Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

O objetivo geral deste protocolo é purificar um complexo macromolecular nativo de qualidade adequada para estudos biofísicos. Este protocolo serve não apenas como uma forma de purificar um complexo, mas como um guia detalhado para avaliar a qualidade estrutural da amostra durante a purificação. A principal vantagem deste protocolo é que ele permite purificar uma montagem nativa sob condições de tampão fisiológico próximo de forma simples e rápida, de modo a garantir a homogeneidade composicional.

Após centrifugação das células de S. cerevisiae e decantação do sobrenadante de acordo com o protocolo de texto, adicionar dois mililitros de tampão de lise resfriado e agitar e / ou usar uma pipeta serelógica de 10 mililitros para suspender o pellet. Transferir a suspensão da célula para um tubo de centrifugação cónico de polipropileno vazio de 50 mililitros, mantido em gelo. Em seguida, use mais dois mililitros de tampão de lise resfriado para lavar cada frasco de centrífuga e adicione a solução ao tubo de 50 mililitros.

Depois de determinar o peso úmido do pellet celular, crie um banho de nitrogênio líquido em torno de um tubo centrífugo cônico de polipropileno de 50 mililitros. Em seguida, coloque as células suspensas em uma seringa de cinco mililitros e conecte uma agulha de calibre 16 à seringa. Em seguida, congele a suspensão celular passando-a pela seringa e agulha para o banho a uma taxa de aproximadamente um mililitro por minuto para gerar gotículas.

Para lisar as células de levedura, comece usando nitrogênio líquido para pré-resfriar um moedor de café. Em seguida, adicione até 40 gramas de células de levedura e triture por 25 segundos, repetindo a moagem oito ou nove vezes. Recomenda-se não purificar mais de 10 litros de cultura de células de uma só vez.

Isso minimiza o tempo de purificação e garante que a integridade estrutural do complexo seja mantida. Após cada duas rodadas de moagem, adicione uma camada rasa de nitrogênio líquido ao moedor e deixe-o evaporar. Para evitar que as células se aglomerem, evite que as células descongelem usando uma espátula resfriada com nitrogênio líquido para agitar as células.

Após a lise, as células devem aparecer como um pó branco fino. Depois de verificar a lise celular e preparar o tampão de lise com PMSF, DTT e inibidores de protease de acordo com o protocolo de texto, use uma espátula resfriada com nitrogênio líquido para colher incrementalmente o pó de células lisado congelado nos tubos preparados de 50 mililitros do tampão. Com cada incremento adicionado, gire suavemente os tubos de 50 mililitros em temperatura ambiente para descongelar e dissolver as células e evitar a formação de bolhas.

À medida que as células se dissolvem, adicione mais pó celular. Depois que todas as células forem adicionadas, continue descongelando e dissolvendo as células até que não haja aglomerados de células congeladas observadas nos tubos. Isso deve levar aproximadamente 50 minutos.

Em seguida, centrifugue o lisado celular a 25.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos. Uma vez que as células são lisadas e após a centrifugação, você pode observar uma pequena camada escura no pellet insolúvel. Transfira o sobrenadante para tubos de ultracentrífuga de policarbonato e adicione 10 microlitros de PMSF 200 milimolares a cada tubo cheio.

Centrifugar as amostras a 100 000 vezes g e quatro graus Celsius durante uma hora. No final da rotação, quatro camadas devem estar visíveis. Um pellet duro e transparente contendo principalmente complexos ribossômicos; um pellet rico em lipídios macios; uma camada grande, clara e tingida de amarelo contendo a maioria das proteínas e complexos solúveis da célula; e uma camada superior escamosa composta por lipídios.

Em uma câmara fria a quatro graus Celsius, use uma pipeta de um mililitro para remover o máximo possível da camada lipídica escamosa superior e descarte. Use uma pipeta sorológica de 10 mililitros para recuperar a maior parte da camada amarela clara. Em seguida, usando uma pipeta de um mililitro para evitar perturbar as duas camadas inferiores, recupere os últimos mililitros dessa camada.

A partir de 40 gramas de pellet de célula úmida, aproximadamente 48 mililitros da camada intermediária são normalmente recuperados. Depois de preparar a sepharose IgG de acordo com o protocolo de texto, combine a resina IGG com o sobrenadante de fase intermediária e dois comprimidos inibidores de mini protease por 40 gramas de células. Em seguida, coloque em um rotador a quatro graus Celsius por duas horas.

