Um método de triagem e Validação de mutações resistentes aos inibidores da quinase

O objetivo geral deste procedimento é identificar e validar mutações resistentes a medicamentos. Isso é feito criando primeiro uma biblioteca de mutações aleatórias do oncogene alvo. O segundo passo é realizar a triagem in vitro para a emergência de clones resistentes.

A terceira etapa do procedimento é sequenciar os clones resistentes para identificar mutações resistentes. A etapa final é validar as mutações resistentes recriando as mutações usando mutagênese dirigida ao local, seguida de ensaios in vitro e in vivo. Em última análise, mutações resistentes a medicamentos clinicamente relevantes podem ser identificadas em relação a um determinado par de alvos de medicamentos.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como ENU ou métodos baseados em PCR, é que ela é imparcial e, ao contrário do METAGENE ssis baseado em PCR, este não se limita a um tamanho do oncogene ou ao conteúdo de GC de qualquer gene. Geralmente, aqueles que são novos nessa técnica terão dificuldades devido à falta de conhecimento em biologia molecular e celular. A demonstração visual desse método é crítica.

Como as etapas de neogênese e triagem são difíceis de aprender. É porque muitas pessoas não têm experiência em produção viral, em cultura de células e meios semicelulares. Este procedimento começa com a transformação de células XL one red e coli com um plasmídeo contendo JAK two V 617 f uma isoforma oncogênica de JAK duas células XL one red e coli são defeituosas nos mecanismos de reparo do DNA, permitindo assim que incorporem mutações aleatórias durante a replicação.

Misture 50 a 100 nanogramas de DNA plasmidial com 100 microlitros de células competentes em um tubo de polipropileno pré-resfriado. Não use mais de 100 nanogramas de DNA porque diminui a eficiência da transformação. Incube no gelo por 30 minutos, girando suavemente a cada cinco minutos para uma boa cobertura da biblioteca.

Use de quatro a seis tubos de células competentes. Mergulhe os tubos de polipropileno em banho-maria a 42 graus Celsius para um choque térmico de 45 segundos e, em seguida, incube no gelo por dois minutos. Em seguida, adicione um mililitro de meio SOC a cada tubo.

Incube os tubos a 37 graus Celsius enquanto agita a 225 a 250 RPM por 90 minutos. Células de placa em quatro placas de trado LB de 10 centímetros contendo 100 microgramas por mililitro de ampicilina. Incube as placas a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas.

Assim que as colônias estiverem visíveis, colete-as raspando as placas com um raspador de placa estéril. Agrupe as células de cada placa. Posteriormente, o DNA do plasmídeo é isolado usando um kit comercial de extração de plasmídeo e a heterogeneidade das mutações na biblioteca é avaliada por sequenciamento um dia antes da placa de transfecção, quatro vezes 10 elevado à sexta célula T HEK 2 93, em placas de 100 milímetros em DM EM contendo 10% FCS, penicilina, estreptomicina e dois milimolares de L-glutamina.

No dia seguinte, prepare os reagentes de transfecção para cada placa de 100 milímetros. Misture cinco microgramas da biblioteca de plasmídeos, cinco microgramas de um plasmídeo de embalagem retroviral e 40 microlitros do gene FU para um volume total de 400 microlitros usando meio DM e EM livre de soro. Incube a mistura de DNA e lipídios por 20 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, substitua o meio das células T HEK 2 93 por meio fresco e adicione o complexo lipídico de DNA gota a gota no topo das células. Incube a 37 graus Celsius por seis horas. Após seis horas, substitua o meio de transfecção por meio novo e incube as placas por 48 horas a 37 graus Celsius por produção de vírus.

Após 48 horas de incubação, colete sobrenadantes virais filtrados através de um filtro acro disc de 0,45 micrômetro para iniciar o procedimento de triagem e identificação de mutantes JAK dois V 607 F resistentes a medicamentos transduzem BAF três células com os sobrenadantes retrovirais. Misture 100 milhões de células BAF três com 100 mililitros de sobrenadante de vírus para um volume total de 300 mililitros usando meio RPMI contendo 10% de soro e poli cérebro. Distribua esta mistura de supernat de células e vírus em várias placas de seis poços, enchendo cada poço com quatro a cinco mililitros.

Centrifugue as placas a 1.250 GS por 90 minutos a 37 graus Celsius. Após a centrifugação, incubar as placas a 37 graus Celsius por 24 horas no dia seguinte, agrupar as células transduzidas para cada concentração de droga. Misture 10 mililitros de células com ruxolitinibe em um tubo de 50 mililitros.

