Name: Um método de triagem e Validação de mutações resistentes aos inibidores da quinase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprenda a identificar e validar mutações resistentes a inibidores de quinase em terapia oncológica. Este método utiliza biblioteca de mutações aleatórias e triagem in vitro para compreender mecanismos de resistência genética.

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Este estudo foi apoiado por doações para MA do NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) e da Leukemia Research Foundation. MA recebeu o prêmio V-Scholar da V-Foundation. Os autores são gratos à Dra. Sara Rohrabaugh pela edição.

NOTA: Todos os procedimentos deste protocolo foram conduzidos de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o tratamento ético e tratamento dos animais, e de acordo com um protocolo de uso de animais IACUC aprovado. 1. Linha celular de manutenção <ol><li> Culturas de células BAF3 em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml e 100 ug / ml) e meio de cultura gasto de células WEHI. Cultivar células HEK293T em DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e penicilina / estreptomicina (100 unidades / ml e 100 ug / ml). Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2. </li></ol> 2. Construção de plasmídeo <ol><li> Clonar o rato JAK2 e JAK2 sua isoforma oncogénica-V617F em pMSCV-puro-GW por clonase LR, utilizando um processo de recombinação de clonagem padrão. </li><li> Para a construção do vector de expressão de luciferase (Luc-pMSCV-Cherry-GW) utilizado na in-viimagiologia vo, amplificar a luciferase de pLVX-Tet-ON vector por PCR utilizando iniciadores (LUC-SD / RP-LUC TTACAATTTGGACTTTCCG e SD / FP-CACCATGGAAGACGCCAAAAAC) seguido pela clonagem em pENTR-SD-TOPO para gerar pENTR-Luc, que é usada para transferir o gene de luciferase em vector retroviral, pMSCV-Cherry-GW de clonagem por recombinação mediada usando clonase LR. </li></ol> 3. Preparação da Random Mutation Library, Triagem e identificação das Mutações 3.1) A mutagénese aleatória <ol><li> Comprimento total Clone de JAK2 tipo selvagem e a mutação V617F em pMSCV-puro-GW retroviral vector usando uma tecnologia de recombinação clonagem comercial. </li><li> Use 1 ug de ADN plasmídeo de JAK2 V617F-se transformar, XL-1 Vermelho, E. coli, que é defeito nos mecanismos de reparo do DNA permitindo-lhes incorporar mutações aleatórias durante a replicação. Mais especificamente, mistura 50 - 100 ng de ADN (mais do que 100 ng de ADN diminui a eficiência de transformação) com 100 ul de células competentes de um tubo de polipropileno pré-gelada e incubadas em gelo durante 30 min, agitando suavemente a cada 5 min. Para uma boa cobertura a biblioteca, utilizam 4-6 tubos de células competentes. NOTA: mais do que 100 ng de ADN diminui a eficiência de transformação </li><li> Mergulha-se o tubo num banho de água a 42 ° C durante um choque térmico de 45 seg e incubar em gelo durante 2 min. Em seguida, adicionar 1 ml de meio SOC (2,0% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 0,05% de NaCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4, e 0,4% de D-glucose). Incubar o tubo a 37 ° C enquanto agitando a 225-250 rpm durante 90 min. </li><li> Placa células de cada tubo em quatro placas de 10 cm de LB-ágar contendo 100 ug / ml de ampicilina. Incubar as placas durante 16-24 horas a 37 ° C. </li><li> Seguindo colónias visíveis, coletá-los raspando as placas com uma placa raspador estéril. Piscina células de cada placa e isolar o ADN de plasmídeo utilizando um kit de extracção de plasmídeo comercial. NOTA: Normalmente, as colônias são menores e tomar 18-24 horas para servisível, porque estes são crescentes estirpes bacterianas lentas. Nesta fase, avaliar a heterogeneidade de mutações na biblioteca por digestão de restrição com um cortador frequente, tais como Sau3A1 ou Taq1 ou sequenciação. </li></ol> 3.2) A produção de retrovirais sobrenadantes e transdução <ol><li> Um dia antes da transfecção, placa de 4 x 10 6 células HEK 293T Onto 100 centímetros pratos em DMEM contendo 10% de FCS, penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina. </li><li> No dia seguinte, substituir o meio e transfecção das células com mutado biblioteca