Name: Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprenda a purificar complexos macromoleculares nativos de S. cerevisiae usando o método de purificação por afinidade em tandem (TAP). Este protocolo detalhado permite avaliar a qualidade estrutural das amostras durante o processo, garantindo homogeneidade composicional para estudos biofísicos.

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Os autores agradecem o apoio e conselhos de Nikolaus Grigorieff. Agradecemos a Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu e Mike Rigney pelas discussões úteis e orientação de EM. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, Prêmio nº 1157892. A instalação Brandeis EM é apoiada pelo National Institutes of Health grant P01 GM62580.

Nota: O seguinte protocolo foi concebido para a purificação de um complexo a partir de 4 L de cultura de células, aproximadamente 40 g de peso molhado de células. Uma vez preparada, todos os tampões devem ser armazenadas a 4 ° C e utilizadas dentro de um mês da sua preparação. Redutores inibidores de protease e agente são apenas adicionados aos buffers imediatamente antes da utilização. 1. Preparação do extracto celular total para purificação de afinidade em tandem <ol><li> Crescimento de S. células cerevisiae <ol><li> Streak a TAP desejado marcado S. cerevisiae do armazenamento (-80 ° C) em uma dextrose de levedura peptona (YPD) placa. Incubar durante 3 - 5 dias (30 ° C), até que as células fúngicas aparecem em branco e fofo. </li><li> Inocular uma sequência de cerca de 2 mm 2 das células frescas de placa em 10 ml de meio YPD em um tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico. Agitar o tubo a 180 revoluções por minuto (rpm) durante a noite (30m ° C). </li><li> Inocular 2 ml da sobrecultura noite, por litro de meio YPD em um L Erlenmeyer 2 ou frasco cónico. Agitar a 180 rpm (30 ° C). Monitorizar o crescimento celular a uma densidade óptica de 600 nm (OD 600) até a fase log tardia, OD 600 entre 1,8 e 2, tipicamente 20-24 horas. </li></ol></li><li> Colheita S. células cerevisiae <ol><li> Células colheita por centrifugação a 5400 xg durante 15 minutos (4 ° C). </li><li> decantar o sobrenadante rapidamente e manter as células a 4 ° C ou sobre gelo. </li><li> Suspender cada litro de pelete de células com 2 ml refrigeradas tampão de lise (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 300 mM; KCl 10 mM; EDTA 0,2 mM, pH 8,0; imidazole 5 mM, pH 8,0; 10% de glicerol; 0,1% v de NP-40 / v). Suspender as células por agitação e / ou de repetição pipetagem usando uma pipeta de 10 ml sorológica. Nota: A importância de NP-40 no que se refere à qualidade do complexo e a análise pós-purificação é discutido abaixo. </li><li> Transferir a suspensão de células para um vazio de 50 ml de polipropileno cónico tubo de centrífuga KEPT no gelo. Lava-se cada frasco de centrífuga com um adicional de 2 ml de tampão de lise arrefecida e adicionar a suspensão de células no tubo de 50 ml. </li><li> Determinar o peso húmido do sedimento celular por pesagem do tubo e subtraindo o peso do tubo vazio, bem como o tampão de lise adicionado. Nota: Um litro de cultura de células tendo uma densidade óptica de 1,8 a 600 é de aproximadamente 10 g. </li><li> Criar um banho de azoto líquido num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno cónico. Desenhar células em suspensão em uma seringa de 5 ml. Conectar uma agulha G 16 da seringa. Congelar