Name: Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Aprenda a técnica de sonda de força biomembrana fluorescente para medir simultaneamente cinética de ligação receptor-ligante e sinalização de cálcio intracelular em linfócitos T individuais. Este método avança a compreensão da ativação celular.

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A pesquisa relacionada a este artigo e o desenvolvimento da tecnologia fBFP no laboratório Zhu foram apoiados por doações do NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 e TW008753. Agradecemos a Evan Evans por inventar esta ferramenta experimental empoderadora e aos membros do laboratório Evans, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong e Ken Halvorsen, por nos ajudarem a construir o BFP. Também agradecemos a outros membros do laboratório Zhu, Fang Kong, Chenghao Ge e Kaitao Li, por suas ajudas no desenvolvimento da instrumentação.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
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<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
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<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A experiência bem sucedida fBFP implica algumas considerações críticas. Em primeiro lugar, para o cálculo de força para ser confiável, micropipeta, a RBC, eo talão sonda deve ser alinhado como perto de coaxial possível. A projecção do RBC dentro da pipeta deve ser de cerca de um diâmetro de sonda de pipeta de modo que o atrito entre a RBC e a pipeta é negligenciável. Para um RBC humano típico, o diâmetro ideal pipeta é 2,0-2,4 mm, que produz um melhor ajuste da Equação 1 17,30. Em segundo lugar, para garantir...

Célula-a-célula e célula-matriz extracelular de (ECM) adesão é mediada pela ligação entre os receptores da superfície celular, proteínas de ECM, e / ou lípidos 1. A ligação permite que as células de modo a formar uma estrutura funcional, bem como reconhecer, comunicar, e reagir ao ambiente 1-3. Ao contrário de proteínas solúveis (por exemplo, citoquinas e factores de crescimento) que se ligam de uma imagem tridimensional (3D) de fase fluida para os receptores da superfície celular, os receptores de adesão de células formar ligações com os seus ligandos através de uma das junções de hiato estreita para unir duas superfícies opostas que limitam molecular difusão numa dimensional (2D) de interface dois 4-7. Em contraste com a cinética de 3D ​​que são vulgarmente medidos por ensaios de ligação tradicionais (por exemplo, de ressonância de plasmon de superfície ou SPR), a cinética 2D têm de ser quantificado com técnicas especializadas, tais como microscopia de força atómica (AFM), 8-10, câmara de fluxo 11,12, micropipeta 13,14, ópticopinças 15 e sonda vigor biomembrana (BFP) 16-21. Mais do que simplesmente fornecendo ligação física para a coesão celular, moléculas de adesão são um dos principais componentes da maquinaria de sinalização para a célula comunique com o espaço envolvente. Tem havido um interesse crescente na compreensão de como ligando acoplamento de moléculas de adesão inicia a sinalização intracelular e como o sinal inicial é transduzida no interior da célula. Intuitivamente, propriedades de receptor-ligando de ligação pode ter um impacto que induz os sinais. No entanto, é difícil para dissecar as relações mecanicistas entre a interação extracelular e eventos de sinalização intracelular utilizando conjunto tradicional de ensaios bioquímicos por causa de suas muitas limitações, por exemplo, uma resolução temporal pobres e completa falta de resolução espacial. Métodos que permitem tanto biofísico (cinética de ligação ao receptor do ligando 2D) e (sinalização) observações bioquímicas em directo existentecélulas incluem substratos de rigidez ajustável 22, elastômero pilar matrizes 23 e dispositivos de câmara de fluxo / microfluídicos incorporados com capacidade de fluorescência 24-26. No entanto, as leituras de sinalização e de ligação ao receptor do ligando tem que ser obtido separadamente (na maioria das vezes através de métodos diferentes), o que torna difícil para dissecar as relações temporais e espaciais das características de títulos com eventos de sinalização. BFP convencional é uma espectroscopia de força ultra-sensível de alta resolução espaço-temporal 17. Ele usa uma célula de sangue vermelho flexível (RBC) na forma de um sensor de força, permitindo a medição da cinética de 2D única molécula, propriedades mecânicas e alterações conformacionais 14,16,19-21,27-29. A BFP baseado imagens fluorescentes (fBFP) correlaciona-se a cinética de ligação ligando-receptor com a sinalização celular desencadeada obrigatório-a escala única molécula. Com esta configuração, em atividades de sinalização celular situ no contexto de mechani superfíciecal estimulação foi observada em células T-27. O fBFP é versátil e pode ser utilizado para estudos de adesão celular e de sinalização mediadas por outras moléculas em outras células.