pMSCV-JAK2-V617F. Para cada placa de 10 cm, misturar 10 ug de ADN (5 ug da biblioteca de plasmídeo e 5 ug de plasmídeo de empacotamento retroviral, pCLEco) com 40 ul de FuGENE para um volume total de 400 ul utilizando meio DMEM livre de soro. Incubar a mistura de ADN e de lípido durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após 20 min adicionar a queda complexo DNA-lipídico sábio em cima de células HEK293T. </li><li> Após seis horas, mudar o meio de transfecção wom meios frescos e incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C para a produção de vírus. Após 48 horas de incubação, recolher os sobrenadantes virais filtradas através de um filtro de 0,45 um Acrodisc. </li></ol> 3.3) Seleção de clones resistentes In Vitro <ol><li> Para mutantes resistentes à JAK2 V617F-droga, a transdução de 100 milhões de células BAF3 com 100 ml de sobrenadantes de vírus com um título virai de 0,5-1 x 10 6. Mais especificamente, misturar 10 8 células com 100 ml de sobrenadante do vírus para um volume total de 300 ml, utilizando meio RPMI, contendo soro a 10% e 24 ug / ml de polyberene (concentração final de ployberene é de 8 ug / ml). Distribuir estes misturadores de células em placas de seis poços múltiplos (4-5 ml por poço). </li><li> Centrifuga-se as placas a 1.250 xg durante 90 min a 25 ° C. Após centrifugação, incubar as placas a 37 ° C durante 24 horas. </li><li> No dia seguinte, reunir as células e misture com Ruxolitinib e meio contendo agar macio e banhado em six placas de poços. Para cada concentração de fármaco, misturar 10 mL de células BAF3 transduzidas (10-20 milhões de células) com a quantidade adequada de Ruxolitinib em um tubo de 50 ml. Completar o volume de 40 ml, utilizando RPMI contendo 20% de soro. Adicionar 10 ml de 1,2% de agar para as células, e mixcarefully placa em placas de seis poços. </li><li> Incubar as placas a 37 ° C durante duas semanas. Escolha as colónias resistentes, utilizando 0,2 ml pontas para pipetas e sub-cultura-los individualmente em placas de 24 poços para 3-4 dias. </li><li> Colher as células BAF3 resistentes por centrifugação a 450 xg durante cinco minutos à temperatura ambiente. Isolar o ADN genómico utilizando um kit comercial de isolamento de ADN genómico. PCR amplificar comprimento total JAK2 cDNA a partir de 100 ng de DNA genômico utilizando primers (mJAK2FP-ATGGCCTGCCTTACAATGACAG e mJAK2RP-GGTTCTGGAAGTCTGCTTGG) e longa-template expandir sistemas de PCR de alta fidelidade. </li><li> Separa-se os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose. Extirpar o 3.4 kb de banda DNA representando JAK2 quadro de codificação e isolar o DNAutilizando um kit de extracção de gel comercial. Sequência de todo o comprimento do cDNA utilizando 8 primers internos (P1 - P8) que mede a sequência de codificação e analisar seqüências usando software comercial. </li></ol> 4. Validação in vitro de mutações resistentes Muitos clones de células transportar mais do que uma mutação, Para testar a contribuição de cada mutação no fenótipo de resistência, gerar variantes seleccionadas por mutagénese dirigida a um local utilizando pMSCV-JAK2V-617F plasmídeo como modelo. <ol><li> Realizar mutagénese dirigida em pMSCV-JAK2 V617F-plasmídeo utilizando um kit de mutagénese comercial e oligonucleótidos concebidos para criar mutações pontuais. Confirme as identidades dos clones mutantes por sequenciação. </li><li> Transdução de células BAF3 com retrovírus feita usando plasmídeos mutantes seguiram com a seleção usando ï¿½puromicina em 1 ug / ml. </li><li> Placa 4 10 células BAF3-JAK2 V617F (50-ul de meio RPMI com FCS a 10%) em cada poço de uma placa de 96 poços. Separadoly adicionar 50 ul de meio contendo o ruxolitinib aos poços ao longo da placa (concentração final: 0, 1, 3, 5, 10, e 20 uM), e incuba-se as placas durante 60 horas a 37 ° C. </li><li> Avaliar a viabilidade das células por adição de 10 ul de reagente WST-1 a cada poço, seguido de incubação com a 37 ° C durante 2-4 horas. Ficha absorvância a A450 usando um leitor de placas. Realizar todos os ensaios em triplicado e enredo média absorção contra concentrações INCB018424. Realize uma curva sigmoidal melhor ajuste usando um algoritmo de ajuste de curva não-linear. Conseguir a concentração de droga que