a suspensão de células por passagem através de seringa / agulha para gerar células de &quot;gotículas&quot;. Velocidade de congelação deve ser de aproximadamente 1 min / mL. </li><li> Armazenar gotículas de células congeladas (-80 ° C) ou proceder à lise. </li></ol></li><li> Lise Células e Lysate Esclarecimento <ol><li> Lyse as células de levedura usando um moedor de café. células Lyse oito a nove vezes com 25 segundos de moagem rajadas, agitando o cmoedor offee. Antes de usar, pré-resfriar o moedor de café com nitrogênio líquido. De dois em dois ciclos de moagem, adicionar uma camada superficial de azoto líquido para o moinho e permitir que ela se evapore. </li><li> Mexa com uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado como necessário para manter as células de aglomeração. Tome cuidado para evitar o descongelamento das células, o que pode resultar em agregação celular. As células devem aparecer como um pó branco fino após a lise. Uma pelete de células máximo de 4 L de cultura de levedura (~ 40 g) pode ser moído de cada vez. Nota: Observações sobre método de lise são discutidas abaixo. </li><li> Avaliar o grau de lise de células utilizando um hemocitómetro ou método de contagem celular alternativa. Para fornecer uma análise adequada, tomar as seguintes amostras: (1) antes de lise; (2) após quatro rondas de lise; e (3) após a lise. Para verificar essas amostras, tomar uma pequena quantidade de células com um nitrogênio espátula refrigerados líquido e coloque em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Uma vez que as células são descongeladas, de pipeta 5 ul de célulase misturar com 495 ul de água. Se 40 - é observada 60% de lise de células, avance para o próximo passo no protocolo. Nota: Observações relativas efeito de longos períodos de lise são discutidos abaixo. </li><li> Uma vez lise adequada é observada, loja lisadas células (-80 ° C) ou prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Preparar dois tubos de 50 ml de centrífuga de polipropileno cónico de 15 ml, cada um com um tampão de lise, incluindo 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF), 1 mM de ditiotreitol (DTT), e um cocktail comercialmente disponíveis de inibidores de protease. Nota: Se a proteólise é observada significativa, considerar o uso de uma estirpe deficiente em protease. </li><li> Use uma espátula de nitrogênio líquido refrigerado para colher o pó de células lisadas congelada nos preparados tubos de 50 ml. Adicionar o pó celular / sólido incrementalmente ao tampão de lise, contendo tanto um redutor e inibidor (es) da protease. </li><li> Rodar os tubos de 50 ml suavemente à TA, a fim de descongelar / dissolver as células, mas também para evitar a formação de bolhas. UMAé o pó celular / sólido dissolve-se, adicione célula adicional sólido / pó. </li><li> Encher cada um dos dois tubos de 50 ml até que cada um tem aproximadamente 20 g de células ou todas as células adicionadas. Continuar a descongelação / dissolve-se até que não existam aglomerados de células congeladas observadas nos tubos de 50 ml. Isso deve levar cerca de 50 min. </li><li> Centrifuga-se o ligado de células em suspensão durante 20 minutos a 25000 xg (4 ° C). Bem células lisadas podem apresentar uma pequena quantidade de precipitado negro. </li><li> Transferir os 50 ml de sobrenadante para policarbonato tubos ultra-centrifugação (26,3 ml tubos usados) e adicionar 10 ul PMSF 200 mM a