<table><tbody><tr><td>Fosfato de sódio monobásico monohidratado (NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparação de tampão fosfato</td></tr><tr><td>Anhy. Fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Preparação de tampão fosfato</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparação de tampão carbonato/bicarbonato</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Carbonato/bicarbonato preparação do tampão</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5% preparação do tampão</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5% preparação do tampão</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5% preparação do tampão</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>N2-5% preparação do tampão</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Funcionalização do grânulo</td></tr><tr><td>Biotina-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>Biotinilação de hemácias</td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>Ajuste de osmolaridade de hemácias</td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio (NH4OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>Conta de vidro silanização</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>Silanização de esferas de vidro</td></tr><tr><td>30% Peróxido de hidrogênio (H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>Silanização de esferas de vidro</td></tr><tr><td>Ácido acético (glacial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Silanização de esferas de vidro</td></tr><tr><td>3-Mercaptopropiltrimetoxissilano (MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funcionalização de esferas de vidro</td></tr><tr><td>Borosilicato</td><td>Distrilab</td> de esferas de vidro Tecnologia <td>de partículas 9002</td><td>Funcionalização de esferas de vidro</td></tr><tr><td>Streptavidin&minus; Maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funcionalização de esferas de vidro</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Funcionalização de ligantes</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>Carregamento de corante de fluorescência de cálcio intracelular</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Carregamento de corante de fluorescência de cálcio intracelular</td></tr><tr><td>Grânulos de PE Quantibrite</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>Citômetro</td></tr> de Fluxo de Quantificação <tr><td>de Densidade</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR II</td> Tubo Capilar de <td>Quantificação</td></tr> de <tr><td>Densidade 0.7-1.0 mm x 30 polegadas</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>Micropipeta fazendo Micropipeta</td></tr><tr><td>Flamejante/Marrom Extrator</td><td>sutter instrumento P-97</td><td></td><td>Micropipeta fazendo</td></tr><tr><td>Pipeta microforce</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Micropipeta para fabricação de</td></tr><tr><td>Óleo Mineral</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>Montagem da câmara</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injetor World</td><td>Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Conjunto da câmara</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD&nbsp;</td><td>309602</td><td>montagem da câmara</td></tr><tr><td>Suporte de micropipeta</td><td>Narishige</td><td>HI-7 Montagem da</td><td>câmara</td></tr><tr><td>Fabricações de peças mecânicas e adaptadores projetados em casa usando usinagem CNC.&nbsp;</td><td>Instrumento de Biofísica</td><td>Todas as peças são personalizadas de acordo com os projetos CAD.</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Microscópio (TiE invertido)</td><td>Sistema Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Objetiva CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)</td><td>Sistema Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP</td></tr><tr><td>Câmera, GE680, 640 x 480, GigE, CCD de 1/3", mono</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP sistema</td></tr><tr><td>Sonda submicrônica manual com controle remoto de alta resolução</td><td>Karl Suss</td><td>PH400</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Mesa antivibração (5' x 3')</td><td>TMC</td><td>77049089</td><td>BFP sistema</td></tr><tr><td>3D estágio de translação manual</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 3D software CAD</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Versão 2012 SP5</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Software LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td>Versão 2009</td><td>Sistema BFP, programa BFP</td></tr><tr><td>Estágio translacional piezo 3D</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Acumulador piezoelétrico linear</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>Sistema BFP</td></tr><tr><td>Software</td><td></td> Micromanager <td>Versão 1.4</td><td>Sistema fBFP, fluorescência programa de imagem</td></tr><tr><td>Dual Cam (DC-2)</td><td>Sistema fotométrico</td><td>77054724</td><td>fBFP</td></tr><tr><td>Filtro de emissão Dual Cam (T565LPXR)</td><td>Sistema fotométrico</td><td>77054725</td><td>fBFP</td></tr><tr><td>Câmera de fluorescência</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>sistema fBFP</td></tr><tr><td>Filme plástico de parafina (Parafilm)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM996</td><td>vedação de garrafas</td></tr><tr><td>Carbonato/ tampão bicarbonato (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td>8,4 g/L de carbonato de sódio (Na2CO3), 10,6 g/L de bicarbonato de sódio (NaHCO3)</td></tr><tr><td>Tampão fosfato (pH 6,5-6,8)</td><td></td><td></td><td>27,6 g/L NaFosfato monobásico (NaH2PO4 &bull; H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosfato dibásico (Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% tampão (pH 7,2)</td><td></td><td></td><td>20,77 g/L cloreto de potássio (KCl), 2,38 g/L de cloreto de sódio (NaCl), 0,13 g/L de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), 0,71 g/L anhy. fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4), 9,70 g/L de sacarose</td></tr></tbody></table>

fluorescência biomembrane força probe: quantificação simultânea de kinetics receptor de ligando e induzida encadernação-sinalização intracelular em uma única célula