resulta em 50% de viabilidade celular como a IC50 celular. </li><li> Em seguida, placa seis milhões de células BAF3 que expressam variantes de JAK2 em placas de seis poços em meio RPMI contendo 10% de soro com concentrações crescentes de ruxolitinib e incubadas durante 4-6 horas a 37 ° C. </li><li> Recolher as células por centrifugação a 450 xg durante cinco minutos a 4 ° C. Lavar as células uma vez com PBS, e lise em 20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50mM de NaCl, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, 5 mM de EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM de fluoreto de sódio, 2 mM de vanadato de sódio, e 5% de glicerol suplementado com inibidores de cocktail inibidor de protease e fosfatase. Sonicar a suspensão de células durante 1 min, seguido por adição de tampão de carregamento de gel 5x (350 mM Tris-HCl [pH 6,8], 500 mM de DTT, 15% de SDS, 10 mM de benzamidina, 5 mM de EDTA, 5 mM de EGTA, 5 mM de vanadato de sódio , Protease Cocktail, 50% de glicerol, e azul de bromofenol a 0,001%) e desnaturação a 70 ° C durante 5-10 min. </li><li> Resolver as proteínas em um gel de poliacrilamida SDS 8% em condições de desnaturação. Execute immunoblotting com anticorpo monoclonal anti-phopsho STAT5. Tira as manchas e sondado com um anticorpo policlonal de coelho anti-SATA5. Visualize as bandas que utilizam reagentes ECL de acordo com a recomendação do fornecedor. </li></ol> 5. In Vivo de validação <ol><li> Transdução de células que expressam BAF3 luciferase e cereja (transduzidas com retrovírus feitos de pMSCV-Luc-cherry GW) com vírus que expressam JAK2-V617F e variantes resistentes. Seleccionar células que sobrevivem puromicina selecção para a expressão de JAK2 e suas variantes de resistência. </li><li> Injectar dois milhões de células em crescimento activo / cereja BAF3-Luc-JAK2 V617F que transportam e as suas variantes resistentes em 200 ul de PBS a 6 ratinhos Balb / c por via injecção venosa da cauda. </li><li> Depois de três dias de transplantes de células, injectar os ratinhos com Ruxolitinib (100 mg / kg) duas vezes por dia durante duas semanas. </li><li> Execute-base luciferase bioluminescência de imagem com um sistema de imagem. . <ol><li> Em resumo, preparar solução luciferina dissolvendo 300 mg a 25 ml de água deionizada estéril, da alíquota em volumes e loja de menores. NOTA: luciferina Armazenar a -80 ° C e protegido da luz até à utilização. </li><li> Injectar 250 ul a cada rato por IP para conseguir 125 mg / kg em cada rato. Anestesiar os ratos do mesmo grupo em conjunto, utilizando isoflurano inalado (1,5% -2,0%) em uma caixa selada. Aplicar vet pomada em the olho para evitar ressecamento. NOTA: O tempo necessário para que os ratos de dormir (10-15 min) permitiu atividade luciferina a pico. Mantenha o tempo consistente entre os grupos para evitar variação. </li></ol></li><li> Transferir os ratos imediatamente a fase câmara de imagem e manter a anestesia em 1,5-2% de isofluorano durante os procedimentos de imagiologia. Ratinhos imagem sequencial com 0,1, 0,5, 1, 5, 30, 60, e 300 segundos de exposição. Capturar imagens e quantificar a intensidade de bioluminescência usando aquisição de imagem e software de análise. Na sequência de imagens devolver os ratos volta a sua jaula. </li><li> Para, células de medula óssea no total in vivo quimerismo colheita. Eutanásia os ratos com CO 2 para 5 min seguido com luxação cervical. Colher os ossos e esmagar em 4 ml de PBS frio para recolher a medula óssea. Analisar as células positivas por cento de cereja sob microscópio de fluorescência e quantificar utilizando FACS. Recolha vinte mil eventos de cada amostra. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

O sucesso clínico de imatinib no tratamento da CML demonstrado não só o potencial de atacar as quinases rouge por inibidores de moléculas pequenas, mas também descoberto limitações de terapia direcionada: recaída clínica e aparecimento de mutações de resistência a drogas no gene alvo. Identificação de mutações de resistência ajuda na melhor gestão clínica e desenvolvimento de inibidores de próxima geração. Este protocolo descreve uma metodologia para a identificação de mutações resistentes a drogas no gene alvo. Este mé...