cada tubo cheio. </li><li> Centrifugar durante 1 h a 100000 xg (4 ° C). Quatro camadas deve ser visível, de baixo para cima: (1) um sedimento duro clara, contendo complexos ribossomais; (2) um sedimento macio ricos em lípidos; (3) uma grande camada amarelo-clara tingido contendo a maioria de proteínas e complexos solúveis da célula; e (4) uma camada de topo &#39;escamosa&#39; que consiste em lípidos. </li><li> Executar todas as spassos ubsequent em uma sala fria (4 ° C). Remover o máximo da camada lipídica topo &#39;escamosa &quot;quanto possível, utilizando uma pipeta de 1 mL e rejeitar. Usar uma pipeta de 10 ml serológico para recuperar a maior parte da camada amarelo, claro. </li><li> Recuperar os últimos ml desta camada usando uma pipeta de 1 ml para evitar perturbar as duas camadas inferiores. A partir de 40 g de sedimento celular húmido, cerca de 48 ml da camada do meio é tipicamente recuperado e 8 ml de camada lipídica removido / descartado. Nota: A purificação em coluna de fluxo é muito dificultado pela presença de lípidos, que também pode reduzir a qualidade do complexo, discutido abaixo. </li></ol></li></ol> 2. Coluna etapa de purificação 1: IgG Cromatografia <ol><li> Resina de Equilíbrio e encadernação <ol><li> Prepare um 300 ml IgG Sepharose suspensão por 40 g de sedimento celular. Cortar a extremidade de uma pipeta de 1 ml de ponta para facilitar a pipetagem da lama. Lavagem / equilibrar a resina de IgG três vezes, cada vez com 5 ml IgGD150 BuffeR (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl a 150 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 0,1% v / v de NP-40; 1 mM de DTT; um comprimido de inibidor de protease por 50 ml de volume). <ol><li> Centrifugação para sedimentar a 160 xg (4 ° C) entre as lavagens e remover o sobrenadante. </li></ol></li><li> Girar a resina de IgG com o sobrenadante da fase de meio e dois comprimidos de inibidor de protease de mini por 40 g de células, utilizando um rotor adequado, durante 2 h (4 ° C). Esta é a solução do lote de IgG. </li><li> Prepare duas colunas de 10 ml de poli-prep para utilização, cortando a extremidade da coluna para produzir um corte plano. Para acelerar a embalagem e lavagem da coluna de fluxo por gravidade, carregar um máximo de 200 ul de IgG de resina embalada ou ~ 25 ml da solução de lote de IgG por 10 ml de coluna. </li><li> Verter a solução do lote de IgG à coluna e permitir a sedimentar por gravidade. Se a sedimentação demora mais do que 30 minutos, não mais provável era a contaminação lipídica ao recuperar a fase intermédia do centrifugador tUBEs. </li><li> Lava-se a coluna empacotada com quatro sucessivos volumes de 10 ml de Tampão IgGD150. </li></ol></li><li> Por clivagem de TEV Coluna <ol><li> Selar o fundo da coluna e adicionar 1 ml de tampão IgGD150 e 100 ul de protease de TEV (0,6 mg / ml, variante mutante S219V de TEV produzido internamente). Fecha-se o topo da coluna e mistura-se durante 20 min (18 ° C) usando um misturador térmico, agitando a 750 rpm. Ressuspender a resina e misturar outra vez durante 20 minutos, repetir uma vez mais para um total de 1 hora de incubação. Nota: É crítico para manter o tempo de incubação para um mínimo. </li><li> Retorno da coluna a 4 ° C e elui-se a proteína / complexo por gravidade. Eluir o volume morto com um adicional de 200 mL de tampão IgGD150. </li></ol></li></ol> 3. coluna de purificação Passo 2: Cromatografia de Afinidade A