As concentrações de ruxolitinibe testadas neste exemplo são 1, 5, 2, 0,5 e 10 micromolares. Completar o volume para 40 mililitros utilizando RPMI contendo 20% de soro. Adicione 10 mililitros de 1,2% de broca às células e misture cuidadosamente a placa em placas de seis poços.

Dispensando quatro mililitros por poço. Incube as placas a 37 graus Celsius por duas semanas. Quando as colônias resistentes estiverem visíveis, use pontas de pipeta de 0,2 mililitro para escolher as colônias e subcultivá-las individualmente.

Em placas de 24 poços por três a quatro dias, colher as três células resistentes do BAF por centrifugação a 450 GS por cinco minutos à temperatura ambiente. Depois de isolar o DNA genômico usando um kit de extração de DNA genômico comercial, amplifique o JAK dois CDNA de comprimento total do DNA genômico por PCR. Os produtos de PCR são então separados pela eletroforese em gel de Agar Rose e pela banda de DNA de 3,4 KILOBASE.

Representando o quadro de dois revestimentos JAK é isolado usando um kit comercial de extração de gel. Por fim, sequencie o CDNA de comprimento total usando oito primers internos abrangendo a sequência de codificação e analise as sequências usando software comercial para validar mutações resistentes a medicamentos. Variantes selecionadas in vitro são geradas por mutagênese dirigida ao local da sequência JAK dois V 617 F e reintroduzidas em três células BAF.

Adicione 50 microlitros de meio contendo várias concentrações de ruxolitinibe aos poços através da placa separadamente, placa 10 ao quarto do BAF três células JAK duas V 617 F em cada poço de uma placa de 96 poços incube as placas a 37 graus Celsius por 60 horas Para avaliar a viabilidade celular, adicione 10 microlitros de WST um reagente a cada poço e incube a 37 graus Celsius por duas a quatro horas. Registre a absorbância em 450 usando um leitor de placas. Realizar todos os ensaios em triplicado e representar graficamente a absorbância média em relação às concentrações de ruxolitinib.

Execute uma curva sigmoidal de melhor ajuste usando uma pontuação de algoritmo de ajuste de curva não linear. A concentração do medicamento resultando em 50% de viabilidade celular como o IC 50 celular subsequentemente in vivo validação de mutações resistentes é realizada conforme descrito no protocolo de texto anexo. Uma vez que os clones celulares resistentes gerados por mutagênese aleatória podem conter mais de uma mutação, essas mutações devem ser validadas isoladamente por ensaios in vitro e in vivo.

No ensaio in vitro, variantes selecionadas foram geradas por mutagênese dirigida ao local da sequência JAK dois V 607 F e reintroduzidas em três células BAF, que foram então medidas quanto à capacidade de proliferação celular em diferentes dosagens de ruxolitinibe para avaliar os valores de IC 50. Além disso, o immunoblotting para fosfotirosina ou fosfotirosina STAT five foi realizado em lisados de proteínas de células BF três que foram incubadas com doses crescentes de ruxolitinibe para descartar qualquer resistência mediada fora do alvo. Mutantes exibindo valores aprimorados de IC 50 e autofosforilação persistente em concentrações mais altas de ruxolitinibe são, portanto, confirmados como variantes resistentes a medicamentos para validar a resistência in vivo.

BF, três células projetadas para expressar JAK, duas variantes V, seis 17 F e luciferase cereja foram injetadas em camundongos, que foram posteriormente injetados com ruxolitinibe por duas semanas. Depois de duas semanas. Os camundongos foram fotografados para bioluminescência catalisada por luciferase, quimerismo BAF três na medula óssea e o fluxo sanguíneo periférico foi avaliado medindo a fluorescência de células positivas para cereja.

Os resultados mostram que os camundongos que expressam JAK dois V 607 F são para ruxolitinibe, enquanto as variantes resistentes mostram incrementos progressivos na bioluminescência ao longo do período de tratamento. Uma vez dominada, a neogênese aleatória pode ser realizada em quatro a cinco dias, se for feita corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um plasmídeo aleatoriamente, biblioteca de DNA para triagem in vitro contra qualquer par de alvos de drogas.

Não se esqueça de que trabalhar com retrovírus pode ser extremamente perigoso. Devem ser sempre tomadas precauções durante a execução deste procedimento.