Esta é a solução em lote de IgG. Prepare duas colunas de polipreparação de 10 mililitros cortando as extremidades das colunas para produzir uma abertura plana. Despeje os 24 mililitros de pasta de resina IgG suspensa ou solução em lote em cada coluna e deixe sedimentar por gravidade.

Isso corresponde a 200 microlitros de resina IgG embalada. Se a sedimentação demorar mais de 30 minutos, a fase intermediária pode ter sido contaminada por lipídios. Quando a sedimentação estiver completa, use quatro volumes sucessivos de 10 mililitros de tampão IgG D150 para lavar a coluna cheia.

Para realizar a clivagem da protease do vírus da corrosão do tabaco ou do TEV na coluna, sele o fundo da coluna e adicione um mililitro de tampão IgG D150 e 100 microlitros de protease TEV. Sele o topo da coluna e usando um misturador térmico a 750 RPM e 18 graus Celsius, misture por 20 minutos. Ressuspenda a resina e misture novamente por 20 minutos.

Em seguida, suspenda novamente e repita a mistura de 20 minutos uma terceira vez. Retorne a coluna a quatro graus Celsius e use a gravidade para eluir o complexo de proteínas. Em seguida, adicione 200 microlitros de IgG D150 para eluir o volume morto.

Depois de preparar a resina de afinidade de calmodulina de acordo com o protocolo de texto, adicione o tampão de ligação de calmodulina e a amostra à resina e use um rotador de tubo para incubar a quatro graus Celsius por uma hora. Prepare uma coluna de polipreparação de dois mililitros por 100 microlitros de pasta de calmodulina cortando a extremidade da coluna para criar uma abertura plana. O protocolo detalha volumes específicos de buffer e residência escolhidos para manter o complexo concentrado e minimizar o tempo de residência da resina.

Se o volume cultural for alterado, é recomendável alterar os volumes de resina e buffer das colunas de gravidade para levar em conta a alteração. Embale a coluna com no máximo 100 microlitros de pasta de calmodulina e, por gravidade, use 5 mililitros de tampão de ligação de calmodulina para lavar a resina três vezes. Usando 200 microlitros de tampão de eluição de calmodulina, elua a proteína três vezes.

Em seguida, sele o fundo da coluna e adicione 20 microlitros de tampão de eluição e incube por 2,5 minutos antes de liberar o selo e permitir que a proteína elua por gravidade. Sele o fundo da coluna novamente e adicione 200 microlitros de tampão de eluição antes de incubar por cinco minutos. Em seguida, abra o fundo da coluna e elui a solução.

Para a sexta e última eluição, feche o fundo da coluna e incube com tampão de eluição durante 10 minutos. Em seguida, abra o selo e elua. Realize análises pós-purificação e armazene amostras de acordo com o protocolo de texto.

Como mostrado aqui, uma purificação inicial por TAP do complexo seguindo um protocolo publicado produziu um complexo que migrou como três bandas em um gel corado com prata. Várias rodadas de otimização do método TAP nos dão um complexo que migrou como uma única banda em um gel nativo, indicativo de uma montagem mais homogênea. Consistente com o resultado do gel nativo, o western blotting usando um anticorpo TAP contra o complexo, purificado de acordo com o protocolo publicado, detectou proteólise da proteína marcada com TAP, SNU-71.

Modificações no método TAP reduziram significativamente a quantidade de proteólise, já que quase todas as 17 proteínas do complexo U1 snRNP foram resolvidas por SDS-PAGE e identificadas positivamente por espectrometria de massas múltiplas. A microscopia eletrônica de coloração negativa mostra partículas monodispersas de uma purificação bem-sucedida após a primeira e a segunda etapas do TAP. Em contraste, nenhuma partícula do tamanho correto é observada quando a purificação não é bem-sucedida.

A qualidade final do complexo foi avaliada em um gramado de partículas purificadas, mostradas aqui, que aparecem monodispersas na imagem bruta EM da coloração negativa. Além disso, as médias de classe das partículas revelam características distintas, indicando que a amostra é possivelmente adequada para estudo estrutural. Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído dentro de 10 a 12 horas após o descongelamento do pó de células lisadas congelado.

Ao seguir este protocolo, é importante garantir que todas as soluções estejam livres de proteases e nucleases, bem como trabalhar rapidamente para evitar a agregação ou dissociação do complexo. Depois de assistir a este vídeo, você deve entender como purificar um complexo nativo de qualidade adequada para o estudo estrutural, bem como avaliar se isso foi alcançado.