calmodulina <ol><li> Resina de Equilíbrio e encadernação <ol><li> Preparar 200 ul de resina de afinidade com calmodulina por 40 g de célulassedimentar. Lava-se a resina três vezes, cada vez com 5 mL de calmodulina Tampão de Ligação (Tris 10 mM-HCl, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 2 mM de CaCl2; 0,1 % v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol), centrifugação a 160 xg (4 ° C) para sedimentar para cada lavagem. </li><li> Para cada 1 ml de eluato IgG, adicionar 3 volumes de calmodulina tampão de ligação. Para manter constante o nível de cálcio, adicionar CaCl2 e β-mercaptoetanol para explicar a falta destes componentes na eluição de IgG. As concentrações finais devem ser CaCl2 2 mM e mM β-mercaptoetanol 10. </li><li> Adicionar a amostra para a resina de calmodulina e ligam-se durante 1 hora (4 ° C) usando um rotor tubo. </li></ol></li><li> Embalagens e eluição, da calmodulina Resina <ol><li> Prepara-se uma coluna de 2 ml de poli-prep por 100 ul de suspensão de calmodulina, cortando a extremidade da coluna para criar uma abertura plana. Carregue não mais do que 100 ï¿½ calmodulina suspensão por column para minimizar a quantidade de resina a amostra entra em contacto durante a eluição com. </li><li> Encher a coluna pela força da gravidade e lava-se a resina na coluna três vezes com 5 mL de calmodulina Binding Buffer. </li><li> Elui-se a proteína com a adição de 200 uL calmodulina eluição tampão (Tris-HCl a 10, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8,0; EGTA 4 mM, pH 8,0; 0,08% v / v de NP-40; 10 mM β-mercaptoetanol). Repita seis vezes a adição de 200 ul de tampão de eluição A calmodulina. </li><li> Para eluições 1 a 3, aplicam-se o volume para a coluna e recolher o eluato imediatamente. Para a eluição 4, vedar a parte inferior da coluna e incuba-se com tampão de eluição durante 2,5 min e, em seguida, desselar e deixa-se eluir por gravidade. Para a eluição 5, incubar durante 5 min e, em seguida, desselar e eluir. Para a eluição 6, incubar durante 10 minutos e, em seguida, desselar e eluir. Nota: A integridade do complexo pode variar entre eluiï¿½es / frações (ver secção resultados representante) &lt;./ Li&gt; <li> Dialisar eluições 2 a 6 individualmente durante a noite utilizando um método de diálise micro apropriado. Dialisar as fracções contra tampão de diálise (Tris-HCl a 10, pH 8,0; NaCl 150 mM; KCl 10 mM; MgCl2 1 mM; imidazole 5 mM, pH 8; 10 mM β-mercaptoetanol). Nota: O NP-40 não passam sensivelmente, se de todo, através da membrana de diálise. </li></ol></li></ol> 4. As análises pós-purificação para avaliar a qualidade do Complexo <ol><li> Native Gel e prata Coloração <ol><li> Prepara-se uma 4 - gel nativo prefabricados de 16% para análise do complexo de acordo com as instruções do fabricante. Usar um padrão de proteína de peso molecular apropriado e de carga de 15 ul de cada uma das fracções de calmodulina de eluição / dialisadas no gel. </li><li> Electroforese o gel a 150 V durante cerca de 3 h (4 ° C). </li><li> Silver Stain o gel para avaliar a qualidade de cada uma das seis eluições. Como alternativa, use comercial igualmente sensíveismancha fluorescente (s). Nesta fase, a concentração do complexo é muito provavelmente abaixo do nível de detecção por coloração com azul de Coomassie. </li></ol></li><li> Métodos de análise adicional do gel <ol><li> Para detectar a proteína por transferência de Western, resolver o complexo