Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening

O objetivo geral deste procedimento é identificar quinases que fosforilam um substrato de interesse utilizando métodos de triagem de alto rendimento. Isso é realizado primeiramente transfectando células com plasmídeos que expressam quinases FU como transferase de glutationa ou GST. O segundo passo é realizar um ensaio de precipitação com GST quinase.

Em seguida, as amostras são carregadas nos géis, que são então eletroforéticos e corados com corante azul brilhante kumasi. O passo final é secar os géis e expô-los ao filme de autorradiografia. Finalmente, ao revelar e interpretar os filmes resultantes, é possível identificar pares de quinase-substrato, já que cada poço representa um ensaio de quinase distinto.

Os métodos existentes para identificar uma quinase para um substrato fosforilado conhecido incluem o uso de abordagens bioinformáticas para buscar um sítio consenso no substrato, a detecção de complexos entre quinases e substratos utilizando técnicas bioquímicas e uma abordagem de tentativa e erro, e a busca por substratos consenso com base em suas funções biológicas conhecidas. Essas abordagens são demoradas e nem sempre obtêm sucesso. Nossa abordagem permite a identificação rápida de pares quinase-substrato com base em resultados funcionais.

Quando tivemos pela primeira vez a ideia para este método, estávamos preocupados com a possibilidade de haver especificidade insuficiente in vitro. Na verdade, a especificidade do substrato é excelente, e frequentemente observamos que apenas quinases de membros da mesma família são capazes de fosforilar um determinado substrato na triagem. Isso é particularmente evidente quando realizamos multiplexação usando múltiplos substratos em cada triagem, demonstrando que o procedimento será Courtney, uma técnica do meu laboratório Inicie o procedimento com o preparo dos reagentes, placas e células conforme descrito no protocolo textual.

Se as placas contendo os plasmídeos de cinase tiverem sido congeladas, descongele-as à temperatura ambiente e centrifugue a 1900 vezes G durante três minutos para recolher qualquer umidade no fundo dos poços. Misture 8,6 mililitros de meio com soro reduzido com 312,7 microlitros de reagente de transfeção baseado em lipídios e deixe a mistura repousar por cinco minutos em cada poço. Da placa de 96 poços contendo os plasmídeos de cinase, adicione 10 microlitros do meio com soro reduzido.

Usando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de pequeno volume, adicione então 10 microlitros da mistura do reagente de transfeção em meio de soro reduzido por poço, utilizando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de pequeno volume, e deixe a placa repousar por 20 a 45 minutos. Em seguida, ressuspenda 2 93 T células a 0,75 milhão de células por mililitro em 80 mililitros de meio DMEM modificado completo ou meio DMEM, adicionando 100 microlitros da suspensão celular por poço. Usando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de volume padrão, verifique os poços ao microscópio para garantir distribuição uniforme das células antes de devolver a placa ao incubador a 37 graus Celsius por 24 horas.

Para iniciar o experimento de precipitação por afinidade com GST quinase. Prepare uma solução de vanadato a quatro milimolares misturando 60 microlitros de vanadato de sódio 0,2 molar com 540 microlitros de água em um segundo tubo, misture 2,7 microlitros de peróxido a 30% e 1,4 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Adicione as duas soluções juntas e deixe a mistura repousar por 15 minutos antes do uso.

Usando uma pipeta multicanal, distribua dois microlitros de cloreto de cálcio 0,25 molar em cada poço, seguido por 2,5 microlitros da solução de fosfato de data comprovada. Incube cada placa a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, coloque na gelo, mantendo as placas sobre gelo. Remova o meio de cada poço, usando um vácuo imediatamente com 50 microlitros por poço de tampão de lise frio.

Usando um dispensador automático de líquidos equipado com o cassete padrão, deixe a placa repousar por 30 minutos sobre gelo para lisar. Após centrifugar as placas a 1900 × g por três minutos a quatro graus Celsius, raspe as células de cada poço utilizando uma pipeta multicanal e transfira todo o conteúdo para vbo devidamente rotulados. Placas de 96 poços: centrifugue as placas a 1900 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius; durante a centrifugação, preencha as placas revestidas com glutationa com 100 microlitros por poço de tampão de lise gelado.

Como enxágue, mantenha as placas sobre gelo. Após a centrifugação das placas com fundo V, inverta as placas de glutationa sobre uma pia para remover o tampão de lise, agitando levemente e secando com um papel toalha. Transfira o tampão de lise das placas com fundo V para as placas de glutationa inclinando a placa e utilizando uma pipeta multicanal, tomando cuidado para não perturbar o pellet no fundo.

Em seguida, cubra as placas e deixe em gelo por um mínimo de duas horas. Pouco antes do final do período de ligação de duas horas, prepare uma estação de trabalho com radioatividade, garantindo que as precauções necessárias de segurança estejam em vigor para trabalhos com materiais radioativos. Ajuste o forno de hibridização para 30 graus Celsius.

Inverta as placas de glutationa sobre uma pia para remover o tampão de lise e seque em uma toalha de papel. Enxágue os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lise sem PMSF. Não deixe os poços secarem.