As proteína-quinases são enzimas reguladoras-chave de vias intracelulares de transdução de sinal que aparentemente modulam cada função celular. Um controle adequado da quinase mediada sinalização é fundamental para a homeostase e desenvolvimento, que se baseia principalmente na regulamentação adequada de quinases, fosfatases e sua degradação por UPS (sistema ubiquitina proteassoma). Quinases desregulados estão no centro do palco de muitos cânceres e envolvida em série de doenças humanas 1. Genoma humano codifica mais de 500 proteínas cinases que foram ligadas, directa ou indirectamente, para ~ 400 doenças humanas 2. Estas observações suportado o conceito para direccionamento terapêutico de cinases por pequenas moléculas inibidoras 3-5. A demonstração de inibidores da quinase ABL, tais como imatinib, no tratamento de leucemia mielóide crónica (LMC) forneceu a prova de conceito para esta abordagem 6,7. Esta observação não só revolucionou a formigai-quinase terapêutica mas também aplicada a ideia para identificar as lesões genéticas em outras doenças neoplásicas para direccionamento terapêutico, que levam à descoberta de mutações oncogénicas em JAK2 de policitemia vera (PV) e os pacientes com neoplasias mieloproliferativas (NMP). Esta descoberta gerou grande interesse no tratamento MPNs alvejando JAK2 com inibidores da quinase de moléculas pequenas. Agora, quase uma dúzia de inibidores de JAK2 estão em ensaios clínicos, e um deles foi aprovado recentemente para o tratamento de mielofibrose. Enquanto direccionamento específico de quinases oncogénicas por pequenas moléculas inibidoras em cancros trazer resultados promissores, também sofre de desenvolvimento de resistência ao tratamento. De facto, até agora, os pacientes tratados com inibidores de cinase, tais como imatinib, gefitinib, erlotinib e dasatinib mutações de resistência desenvolvida principalmente através da aquisição de mutações no domínio de cinase de droga que tem como alvo 8-10. Resistência como resultado de mutação genética destaca as limitações de of monoterapia alvo contra as quinases oncogénicas, e representa o seguinte desafio para o desenvolvimento de quimioterapia do cancro cada vez mais bem sucedidos. Consequências mecanicistas e funcionais de resistência aos medicamentos deve fornecer uma justificação para a selecção e design de compostos de cortesia para o desenvolvimento de drogas. As mutações identificadas via telas in vitro, mostraram um alto grau de correlação com os encontrados em pacientes. Portanto, rastreio in vitro para mutações que conferem resistência aos fármacos para um dado alvo pares droga auxilia em desenvolvimento clínico ou pré-clínicos em identificar os padrões de resistência que são susceptíveis de causar recaída clínica. A identificação dessas formas mutantes não só é útil no acompanhamento dos pacientes para a resposta à droga e recaída, mas também essencial para a concepção de inibidores mais robustos de próxima geração. Por exemplo, o desenvolvimento de inibidores BCR / ABL próxima geração, o nilotinib e ponatinibe, foram possíveis por causa da maior mecentendimentos hanistic adquirida com mutagênese, estrutural, e estudos funcionais. Anteriormente, relataram os resultados de nossa tela usando mutagênese aleatória de BCR / ABL para revelar o espectro de mutações de resistência aos inibidores tais como Imatinib 11,12, PD166326 12 e 13 AP24163. Os resultados não só identificou as mutações que conferem resistência e recidiva da doença clínica, mas também forneceu a compreensão mecanicista da resistência e dos princípios que regem a função quinase 11,14 drogas. Aqui nós fornecemos detalhes metodológicos adicionais, usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, para permitir uma aplicação mais ampla dessa estratégia de triagem.

