在植物和绿藻的捕光配合体外重组

以下实验的总体目标是在体外重构植物或藻类的光捕获色素蛋白复合物。这是通过从菠菜叶或藻类培养物中提取色素，并在大肠杆菌中过度表达 APA prote 来实现的。作为第二步，将 APA 保护物与色素混合以获得重组的复合物。

接下来，从过量的色素中纯化重构的色素蛋白复合物，并获得未折叠的蛋白质结果，这些结果显示出重构的色素蛋白复合物和基于吸收光谱、荧光光谱和圆神论的天然色素蛋白复合物的相似光谱特征。该程序的主要优点是它允许我们获得相对大量的色素蛋白复合物，并且还可以在具有不同成分的突变型蛋白质和色素混合物中使用复合物来纵复合物，证明该程序将是实验室的研究生 Alberto na 开始从菠菜叶中提取总色素的程序。使用搅拌机将一把菠菜均质化，在 100 毫升冷研磨缓冲液中留下大约 20 克 20 秒。

通过两层直径为 20 微米的尼龙布过滤溶液，并以 1， 500 Gs 离心滤液 10 分钟。在 4 摄氏度。去除上清液，加入 1 毫升冷洗缓冲液。

用柔软的艺术家画笔重悬含有叶绿体的颗粒。重悬沉淀后，加入 50 mL 洗涤液、缓冲液并离心，以 10， 000 G 的溶液离心 10 分钟。在 4 摄氏度下，去除上清液，然后将沉淀轻轻重悬于 50 毫升洗涤缓冲液离心机中，在 4 摄氏度下以 10， 000 Gs 溶液反应 10 分钟，从此完全去除上清液。

此过程必须在黑暗中进行。为避免颜料氧化，加入大约 20 毫升用碳酸钠缓冲的 80% 丙酮以提取颜料，将溶液置于冰上 10 分钟。涡旋偶尔通过在 4 摄氏度下以 12， 000 Gs 离心 15 分钟来调色板细胞组分。

总色素提取应产生白色颗粒。将 snat 收集到分离漏斗中。加入 0.4 体积的乙醚。

用力摇晃并确保打开阀门以排出气体。加入 0.8 体积的 33 摩尔氯化钠，剧烈混合。等待大约 10 分钟，让各层分离。

顶部的醚相包含提取的颜料。去除并丢弃透明的下层相。将乙醚从分离漏斗的顶部倒入合适的玻璃容器中，以去除乙醚。

加入一勺颗粒状无水硫酸钠干燥乙醚。旋转溶液，让干燥剂从乙醚中吸收水分大约五分钟。当乙醚充分干燥时。

应该有一些自由漂浮的晶体，并且没有硫酸钠结块。将乙醚倒入新的玻璃容器中，留下硫酸钠固体，将颜料分装，然后在转速真空吸尘器中干燥，直到丙酮完全蒸发。将干燥的颜料储存在零下 80 摄氏度。

本视频未显示从菠菜中提取角蛋白，但干燥的色素也储存在零下 80 摄氏度。用于重构的光捕获复合物或 LHC 以包涵体的形式从大肠杆菌中表达和纯化。为了成功重构，色素蛋白与缓冲液使用量之间的比例至关重要。

该程序应在昏暗的光线下进行。在总共 400 微升的 te 中重悬 800 微克 LHC 包涵体。在 2 mL 离心管中，加入 400 μL 的 2 x 复溶液、缓冲液和涡旋液。

简要加入 0.6 微升 14.8 摩尔 β mar CAPTA 乙醇原液。要获得 10 毫摩尔的最终浓度，请在 98 摄氏度下加热蛋白质 1 分钟。短暂涡旋并在室温下放置 3 分钟。

通过剧烈涡旋，在 30 微升 100% 乙醇中重悬 500 微克总干燥叶绿素色素，加上 80 微克角蛋白色素。一分钟。在 4 摄氏度下以 15、800 G 的速度旋转颜料混合物约 30 秒，并确认旋转后立即没有沉淀，一边涡旋一边将颜料混合物缓慢加入冷却的蛋白质中。

小心不要太剧烈地涡旋，因为蛋白质会溢出试管的顶部。继续涡旋 5 到 10 秒，然后将试管放在湿冰上。加入 94 微升 20% 八分子、β D 杀葡萄糖剂或 og 以获得最终浓度为 2% 涡旋并在冰上保持 10 分钟，加入 90 微升 2 摩尔氯化钾，最终浓度为 150 至 200 微摩尔。

短暂涡旋并在冰上保持 20 分钟。在 4 摄氏度下以 15， 800 GS 旋转 10 分钟。将 SUP natant 转移到 10 mLL 试管中，不要干扰沉淀。

保持 natin 低温避光。按照方案文本中的说明，通过制备 1 mL 镍 SRO 柱来开始此过程。向蛋白质样品中加入 3 至 4 mL OG 缓冲液，然后将样品上样到色谱柱上。

用 5 ml OG 缓冲液冲洗色谱柱，然后用 2 ml OG 冲洗缓冲液冲洗色谱柱。用 3 ml elu 缓冲液洗脱结合的蛋白质。收集含有重组蛋白的绿色 ellu。

按照方案文本中的说明制备蔗糖梯度，从梯度顶部小心地去除，与镍 SROs 柱中提到的绿色部分的体积相同。将复溶样品缓慢加载到顶部，小心避免干扰梯度。将试管和天平放入 S SW 41 或 SW 60 水平转头中，在 4 摄氏度下以 200， 000 Gs 的超速离心机旋转 18 小时，缓慢加速并不间断地停止。

超速离心机完成后，使用镊子小心地从试管架中取出梯度。绿色条带是要收集的部分。CP 24 的吸收光谱。

将体外重构的叶绿素 AB 结合蛋白与天然复合物的光谱进行比较。相同的光谱表明几乎相同的颜料组成和组织。重构复合物的质量也可以通过荧光光谱法进行评估。

由于色素在激发时会发出不同波长的荧光，因此叶绿素 A 在 440 纳米处，叶绿素 B 在 475 纳米处，zil 在 500 纳米处。重组的 CP 24 野生型复合物的荧光发射光谱并归一化到最大值，显示从叶绿素 B 和 XANTHE 填充物到叶绿素 A 的有效能量转移，与蛋白质不协调的叶绿素 B 的存在可以通过大约 650 纳米的额外肩部来识别。相反，游离叶绿素 A 的存在会导致大约 675 纳米的额外发射。

重组和天然 CP 24 配合物在 475 纳米处的荧光发射光谱在 681 纳米处显示单个峰，表明重组配合物被正确折叠。重组的 CP 24 和天然复合体也显示出非常相似的圆形神恩光谱。可以改变对不同色素的配位很重要的单个氨基酸残基，以分析单个色素的性质或评估它们对复合物功能和稳定性的贡献。

这里显示的是野生型和突变型 CP 29 的吸收光谱。绿线显示两个图之间的差异 当 tate，该技术包括 SUSE 梯度，如果执行得当，超速离心可以在 24 小时内完成。