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Interacções ligando-receptor de membrana medeiam muitas funções celulares. Encadernação cinética e sinalização a jusante desencadeada por essas interações moleculares são provavelmente afectado pelo ambiente em que a ligação mecânica e sinalização ocorrem. Um estudo recente demonstrou que a força mecânica pode regular o reconhecimento do antigénio pelo desencadeamento e do receptor de células T (TCR). Isso foi possível graças a uma nova tecnologia que nós desenvolvemos e fluorescência denominadas sonda vigor biomembrana (fBFP), que combina força espectroscopia única molécula com microscopia de fluorescência. Usando um glóbulo vermelho humano ultra-suave como o sensor de força sensível, uma câmera de alta velocidade e em tempo real técnicas de rastreamento de imagens, o fBFP é de ~ 1 pN (10 -12 N), a 3 nm e ~ 0,5 ms em vigor, a resolução espacial e temporal. Com o fBFP, pode-se medir com precisão cinética de ligação ligando-receptor individuais no âmbito da regulamentação vigente e cal intracelular simultaneamente imagem ligação desencadeadaCium sinalização sobre uma única célula viva. Esta nova tecnologia pode ser utilizada para estudar a interacção receptor-ligando outra membrana e sinalização em outras células sob regulação mecânica.

A técnica BFP foi iniciada pelo laboratório Evans em 1995 17. Esta ferramenta picoforce tem sido extensivamente utilizado para medir as interacções de proteínas imobilizadas em superfícies, de modo a analisar a cinética bidimensionais de moléculas de adesão que interage com os seus ligandos 16,19,20, 30, para medir a elasticidade molecular 21,29, e para determinar conformacional proteína muda 21. Para uma fBFP, um conjunto adicional de dispositivos relacionados-epi-fluorescênc...

Descrevemos uma técnica para medir simultaneamente a cinética de ligação de um único receptor-ligante regulada por força e imagens em tempo real da sinalização de cálcio em um único linfócito T.

Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

O objetivo geral deste procedimento é medir simultaneamente a ligação semelhante a receptores e observar o sinal de cálcio induzido pela ligação em uma única célula. Isso é realizado primeiramente isolando a biotina e ajustando a osmolaridade das hemácias humanas ou eritrócitos para utilizá-las como um transdutor de força ultra-sensível. O segundo passo é funcionalizar microesferas de vidro, o que inclui limpeza, dilatação e revestimento com ligante.Em seguida, os linfócitos T são isolados e incubados com o corante cálcio sensível a íons, permitindo a observação da concentração intracelular de íons cálcio. O passo final consiste em preparar as micropipetas na câmara experimental, que são especialmente necessárias para a montagem do experimento. Por fim, utiliza-se a técnica de sonda de força de biomembrana por fluorescência, ou BFP, para demonstrar a adesão de uma célula a uma microesfera revestida com ligante, medir a cinética de ligação entre receptor e ligante e, ao mesmo tempo, monitorar o nível intracelular de cálcio.Essa técnica é útil para compreender como a força mecânica é detectada por linfócitos T por meio do reconhecimento de andrógenos. Uma grande vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que o FBIP pode medir simultaneamente a cinética de ligação do receptor ao ligante e uma sinalização intracelular. As partes desafiadoras deste protocolo incluem a produção manual de micro pep com diâmetros corretos, a captura de células e abelhas com micro PEPs e a montagem da sonda de força, o que pode falhar inicialmente, embora ele não tenha podido estar presente para a demonstração deste vídeo.Coautor Arnold G., que recentemente concluiu seu doutorado no meu laboratório, contribuiu significativamente para a validação inicial da fabricação do protocolo FBAP. Obtenha oito a dez microlitros de sangue a partir de uma punção digital e adicione a um mililitro de tampão carbonato bicarbonato, agite em vórtex ou misture com pipeta e centrifugue por um minuto a 900 ×g. Descarte o sobrenadante antes de realizar a lavagem com tampão carbonato bicarbonato. Lave mais uma vez.Em seguida, misture 10 microlitros do concentrado de hemácias resultante com 171 microlitros de tampão carbonato bicarbonato e 1049 microlitros de biotina. Solução de ligante PEG NHS e incube à temperatura ambiente por 30 minutos. Utilizando o mesmo procedimento de lavagem anterior, lave a mistura de hemácias resultante uma vez com tampão carbonato bicarbonato e, em seguida, duas vezes com N dois 5% tampão.A seguir, dilua a Nistatina no tampão N2 5%. Para obter uma concentração final de 40 microlitros por mililitro, misture cinco microlitros dos eritrócitos biotinilados com 71,4 microlitros da solução de Nistatina e incube por uma hora a zero graus Celsius. Por fim, lave as amostras duas vezes com tampão N2 5% e armazene os eritrócitos biotinilados em tampão N2 5% mais 0,5% de BSA na geladeira. Fixe um pedaço de micro pipeta de três polegadas no puxador de micro pipetas.Clique no botão de tração para que o centro do capilar seja aquecido pela máquina e o capilar seja puxado nas duas extremidades, formando dois capilares com pontas afiadas, que são as micropipetas brutas. Em seguida, acople uma micropipeta bruta no suporte de micropipeta do microestilete. Aqueça no forno para derreter a esfera de vidro no forno. Insira a ponta da micropipeta bruta dentro da esfera de vidro.Resfrie a esfera de vidro e puxe a pipeta bruta para quebrá-la do lado externo, deixando sua ponta dentro da esfera. Repita este procedimento até obter a abertura de ponta desejada para construir a câmara de células, cortando primeiro uma lamínula de 40 milímetros por 22 milímetros por 0,2 milímetros com um cortador de vidro em dois pedaços de 40 milímetros por 11 milímetros por 0,2 milímetros. A câmara de células é construída sobre a base de um suporte de câmara caseiro, composto por dois quadrados de metal e um cabo que os conecta.Usando cola de montagem, fixe uma lamínula no lado inferior do suporte da câmara de forma que ela cubra os dois quadrados metálicos. Da mesma forma, cole a outra lamínula no lado superior, o que formará uma câmara de célula com lamínulas paralelas. Em seguida, use a pipeta para injetar 200 microlitros de tampão experimental entre as duas lamínulas.Certifique-se de que o tamp&atilde;o entre em contato com ambas as lam&iacute;nulas. Gire e agite suavemente a c&acirc;mara para permitir que o tamp&atilde;o toque ambas as extremidades da c&acirc;mara. Em seguida, injete cuidadosamente &oacute;leo mineral em ambos os lados da c&acirc;mara, ao lado da zona de tamp&atilde;o experimental, selando assim o tamp&atilde;o do ar ambiente.Injete suspensões de prob. As esferas são bcs e os alvos nas regiões superior, média e inferior da zona de tampão, respectivamente. Para iniciar o experimento de BFP, ligue o microscópio e a fonte de luz.Coloque a câmara sobre a platina principal do microscópio. O próximo passo é instalar as três micropipetas do BFP. A sonda à esquerda serve para agarrar um glóbulo vermelho.O alvo à direita serve para segurar a célula, e o auxiliar na parte inferior direita serve para segurar uma esfera a ser instalada; utilize um microinjetor para preencher a réguas com tampão experimental. Retire a micropipeta do suporte e segure-a em uma posição mais baixa para permitir que o líquido escorra pela ponta. Insira rapidamente a micropipeta na ponta do suporte, certificando-se de que nenhuma bolha de ar entre na micropipeta.Durante a inserção, aperte o parafuso do suporte e, em seguida, monte cada suporte de micropipeta em seu micromanipulador correspondente. Empurre a micropipeta em direção à câmara, de modo que suas pontas