<table><tbody><tr><td>Cultura de células e tecidos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células BaF3</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW</td><td>Um presente de Ross Levine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C. GW</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F. GW</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/P58A. GW</td><td>Feito em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-V617F-Cherry.GW</td><td>Feito em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW</td><td>Feito em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW</td><td>Feito em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-Luciferase-puro.GW</td><td>Feito em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biológico</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 1X</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro (corning)</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco (tecnologias de vida)</td> <td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de protamina</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg / ml estoque em água</td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano (0,4%)</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (corning)</td> <td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>INCB018424 (Ruxolitinibe)</td> <td>ChemieTeK</td><td>941678-49-5</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>filtro de disco de 0,45 mícron</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células de nylon de 70 mícrons</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Cultura bacteriana</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XL-1 células vermelhas E. coli</td><td>Agilent Tech</td><td>200129</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/ml solução estoque&nbsp;</td></tr><tr><td>Ágar Bacto</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Caldo fantástico</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood& tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Expandir sistema de PCR de modelo longo</td><td>Roche</td><td>1168134001</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel Sv e PCR sistema de limpeza</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Pure Yield plasmid mini sistema de preparação</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cloning System com tecnologia de gateway com pDONR 221 & OmniMAX 2 Células Competentes</td><td>Invitrogen</td><td>12535029</td><td></td></tr><tr><td>Gateway&nbsp; Mistura de enzimas LR Clonase&nbsp;</td><td>Reagentes</td><td></td> de camundongo Invitrogen 11791019 <td></td></tr><tr><td>Vivo-Glo Luciferina in-vivo Grau</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 seringa de insulina 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td></td> Mortor pilão Coor tek&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>60316 e 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorano (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO série 8000 WJ Incubadora de CO2</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de rotor de balde oscilante 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 contador de células automatizado</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td>Isso não é necessário, pode-se usar hemocitômetro padrão para contagem de células</td></tr></tbody></table>

um método de triagem e validação de mutações resistentes aos inibidores da quinase

A Method for Screening and Validation of Resistant Mutations Against Kinase Inhibitors

A descoberta de BCR / ABL como um oncogene condutor na leucemia mielóide crónica (LMC), resultou no desenvolvimento de Imatinib, o qual, na verdade, demonstraram o potencial do alvo a quinase em cancros por tratar eficazmente os pacientes de CML. Esta observação revolucionou o desenvolvimento de drogas para alvejar as quinases oncogénicas implicados em várias outras doenças malignas, tais como, o EGFR, B-RAF, KIT e PDGFRs. No entanto, uma grande desvantagem de terapias anti-quinase é o aparecimento de mutações de resistência a drogas que tornam o alvo ter reduzido ou perdido afinidade para a droga. A compreensão dos mecanismos empregados pela variantes resistentes não só ajuda no desenvolvimento dos inibidores de nova geração, mas também dá impulso à gestão clínica usando a medicina personalizada. Nós relatou uma estratégia de rastreamento retroviral vector base para identificar o espectro de resistência conferindo mutações no BCR / ABL, o que tem ajudado no desenvolvimento da próxima geração BCR / ABL inibidores. Usando Ruxolitinib e JAK2 como um par alvo da droga, aqui descrevemos em métodos de rastreio in vitro que utiliza as células do rato BAF3 expressam a biblioteca mutação aleatória de JAK2 quinase.

Surgimento de mutações genéticas coloca grande desafio para a terapia anti-quinase alvo. Estudos de mutação, além de proporcionar idéias mecanicistas e funcionais, que são fundamentais para a seleção e projeto de desenvolvimento de medicamentos de última geração, também permite uma melhor gestão clínica e pode, no futuro, ser mais útil para o tratamento personalizado. Neste experimento, mostramos triagem para mutações de resistência ruxolitinib em JAK2 V617F-quinase (Figura 1). Construímos pMSCV-JAK2-V6...

Surgimento de resistência genética a terapia com inibidor da quinase poses desafio significativo para a terapia do cancro eficaz. Identificação e caracterização de mutações resistentes contra uma droga recém-desenvolvido ajuda na melhor gestão clínica e concepção de medicamentos próxima geração. Aqui, descrevemos o nosso protocolo de rastreio in vitro e validação das mutações resistentes.