de SDS ou por PAGE nativa e, em seguida sondar o gel para o epitopo calmodulina Binding Peptide (CBP), utilizando um anticorpo etiqueta TAP de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Usando um corante fluorescente específico (s), confirmar a presença e a integridade de proteínas e / ou ácido nucleico num complexo da torneira purificada. Tome cuidado para que nenhuma sobreposição espectral é detectada entre estas manchas. </li></ol></li><li> Negativo Visualization Stain Electron Microscopy <ol><li> Use grades de carbono contínuas glow-descarregada a -15 mA durante 30 segundos, no prazo de 30 min de aplicação complexa. </li><li> Aplicar 3 ul de TAP complexo purificado (tipicamente a uma concentração de 1 nM) a grade. Incubar durante um minuto. blot fROM O lado da rede para remover o excesso de tampão. </li><li> Lavar duas vezes com 20 gotas de ua desionizada. blot lado entre as lavagens. </li><li> Aplicar grade para um 50 pi queda coloração negativa e incubar durante um min. A coloração com acetato de uranilo (2%) ou formato de uranilo (0,75%) é recomendado. Cuidado: sais e soluções uranyl são fracamente radioativa e contêm metais pesados. Estes devem ser manuseados com cuidado e todo o material que entra em contato com estas soluções devem ser eliminados de seguir as orientações de resíduos recomendados institucionais. </li><li> Aplicar grade para um 50 pi queda coloração negativa fresco, sem borrar. Incubar durante um minuto, em seguida, blot lado, e, finalmente, o ar seco e visualizar. </li></ol></li><li> Cryo Electron Microscopy (crio-EM) Visualization <ol><li> Execute crio-EM com a TAP purificado complexo, apesar de otimização pode ser necessário, de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: A presença de detergente em concentrações elevadas MAy impedir o progresso e é discutido abaixo. </li></ol></li></ol> 5. armazenamento Complex <ol><li> Preparando Complexo de Armazenamento <ol><li> Concentra-se o complexo, se necessário, utilizando-se um filtro centrífugo com um peso molecular de corte adequado para o complexo. Girar a 14.000 xg por 1 min incrementos até a concentração desejada seja atingida. Nota: concentração de NP-40 aumentarão em concentração durante a concentração, uma vez que não passa através da membrana do filtro, nem a diálise. </li><li> Flash congelar o complexo em 30 mL alíquotas em azoto líquido ou gelo seco arrefecido banho de etanol e, em seguida, armazena-se a -80 ° C. </li></ol></li><li> Opcional remoção pós-purificação de detergente </li></ol> Nota: A presença de um detergente tal como NP-40 e com uma concentração acima da sua concentração crítica de micelas podem impedir ou inibir o progresso para algumas aplicações. As consequências de sua remoção do protocol, bem como a substituição com outros aditivos ou co-solventes são discutidos abaixo. Se não NP-40 for desejado, uma opção é a utilização de uma aplicação comercial para a remoção de, por exemplo, Bio-beads. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pré-equilibrar disponíveis comercialmente de detergente em grânulos absorventes tampão de diálise. Misture cinco pérolas por 30 ul de complexo (geralmente em concentração de 10 nM). </li><li> Incubar esferas equilibradas do Passo 5.2.1 com TAP complexo purificado durante 15 minutos em gelo. Use complexo dentro de algumas horas após a remoção do detergente. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