Mantenha-os na solução de lavagem até o momento de prosseguir. Em seguida, prepare 55 mililitros de tampão de quinase 1 X ou 1x KB conforme descrito no protocolo do texto. Adicione 50 microlitros de 1x KB a cada poço da placa usando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de volume padrão.

Em seguida, prepare a solução A fazendo uma solução contendo o substrato de interesse e a proteína básica da mielina ou MVP conforme detalhado no protocolo textual, um de cada vez. Inverta as placas sobre uma pia para remover o lavado de um XKB em uma toalha de papel e adicione imediatamente 30 microlitros da solução A usando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de pequeno volume. Mantenha as placas sobre gelo.

Em seguida, prepare a solução B na área de trabalho com radioatividade conforme descrito no protocolo do texto, utilizando 20 microlitros da solução B por poço. Usando uma pipeta repetidora, que auxilia na mistura devido à força de ejeção, cubra e incube a placa em um forno de hibridização a 30 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, transfira as placas de volta para o gelo.

Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de lise de dodecil sulfato de sódio a duas vezes ou SDS a cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Todo o trabalho nesta seção deve ser realizado em uma área designada para atividade radioativa. Ligue o forno de hibridização e ajuste-o para 85 graus Celsius.

Uma vez que o forno tenha atingido a temperatura, transfira as placas para o forno e incube por 10 minutos para desnaturar as amostras. Em seguida, carregue géis pré-moldados de 26 poços com 15 microlitros de cada reação.

Usando uma pipeta multicanal para preencher vários poços ao mesmo tempo, é necessário ter cuidado para que todas as ponteiras estejam alinhadas com os respectivos poços. Antes de adicionar as amostras, execute o gel a 150 volts. Não permita que a linha azul saia pela parte inferior do gel, pois ela contém o ATP não incorporado. Em seguida, desmonte os géis e remova o ATP não incorporado, pois isso escurecerá a exposição do gel nos filmes.

Coloque os géis em recipientes etiquetados e cubra com o corante kumasi por 15 minutos. Em seguida, remova o corante kumasi. Enxágue brevemente os géis com água e adicione a solução de descoragem.

Retenha os géis até que as proteínas sejam claramente visíveis. Uma faixa para MVP e uma faixa para o substrato devem ser visíveis em cada amostra. Para secar os géis, corte uma folha grande de papel filtro e coloque-a no secador.

Umedeça uma folha de celofane em água destilada até que fique lisa e sem rugas e coloque-a sobre o papel. Coloque os géis sobre a folha de celofane, anotando a ordem dos géis. Umedeça uma segunda folha de celofane e coloque-a sobre os géis.

Alise todas as bolhas para obter uma superfície uniforme. Feche a aba, ligue o vácuo e seque os géis por três horas a 80 graus Celsius. Uma vez que os géis estejam secos, exponha-os a um filme de auto-radiografia de emulsão dupla utilizando uma tela para intensificar o sinal.

Envolva o cassete com filme plástico ou um saco plástico e feche com fita adesiva para evitar a formação de gelo antes de armazenar o cassete a menos 80 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, retire o cassete do congelador e deixe descongelar à temperatura ambiente. Revele o filme em um local escuro usando um processador de filmes, conforme as instruções do fabricante indicadas.

Aqui estão resultados representativos de uma triagem na qual 180 quinases foram analisadas usando um substrato peptídico com marcação GST correspondente aos aminoácidos de 268 a 283 do coativador transcricional regulado por Krebs dois, ou CRTC dois, bem como o substrato clássico para ensaio de quinase, a proteína básica da mielina ou MBP apenas dois. As quinases mark dois e a quinase altamente relacionada, mark três, foram fosforiladas. O peptídeo CRTC dois MBP é incluído como controle interno em todos os ensaios, pois contém muitos resíduos passíveis de fosforilação e migra a 18 quilodaltons, na parte inferior do gel.

Isso permite uma interpretação da especificidade. Algumas quinases fosforilarão robustamente um substrato e a MVP. É importante observar que as poças contendo GST isoladamente purificam sempre alguma atividade quinase endógena.

Assim, há sempre uma fosforilação de fundo no ensaio. Embora isso não descarte a possibilidade de a fosforilação do substrato ser real, sugere que, em condições in vitro, a quinase pode ser menos seletiva. É particularmente informativo incluir múltiplos substratos com diferentes pesos moleculares para tirar conclusões sobre a especificidade da quinase em relação aos substratos.

Como a triagem é realizada in vitro e níveis adicionais de complexidade ocorrem in vivo, uma quinase candidata deve ser validada em células. Por exemplo, uma quinase candidata pode ter a capacidade de fosforilar um substrato in vitro, mas não estar expressa no mesmo tipo celular ou nas mesmas subcélulas de um compartimento que o substrato. Isso é geralmente feito utilizando o silenciamento mediado por RNAi do candidato.

Também é possível realizar uma tela secundária utilizando um mutante não fosforilável do substrato para confirmar a especificidade.