Um método de triagem e Validação de mutações resistentes aos inibidores da quinase

The discovery of BCR/ABL as a driver oncogene in chronic myeloid leukemia (CML) resulted in the development of Imatinib, which, in fact, demonstrated the ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar e validar mutações resistentes a medicamentos. Isso é feito criando primeiro uma biblioteca de mutações aleatórias do oncogene alvo. O segundo passo é realizar a triagem in vitro para a emergência de clones resistentes.A terceira etapa do procedimento é sequenciar os clones resistentes para identificar mutações resistentes. A etapa final é validar as mutações resistentes recriando as mutações usando mutagênese dirigida ao local, seguida de ensaios in vitro e in vivo. Em última análise, mutações resistentes a medicamentos clinicamente relevantes podem ser identificadas em relação a um determinado par de alvos de medicamentos.A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como ENU ou métodos baseados em PCR, é que ela é imparcial e, ao contrário do METAGENE ssis baseado em PCR, este não se limita a um tamanho do oncogene ou ao conteúdo de GC de qualquer gene. Geralmente, aqueles que são novos nessa técnica terão dificuldades devido à falta de conhecimento em biologia molecular e celular. A demonstração visual desse método é crítica.Como as etapas de neogênese e triagem são difíceis de aprender. É porque muitas pessoas não têm experiência em produção viral, em cultura de células e meios semicelulares. Este procedimento começa com a transformação de células XL one red e coli com um plasmídeo contendo JAK two V 617 f uma isoforma oncogênica de JAK duas células XL one red e coli são defeituosas nos mecanismos de reparo do DNA, permitindo assim que incorporem mutações aleatórias durante a replicação.Misture 50 a 100 nanogramas de DNA plasmidial com 100 microlitros de células competentes em um tubo de polipropileno pré-resfriado. Não use mais de 100 nanogramas de DNA porque diminui a eficiência da transformação. Incube no gelo por 30 minutos, girando suavemente a cada cinco minutos para uma boa cobertura da biblioteca.Use de quatro a seis tubos de células competentes. Mergulhe os tubos de polipropileno em banho-maria a 42 graus Celsius para um choque térmico de 45 segundos e, em seguida, incube no gelo por dois minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio SOC a cada tubo.Incube os tubos a 37 graus Celsius enquanto agita a 225 a 250 RPM por 90 minutos. Células de placa em quatro placas de trado LB de 10 centímetros contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube as placas a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas.Assim que as colônias estiverem visíveis, colete-as raspando as placas com um raspador de placa estéril. Agrupe as células de cada placa. Posteriormente, o DNA do plasmídeo é isolado usando um kit comercial de extração de plasmídeo e a heterogeneidade das mutações na biblioteca é avaliada por sequenciamento um dia antes da placa de transfecção, quatro vezes 10 elevado à sexta célula T HEK 2 93, em placas de 100 milímetros em DM EM contendo 10% FCS, penicilina, estreptomicina e dois milimolares de L-glutamina.No dia seguinte, prepare os reagentes de transfecção para cada placa de 100 milímetros. Misture cinco microgramas da biblioteca de plasmídeos, cinco microgramas de um plasmídeo de embalagem retroviral e 40 microlitros do gene FU para um volume total de 400 microlitros usando meio DM e EM livre de soro. Incube a mistura de DNA e lipídios por 20 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, substitua o meio das células T HEK 2 93 por meio fresco e adicione o complexo lipídico de DNA gota a gota no topo das células. Incube a 37 graus Celsius por seis horas. Após seis horas, substitua o meio de transfecção por meio novo e incube as placas por 48 horas a 37 graus Celsius por produção de vírus.Após 48 horas de incubação, colete sobrenadantes virais filtrados através de um filtro acro disc de 0,45 micrômetro para iniciar o procedimento de triagem e identificação de mutantes JAK dois V 607 F resistentes a medicamentos transduzem BAF três células com os sobrenadantes retrovirais. Misture 100 milhões de células BAF três com 100 mililitros de sobrenadante de vírus para um volume total de 300 mililitros usando meio RPMI contendo 10% de soro e poli cérebro. Distribua esta mistura de supernat de células e vírus em várias placas de seis poços, enchendo cada poço com quatro a cinco mililitros.Centrifugue as placas a 1.250 GS por 90 minutos a 37 graus Celsius. Após a centrifugação, incubar as placas a 37 graus