O método TAP utiliza duas marcas que equilibram a necessidade de rigorosa e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. Além disso, a TAP indivíduo com etiquetas ORFs estão disponíveis a partir de uma fonte comercial, de modo que pode obter-se qualquer estirpe de levedura com uma proteína etiquetada po...

Muitos processos celulares importantes são realizadas por grandes complexos de proteínas e de ARN-proteína 1. Um gargalo significativo para a realização de estudos biofísicos e estruturais destes complexos é a sua obtenção de uma qualidade adequada (isto é, a homogeneidade) e numa concentração adequada. Isolamento de um complexo a partir de uma fonte nativa tem muitas vantagens, incluindo a retenção de modificações pós-transcricionais e / ou traducionais relevantes de subunidades e segurar a montagem complexa adequada. No entanto, grandes complexos celulares estão frequentemente presentes em uma célula de um número de cópias baixo e a purificação deve ser altamente eficiente e ocorrem sob condições fisiológicas próximo para assegurar a integridade do complexo é mantido. Purificando um complexo de uma fonte eucariótica é particularmente desafiador e pode ser financeiramente proibitivo. Assim, as estratégias ou métodos que sejam eficientes e produzem um complexo homogênea são altamente desejado. Uma estratégia que tem sidosucesso na purificação complexos nativos de células eucarióticas para sua caracterização inicial é o Tandem Affinity Purification (TAP) Método 2,3. O método TAP foi inicialmente concebido para purificar a proteína nativa a partir da levedura de brotamento (S. cerevisiae) em complexo com a interação dos fatores (s) 2. O método utilizado TAP duas etiquetas, cada etiqueta fundidos em conjunto para a mesma sequência do gene que codifica a proteína. As etiquetas foram seleccionados de forma a equilibrar a necessidade de apertado e selectiva de ligação a uma resina de afinidade com um desejo de manter perto de condições de solução fisiológica. Este equilíbrio serve para preservar a interação estável (s) da proteína marcada com a interação dos fatores (s) para a caracterização pós-purificação. A etiqueta TAP genomicamente incorporada foi colocada na extremidade (C-terminal) de um gene de codificação da proteína e consistia de uma sequência de codificação para um Calmodulin Binding Peptide (CBP) seguido de Proteína A - uma adição de pouco mais de 20 kDa ao etiquetado proteína. CBP é curto, 26 aminoácidos, e reconhecido pela ~ 17 kDa de proteína calmodulina (CaM), na presença de cálcio com um K D na ordem de 10 -9 M 4. A Proteína A etiqueta é maior, que consiste de duas repetições de 58 resíduos com um curto ligante entre as repetições. Cada repetição ácido amino 58 é reconhecido pela imunoglobulina G (IgG) com um K D ~ 10 -8 M 5. Entre estas duas etiquetas foi incorporado um local de reconhecimento para a protease de TEV, uma endopeptidase do Vírus do tabaco Etch 6,7. Tal como ilustrado na Figura 1, no primeiro passo de afinidade do método da TAP etiquetado proteína é ligado a uma resina de IgG através da Proteína A. A proteína é eluída com etiquetas por clivagem em coluna após a adição de protease de TEV, Site-especificamente a clivagem entre as duas marcas. Este é um passo necessário como a interacção de IgG e proteína A é muito forte e pode apenas ser adequadamente perturbado sob condições desnaturantes solução. Na falta de um Protein uma etiqueta, a proteína está ligada a resina CaM na presença de cálcio e eluído a partir desta resina com a adição de EGTA quelante de iões metálicos (ácido tetracético de etileno-glicol) (Figura 1). Logo após a introdução do método da TAP, que foi utilizado num estudo em larga escala para gerar um &quot;mapa&quot; de interacções complexas em S. cerevisiae 8. É importante notar, como uma consequência deste esforço uma biblioteca inteira Quadro levedura-TAP Tagged de leitura aberta (ORF), bem como a TAP indivíduo com etiquetas ORFs 9 estão disponíveis a partir de uma fonte comercial. Assim, pode-se obter qualquer cepa de levedura com uma proteína marcadas para qualquer complexo levedura. O método TAP também estimulou modificações ou variações da etiqueta TAP, incluindo: a sua utilização para a purificação de complexos de outros eucariotas, bem como as células bacterianas 10,11; a criação de uma &quot;tag dividido&quot;, em que a proteína A e PFC são colocados em diferentes proteínas 12; eo taGS alterado, de modo a acomodar a necessidade do investigador, tais como a sensibilidade do complexo de Ca 2+ ou de EGTA 13. Recentes avanços em ambos instrumentação e metodologia levaram a avanços significativos na aplicação de microscopia eletrônica (EM) para determinação da estrutura, que levaram à alta, perto imagens de resolução atômicas de complexos macromoleculares 14. A resolução de um complexo obtido por EM, no entanto, permanece depende da qualidade do complexo em estudo. Este estudo utilizou a abordagem tag TAP para purificar de S. cerevisiae U1 snRNP, um baixo número de cópias do complexo ribonucleoproteico 18 da subunidade (~ 0,8 MDA) que faz parte do spliceossoma 15,16. Um número de passos foram tomados para purificar este complexo de tal forma que é homogénea e de uma concentração adequada. Os potenciais problemas encontrados em várias fases da purificação são descritos e estratégias para superar feita challEnges destaque. Com cuidado avaliar e optimizar etapas na purificação, o U1 snRNP purificado é de uma qualidade e em quantidade adequada para coloração negativa e eletrônica crio microscopia (crio-EM) estudos. Um método TAP protocolo optimizado para a purificação de complexos de nativas para estudos estruturais é aqui descrito.

