Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

O objetivo geral deste protocolo é purificar um complexo macromolecular nativo de qualidade adequada para estudos biofísicos. Este protocolo serve não apenas como um método para purificar um complexo, mas também como um guia detalhado para avaliar a qualidade estrutural da amostra durante a purificação. A principal vantagem deste protocolo é que ele permite purificar uma montagem nativa em condições de tampão próximas às fisiológicas de forma simples e rápida, assegurando assim a homogeneidade composicional.

Após a centrifugação das células de S.cerevisiae e a decantação do sobrenadante conforme descrito no protocolo, adicione dois mililitros de tampão de lise gelado e agite suavemente e/ou utilize uma pipeta serológica de 10 mililitros para suspender o precipitado. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros vazio mantido em gelo. Em seguida, utilize mais dois mililitros de tampão de lise gelado para lavar cada frasco de centrífuga e adicione a solução ao tubo de 50 mililitros.

Após determinar o peso úmido do pellet celular, crie um banho de nitrogênio líquido ao redor de um tubo cônico de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. Em seguida, aspire as células suspensas em uma seringa de cinco mililitros e acople uma agulha de calibre 16 à seringa. Em seguida, congele a suspensão celular passando-a pela seringa e agulha para dentro do banho a uma taxa de aproximadamente um mililitro por minuto, gerando gotículas.

Para lisar as células de levedura, comece usando nitrogênio líquido para pré-resfriar um moedor de café. Em seguida, adicione até 40 gramas de células de levedura e moa por 25 segundos, repetindo a moagem oito ou nove vezes. Recomenda-se não purificar mais de 10 litros de cultura celular de uma só vez.

Isso minimiza o tempo de purificação e garante que a integridade estrutural do complexo seja mantida. Após cada duas rodadas de moagem, adicione uma camada rasa de nitrogênio líquido ao moinho e permita que ele evapore. Para evitar que as células se aglomerem, evite o descongelamento das células usando uma espátula resfriada em nitrogênio líquido para misturá-las.

Após a lise, as células devem parecer um pó branco fino. Após verificar a lise celular e preparar o tampão de lise com PMSF, DTT e inibidores de protease de acordo com o protocolo descrito no texto, use uma espátula resfriada em nitrogênio líquido para adicionar progressivamente o pó congelado de células lisadas aos tubos de 50 mililitros contendo o tampão preparado. A cada adição, gire suavemente os tubos de 50 mililitros à temperatura ambiente para descongelar e dissolver as células, evitando a formação de bolhas.

À medida que as células se dissolvem, adicione mais pó celular. Depois que todas as células tiverem sido adicionadas, continue o descongelamento e a dissolução até que não sejam observados aglomerados celulares congelados nos tubos. Isso deve levar aproximadamente 50 minutos.

Em seguida, centrifugue o lisado celular a 25.000 × g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Após a lise celular e a centrifugação, você poderá observar uma pequena camada escura no pellet insolúvel. Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga de policarbonato e adicione 10 microlitros de PMSF 200 milimolar a cada tubo cheio.

Centrifugue as amostras a 100.000 × g e quatro graus Celsius por uma hora. Ao final da centrifugação, quatro camadas devem estar visíveis. Um pellet duro e claro contendo principalmente complexos ribossômicos; um pellet mole rico em lipídios; uma camada grande, clara e com tonalidade amarelada contendo a maioria das proteínas e complexos solúveis da célula; e uma camada superior escamosa constituída por lipídios.

Em uma câmara fria a quatro graus Celsius, utilize uma pipeta de um mililitro para remover o máximo possível da camada lipídica escamosa superior e descarte-a. Use uma pipeta serológica de 10 mililitros para recuperar a maior parte da camada amarela clara. Em seguida, utilizando uma pipeta de um mililitro para evitar perturbar as duas camadas inferiores, recupere os últimos mililitros dessa camada.

A partir de 40 gramas de pellet celular úmido, aproximadamente 48 mililitros da camada intermediária são normalmente recuperados. Após preparar a sefarose de IgG de acordo com o protocolo descrito, combine a resina de IgG com o sobrenadante da fase intermediária e duas tabletes de inibidor de protease mini por 40 gramas de células. Em seguida, coloque em um rotador a quatro graus Celsius por duas horas.

Esta é a solução em lote de IgG. Prepare duas colunas poliprep de 10 mililitros cortando as extremidades das colunas para obter uma abertura plana. Despeje 24 mililitros da suspensão de IgG em resina em forma de pasta ou solução em lote em cada coluna e deixe sedimentar por gravidade.