Celsius por 24 horas no dia seguinte, agrupar as células transduzidas para cada concentração de droga. Misture 10 mililitros de células com ruxolitinibe em um tubo de 50 mililitros.As concentrações de ruxolitinibe testadas neste exemplo são 1, 5, 2, 0,5 e 10 micromolares. Completar o volume para 40 mililitros utilizando RPMI contendo 20% de soro. Adicione 10 mililitros de 1,2% de broca às células e misture cuidadosamente a placa em placas de seis poços.Dispensando quatro mililitros por poço. Incube as placas a 37 graus Celsius por duas semanas. Quando as colônias resistentes estiverem visíveis, use pontas de pipeta de 0,2 mililitro para escolher as colônias e subcultivá-las individualmente.Em placas de 24 poços por três a quatro dias, colher as três células resistentes do BAF por centrifugação a 450 GS por cinco minutos à temperatura ambiente. Depois de isolar o DNA genômico usando um kit de extração de DNA genômico comercial, amplifique o JAK dois CDNA de comprimento total do DNA genômico por PCR. Os produtos de PCR são então separados pela eletroforese em gel de Agar Rose e pela banda de DNA de 3,4 KILOBASE.Representando o quadro de dois revestimentos JAK é isolado usando um kit comercial de extração de gel. Por fim, sequencie o CDNA de comprimento total usando oito primers internos abrangendo a sequência de codificação e analise as sequências usando software comercial para validar mutações resistentes a medicamentos. Variantes selecionadas in vitro são geradas por mutagênese dirigida ao local da sequência JAK dois V 617 F e reintroduzidas em três células BAF.Adicione 50 microlitros de meio contendo várias concentrações de ruxolitinibe aos poços através da placa separadamente, placa 10 ao quarto do BAF três células JAK duas V 617 F em cada poço de uma placa de 96 poços incube as placas a 37 graus Celsius por 60 horas Para avaliar a viabilidade celular, adicione 10 microlitros de WST um reagente a cada poço e incube a 37 graus Celsius por duas a quatro horas. Registre a absorbância em 450 usando um leitor de placas. Realizar todos os ensaios em triplicado e representar graficamente a absorbância média em relação às concentrações de ruxolitinib.Execute uma curva sigmoidal de melhor ajuste usando uma pontuação de algoritmo de ajuste de curva não linear. A concentração do medicamento resultando em 50% de viabilidade celular como o IC 50 celular subsequentemente in vivo validação de mutações resistentes é realizada conforme descrito no protocolo de texto anexo. Uma vez que os clones celulares resistentes gerados por mutagênese aleatória podem conter mais de uma mutação, essas mutações devem ser validadas isoladamente por ensaios in vitro e in vivo.No ensaio in vitro, variantes selecionadas foram geradas por mutagênese dirigida ao local da sequência JAK dois V 607 F e reintroduzidas em três células BAF, que foram então medidas quanto à capacidade de proliferação celular em diferentes dosagens de ruxolitinibe para avaliar os valores de IC 50. Além disso, o immunoblotting para fosfotirosina ou fosfotirosina STAT five foi realizado em lisados de proteínas de células BF três que foram incubadas com doses crescentes de ruxolitinibe para descartar qualquer resistência mediada fora do alvo. Mutantes exibindo valores aprimorados de IC 50 e autofosforilação persistente em concentrações mais altas de ruxolitinibe são, portanto, confirmados como variantes resistentes a medicamentos para validar a resistência in vivo.BF, três células projetadas para expressar JAK, duas variantes V, seis 17 F e luciferase cereja foram injetadas em camundongos, que foram posteriormente injetados com ruxolitinibe por duas semanas. Depois de duas semanas. Os camundongos foram fotografados para bioluminescência catalisada por luciferase, quimerismo BAF três na medula óssea e o fluxo sanguíneo periférico foi avaliado medindo a fluorescência de células positivas para cereja.Os resultados mostram que os camundongos que expressam JAK dois V 607 F são para ruxolitinibe, enquanto as variantes resistentes mostram incrementos progressivos na bioluminescência ao longo do período de tratamento. Uma vez dominada, a neogênese aleatória pode ser realizada em quatro a cinco dias, se for feita corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um plasmídeo aleatoriamente, biblioteca de DNA para triagem in vitro contra qualquer par de alvos de drogas.Não se esqueça de que trabalhar com retrovírus pode ser extremamente perigoso. Devem ser sempre tomadas precauções durante a execução deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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