<table><tbody><tr><td>Cepa marcada com S. cerevisiae TAP</td><td>Open Biosystems</td><td>YSC1177</td><td>Esta é a cepa de levedura primária usada para desenvolver o protocolo TAP. Seu fundo é S288C: ATCC 201388: MATa, his3&Delta; 1, leu2&Delta; 0, met15&Delta; 0, ura3&Delta; 0, SNU71::TAP::HIS3MX6</td></tr><tr><td>Moedor de café</td><td>Mr. Coffee</td><td>IDS77</td><td>Usado para hemocitômetro de lise celular</td></tr><tr><td>, Bright Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td>Usado para avaliar a lise celular</td></tr><tr><td>JA 9.100 rotor de centrífuga&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Usado para colher as células de levedura</td></tr><tr><td>JA 20 rotor de centrífuga de ângulo fixo</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Usado para limpar o extrato celular de material celular não solúvel</td></tr><tr><td>Ti 60 rotor de centrífuga de ângulo fixo</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Usado para limpar ainda mais o extrato de célula solúvel</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>R5355</td><td>Agitador controlado por temperatura</td></tr><tr><td>Sistema de gel Novex</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina IgG</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0969-01</td><td>Sepharose 6</td></tr><tr><td>resina Calmodulin</td> de fluxo rápido <td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>214303</td><td>Resina de afinidade</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease, mini comprimidos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>589297</td><td>Mini comprimidos completos ultra sem EDTA</td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease, comprimidos grandes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892953</td><td>comprimidos completos ultra livres de EDTA</td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetanossulfonil (PMSF)</td><td></td><td></td><td>Dissolvido em isopropanol</td></tr><tr><td>2 ml Coluna Bio-spin</td><td>Bio-Rad Laboratórios, Inc.</td><td>7326008</td><td>Usado para embalar e lavar a resina Calmodulin</td></tr><tr><td>10 ml poly-prep column</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>7311550</td><td>Usado para embalar e lavar a resina IgG</td></tr><tr><td>Pré-moldada nativa PAGE Bis-Tris géis</td><td>Life Technologies</td><td>BN1002</td><td>Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% de géis de poliacrilamida pré-moldados</td></tr><tr><td>Padrão de proteína NativeMark</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC0725</td><td>Padrão de proteína não corada usado para PAGE nativo. Carga 7.5 &mu; l para um gel manchado de prata e 5 &mu; l para um gel manchado com rubi SYPRO</td></tr><tr><td>Pré-moldado SDS PAGE Bis-Tris géis</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td>Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% de géis de poliacrilamida pré-moldados&nbsp;</td></tr><tr><td>Padrão de proteína PageRuler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26614</td><td>Padrão de proteína não corada usado para Western blotting</td></tr><tr><td>SDS running buffer</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td>1x NuPAGE MOPS SDS Buffer</td></tr><tr><td>TAP anticorpo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAB1001</td><td>Anticorpo primário contra etiqueta CBP</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31341</td><td>Fosfatase alcalina anti-coelho conjugada</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>de cabra Thermo Fisher Scientific</td><td>34042</td><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitro azul tetrazólio&nbsp;</td></tr><tr><td>Unidades de diálise</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88401</td><td>Slide-A-Lyzer mini unidades de diálise</td></tr><tr><td>Unidades de filtro centrífugo, 100kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC5100008</td><td>Amicon Unidade de filtro centrífugo Ultra-0.5 com membrana Ultracel-100</td></tr><tr><td>Grânulos absorventes de detergente</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc.</td><td>1523920</td><td>Bio-bead SM-2 absorventes</td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-7564</td><td>Corante fluorescente para coloração de ácido nucleico, ao detectar com SYPRO Ruby presente, use comprimento de onda de excitação de 488 nm e comprimento de onda de emissão de 532 nm</td></tr><tr><td>SYPRO</td><td>Ruby Molecular Probes</td><td>S-12000</td><td>Corante fluorescente para coloração de proteínas, ao detectar com SYBR Green II presente, use comprimento de onda de excitação de 457 nm e comprimento de onda de emissão de 670 nm</td></tr><tr><td>Grades de cobre</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>G400-CP</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação de native complexos de estudo estrutural usando um método tag tandem affinity

