimento de imagem de fluorescência para monitorar a sinalização intracelular de cálcio prossegue para analisar os dados conforme descrito no protocolo de texto. Nas curvas de dados brutos da força do tempo, a força é derivada do rastreamento da mudança de posição do cordão profissional. Em um evento sem adesão, a força retornará a zero no sinal de tempo de força reversa depois que a célula-alvo for retraída da superfície do cordão.

Por outro lado, em um evento de força de ruptura, a adesão será manifestada por uma rápida elevação da força a um nível positivo durante a retração, seguida por uma rápida queda de volta a zero. Em um evento de vida, a força positiva será apertada para realizar um platô. O comprimento do planalto é uma vida inteira.

Ao conduzir ciclos de experimentos VFP repetidos, uma curva de força versus tempo será derivada. Aqui são mostradas as imagens fluorescentes de algumas ou duas células T carregadas após a excitação por canais de luz de 340 nanômetros e 380 nanômetros. Ambas as imagens mostram contornos claros da célula, indicando que a célula foi bem corada Depois que os dados de cinética de ligação e os dados de fluorescência foram derivados de uma célula T, tanto a curva de tempo de vida cumulativa quanto a curva de nível de cálcio são apresentadas na mesma figura para encontrar a correlação entre elas.

Agora você deve ter uma boa compreensão de como realizar o experimento A-F-B-I-P. Durante este procedimento. É importante lembrar de verificar se há algum defeito na sonda de força, como o diâmetro da micropipeta, o comprimento da projeção da célula de borracha e a posição do cordão.

Tudo isso afetará a precisão da medição da força. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia mecânica molecular estudarem o mecanismo de transdução mecânica em todos os sistemas biológicos possíveis.