Isso corresponde a 200 microlitros de resina de IgG compactada. Se a sedimentação levar mais de 30 minutos, a fase intermediária pode ter sido contaminada por lipídios. Quando a sedimentação estiver completa, utilize quatro volumes sucessivos de 10 mililitros de tampão IgG D150 para lavar a coluna compactada.

Para realizar a clivagem com o vírus do mosaico do tabaco ou protease TEV na coluna, feche a extremidade inferior da coluna e adicione um mililitro do tampão IgG D150 e 100 microlitros da protease TEV. Feche a extremidade superior da coluna e, utilizando um misturador térmico a 750 RPM e 18 graus Celsius, agite por 20 minutos. Re-suspenda a resina e misture novamente por 20 minutos.

Em seguida, re-suspenda e repita a mistura de 20 minutos pela terceira vez. Retorne a coluna a quatro graus Celsius e use a gravidade para eluir o complexo proteico. Então, adicione 200 microlitros de IgG D150 para eluir o volume morto.

Após preparar a resina de afinidade para calmodulina de acordo com o protocolo descrito, adicione o tampão de ligação à calmodulina e a amostra à resina, e utilize um rotador de tubos para incubar a quatro graus Celsius durante uma hora. Prepare uma coluna poliprep de dois mililitros para cada 100 microlitros de suspensão de calmodulina, cortando a extremidade da coluna para criar uma abertura plana. O protocolo detalha volumes específicos de tampão e de residência escolhidos de modo a manter o complexo concentrado e minimizar o tempo de residência na resina.

Se o volume do cultivo for alterado, recomenda-se ajustar os volumes da resina e do tampão nas colunas de gravidade para compensar essa mudança. Empacote a coluna com no máximo 100 microlitros de suspensão de calmodulina e, por gravidade, utilize 5 mililitros de tampão de ligação de calmodulina para lavar a resina três vezes. Usando 200 microlitros de tampão de eluição de calmodulina, elua a proteína três vezes.

Em seguida, feche a base da coluna e adicione 20 microlitros de tampão de eluição, incubando por 2,5 minutos antes de remover o fechamento e permitir que a proteína seja eluída por gravidade. Feche novamente a base da coluna e adicione 200 microlitros de tampão de eluição, incubando por cinco minutos. Em seguida, desfeche a base da coluna e elua a solução.

Para a sexta e última eluição, feche a base da coluna e incube com o tampão de eluição por 10 minutos. Em seguida, desfeche e realize a eluição. Execute a análise pós-purificação e armazene as amostras de acordo com o protocolo descrito no texto.

Como mostrado aqui, uma purificação inicial TAP do complexo, seguindo um protocolo publicado, gerou um complexo que migrou como três bandas em um gel corado com prata. Várias rodadas de otimização do método TAP nos proporcionaram um complexo que migrou como uma única banda em um gel nativo, indicativo de uma montagem mais homogênea. De acordo com o resultado do gel nativo, o western blot usando um anticorpo TAP contra o complexo, purificado de acordo com o protocolo publicado, detectou proteólise da proteína marcada com TAP, SNU-71.

Modificações do método TAP reduziram significativamente a quantidade de proteólise, já que quase todas as 17 proteínas do complexo U1 snRNP foram resolvidas por SDS-PAGE e identificadas positivamente por espectrometria de massas múltipla. A microscopia eletrônica de contraste negativo mostra partículas monodispersas provenientes de uma purificação bem-sucedida após a primeira e a segunda etapas do TAP. Em contraste, nenhuma partícula do tamanho correto é observada quando a purificação não é bem-sucedida.

A qualidade do complexo final foi avaliada em um gramado de partículas purificadas, mostrado aqui, que aparecem monodispersas na imagem bruta de microscopia eletrônica com contraste negativo. Além disso, as médias das classes das partículas revelam características distintas, indicando que a amostra possivelmente é adequada para estudo estrutural. Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em 10 a 12 horas após o descongelamento do pó de células lisadas congelado.

Ao seguir este protocolo, é importante garantir que todas as soluções estejam livres de proteases e nucleases, além de trabalhar rapidamente para evitar a agregação ou dissociação do complexo. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como purificar um complexo nativo de qualidade adequada para estudo estrutural, bem como como avaliar se isso foi alcançado.