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

abordagens de purificação por afinidade foram bem sucedidos em isolar complexos nativas para a caracterização proteômica. heterogeneidade estrutural e um grau de heterogeneidade de composição de um complexo não costumam impedir o progresso na realização de tais estudos. Em contraste, um complexo destinado a caracterização estrutural deve ser purificado num estado que é tanto em termos de composição e estruturalmente homogénea, bem como a uma concentração mais elevada do que o necessário para proteómica. Recentemente, tem havido avanços significativos na aplicação da microscopia de electrões para a determinação da estrutura de grandes complexos macromoleculares. Isso tem aumentado o interesse em abordagens para purificar complexos nativas de qualidade e quantidade suficiente para a determinação estrutural por microscopia eletrônica. O método Tandem Affinity Purification (TAP) foi otimizado para extrair e purificar a 18 subunidade, ~ 0,8 Mda montagem ribonucleoproteï¿½a a partir de levedura de brotamento (Saccharomyces cerevisiae) </em&gt; adequado para coloração negativa e microscopia crio elétron. Aqui está detalhado as modificações feitas com o método TAP, a justificativa para fazer essas alterações, e as abordagens tomadas para ensaio para um complexo de composição e estruturalmente homogênea.

Um método TAP modificado foi usado para purificar a partir de S. cerevisiae U1 snRNP, um complexo ribonucleoproteico-18 subunidade. Uma purificação inicial da TAP complexo seguindo o protocolo publicado 2,3 produziu um complexo que apareceu heterogénea, que migra como três bandas sobre um gel de poliacrilamida corado com prata nativa (Figura 2A). Múltiplos ciclos de optimização do método TAP, produziu um complexo que migrou como uma única banda, princ...

O método Tandem Affinity Purification (TAP) tem sido amplamente utilizado para isolar complexos nativos de extrato celular, principalmente eucariótico, para proteômica. Aqui, apresentamos um protocolo do método TAP otimizado para purificação de complexos nativos para estudos estruturais.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...

O objetivo geral deste protocolo é purificar um complexo macromolecular nativo de qualidade adequada para estudos biofísicos. Este protocolo serve não apenas como um método para purificar um complexo, mas também como um guia detalhado para avaliar a qualidade estrutural da amostra durante a purificação. A principal vantagem deste protocolo é que ele permite purificar uma montagem nativa em condições de tampão próximas às fisiológicas de forma simples e rápida, assegurando assim a homogeneidade composicional.Após a centrifugação das células de S.cerevisiae e a decantação do sobrenadante conforme descrito no protocolo, adicione dois mililitros de tampão de lise gelado e agite suavemente e/ou utilize uma pipeta serológica de 10 mililitros para suspender o precipitado. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros vazio mantido em gelo. Em seguida, utilize mais dois mililitros de tampão de lise gelado para lavar cada frasco de centrífuga e adicione a solução ao tubo de 50 mililitros.Após determinar o peso úmido do pellet celular, crie um banho de nitrogênio líquido ao redor de um tubo cônico de centrífuga de polipropileno de 50 milili

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

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Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

É descrito um método para a purificação eficiente de proteínas de fusão duplo-Strep-marcados e os seus complexos específicos de estreptavidina modificada (Strep-Tactin) resina covalentemente reticulado com bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3). O método tem as vantagens de alta velocidade, uma boa recuperação da proteína alvo e de elevada pureza, e é compatível com a análise subsequente por espectrometria de massa.

Um passo de Purificação de Proteínas Twin-Strep-tag e seus complexos de Strep-Tactin Resina reticulado com Bis (sulfossuccinimidilo) suberato (BS3)

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Aqui apresentamos um protocolo testado e comprovado para a purificação do cloroplasto complexos de importação de proteínas (complexo de TIC-TOC) usando a torneira-tag. O protocolo de afinidade-isolamento de uma etapa potencialmente pode ser aplicado a qualquer proteína e ser usado para identificar novos parceiros de interação por espectrometria de massa.

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Aprenda a purificar complexos macromoleculares nativos de S. cerevisiae usando o método de purificação por afinidade em tandem (TAP). Este protocolo detalhado permite avaliar a qualidade estrutural das amostras durante o processo, garantindo homogeneidade composicional para estudos biofísicos.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

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