entrem na área do tampão da câmara. Ajuste a posição da micropipeta e localize-as no campo de visão do microscópio.Mova o estágio do suporte da câmara para localizar as colônias dos três elementos. Um por um, ajuste a posição da micropipeta correspondente girando os botões dos manipuladores para aproximar a ponta da micropipeta de uma célula ou microesfera e aspirar a célula ou microesfera. Ajustando a pressão no interior de cada micropipeta correspondente, as três micropipetas capturarão seus elementos respectivos.Mova o estágio do suporte da câmara para encontrar um espaço aberto longe das colônias dos elementos injetados, onde o experimento será realizado. Altere o modo visual do microscópio para visualizar a imagem no programa do computador. Mova os três elementos nas pontas das pipetas para dentro do campo de visão do programa.Em seguida, alinhe a esfera sonda e o eritrócito e movimente cuidadosamente a esfera sonda até o ápice do eritrócito. Agora, encoste brevemente a esfera no eritrócito e retire-a suavemente, ajustando a pressão da micropipeta auxiliar para soprar levemente a esfera para longe, de modo que ela fique colada ao ápice do eritrócito. Afaste a pipeta auxiliar e alinhe a esfera alvo e a esfera sonda no programa.No campo de visão, utilize as ferramentas do programa para medir os respectivos raios da micropipeta de sonda, da hemácia e da área de contato circular entre a hemácia e a microesfera da sonda. Esses valores permitem a estimativa da constante elástica da hemácia pela equação listada no protocolo textual. Após inserir a constante elástica desejada da hemácia no programa, trace uma linha horizontal sobre o ápice da hemácia, o que gerará uma curva na janela adjacente indicando o brilho de cada pixel.Ao longo dessa linha, arraste a linha de limiar para que fique em torno da metade da profundidade da curva. Em seguida, selecione o modo de experimento desejado: ensaio de flutuação térmica, ensaio de frequência de adesão ou ensaio de fixação de força. Ajuste os parâmetros conforme desejado.Clique em iniciar, o que permite que o programa mova a pipeta alvo e movimente o alvo para dentro e fora do contato com a sonda; nesse momento, a coleta de dados será realizada em paralelo, registrando a posição da microesfera de prova em tempo real. Pare o programa clicando no botão parar experimento, momento em que uma janela será exibida. Para permitir salvar os dados adquiridos, utilize a função de fluorescência do sistema BFP, ligando a fonte de luz de excitação e a câmera de fluorescência, que são controladas por um programa separado.Em seguida, selecione os parâmetros para a imagem de fluorescência, incluindo ganho, tempo de exposição e canais de excitação. Siga todos os preparativos no protocolo do experimento BFP, incluindo o alinhamento da sonda e do alvo para permitir a visualização em tempo real da imagem fluorescente da célula-alvo excitada por luz de excitação de 340 nanômetros ou 380 nanômetros. Use a ferramenta de secção para seccionar aproximadamente a área dentro da qual a célula permanecerá durante todo o período de gravação.Em seguida, clique simultaneamente em gravar e em iniciar cliques. A gravação permite que uma luz de 340 nanômetros e 380 nanômetros excite alternadamente o corante fluorescente intracelular. Um par de imagens de fluorescência correspondentes será alternadamente registrado a cada aproximadamente um segundo.Clicar em iniciar começa o experimento de BFP para análise de interação molecular e o experimento de imagem de fluorescência para monitorar a sinalização intracelular de cálcio, prosseguindo para analisar os dados conforme descrito no protocolo textual. Ao longo do tempo, as curvas de dados brutos de força, a força é derivada do rastreamento da mudança de posição da microesfera do pino. Em um evento sem adesão, a força retornará a zero no sinal de tempo reverso de força após a célula-alvo ser recolhida da superfície da microesfera.Por outro lado, em um evento de força de ruptura, a adesão se manifestará por uma rápida elevação da força até um nível positivo durante a retração, seguida por uma rápida queda de volta a zero. Em um evento de tempo de vida, a força positiva será mantida constante, formando uma platô. O comprimento do platô é o tempo de vida.Ao realizar repetidamente ciclos do experimento VFP, será obtida uma curva de força versus tempo. São apresentadas aqui imagens fluorescentes de algumas ou duas células T carregadas após excitação pelos canais de luz de 340 nanômetros e 380 nanômetros. Ambas as imagens mostram contornos nítidos da célula, indicando que a célula foi bem corada. Após a obtenção dos dados de cinética de ligação e dos dados de fluorescência de uma célula T, tanto a curva de tempo de vida cumulativo quanto a curva de nível de cálcio são apresentadas na mesma figura para identificar a correlação entre elas.Agora você deve ter uma boa compreensão de como realizar o experimento A-F-B-I-P. Durante este procedimento, é importante lembrar-se de verificar se há algum defeito na sonda de força, como o diâmetro da micropipeta, o comprimento da projeção celular de borracha e a posição da esfera.Tudo isso afetará a precisão da medição da força. Esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de biologia mecânica molecular estudarem o mecanismo de transdução mecânica em todos os sistemas biológicos possíveis.

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Bioengineering

Bioengenharia

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Fluorescência Biomembrane Força Probe: quantificação simultânea de Kinetics receptor de ligando e induzida Encadernação-Sinalização Intracelular em uma única célula (Vídeo) | JoVE Journal

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