Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening

O objetivo geral deste procedimento é identificar quinases que fosforilam um substrato de interesse usando métodos de triagem de alto rendimento. Isso é feito primeiro pela transsecção de células com plasmídeos que expressam quinases FU em glutationa como transferase ou GST. O segundo passo é realizar um pulldown de quinase GST.

Em seguida, as amostras são carregadas em géis, que são então executados e corados com corante azul brilhante kumasi. A etapa final é secar os géis e expô-los ao filme de auto-radiografia. Em última análise, ao desenvolver e interpretar os filmes resultantes, é possível identificar pares de substratos de quinase, pois cada pista é representativa de um ensaio de quinase distinto.

Os métodos existentes para identificar uma quinase para um substrato fosforilado conhecido incluem o uso de abordagens bioinformáticas para procurar um local de consenso no substrato, detectar complexos entre quinase e substratos usando técnicas bioquímicas e uma abordagem de tentativa e erro, procurando substratos de consenso conte com base em sua função biológica conhecida. Essas abordagens são demoradas e nem sempre são bem-sucedidas. Nossa abordagem permite a identificação rápida de pares de substratos de quinase com base nos resultados funcionais.

Quando tivemos a ideia desse método, estávamos preocupados com a possibilidade de não haver especificidade suficiente in vitro. Acontece que a especificidade do substrato é excelente e muitas vezes descobrimos que apenas as quinases dos membros da família são capazes de fosforilar um determinado substrato na tela. Isso é particularmente evidente quando multiplexamos usando vários substratos em cada tela, demonstrando que o procedimento será Courtney, um técnico do meu laboratório Comece o procedimento com a preparação de reagentes, placas e células, conforme descrito no protocolo de texto.

Se as placas contendo plasmídeos de quinase tiverem sido congeladas, descongelar à temperatura ambiente e centrifugar a 1900 vezes G durante três minutos para recolher a humidade no fundo dos poços. Misture 8,6 mililitros de meio de soro reduzido com 312,7 microlitros de reagente de transfecção à base de lipídios e deixe a mistura descansar por cinco minutos em cada poço. Da placa de 96 poços contendo os plasmídeos de quinase a 10 microlitros do meio de soro reduzido.

Usando um dispensador de líquido automatizado equipado com um de pequeno volume, adicione 10 microlitros da mistura de reagente de transfecção de meio de soro reduzido por poço, usando um dispensador de líquido automatizado equipado com um de pequeno volume e deixe a placa descansar por 20 a 45 minutos. Em seguida, resus suspende 2 células T de 93 a 0,75 milhão de células por mililitro em 80 mililitros de delcos completos modificados em meio igual ou DMEM a 100 microlitros da suspensão celular por poço. Usando um dispensador de líquido automatizado equipado com um de volume padrão, verifique os poços sob um microscópio quanto à distribuição uniforme das células antes de retornar a placa a uma incubadora de 37 graus Celsius por 24 horas.

Para começar o experimento de retirada da GST quinase. Faça uma solução de quatro milimolares por vanadato misturando 60 microlitros de vanadato de sódio 0,2 molar com 540 microlitros de água em um segundo tubo misturado 2,7 microlitros de peróxido de 30% e 1,4 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Adicione as duas soluções e deixe a mistura descansar por 15 minutos antes de usar.

Usando uma pipeta multicanal, dispense dois microlitros de cloreto de cálcio 0,25 molar em cada poço, seguidos por 2,5 microlitros da solução de tâmara comprovada. Incube cada placa a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, coloque no gelo, mantendo as placas no gelo. Remova o meio de cada poço, usando um vácuo imediatamente a 50 microlitros por poço de tampão de lise gelada.

Usando um dispensador de líquido automatizado equipado com o padrão, deixe o prato descansar por 30 minutos no gelo para piolhos. Depois de girar as placas a 1900 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius, raspe as células de cada poço usando uma pipeta multicanal e transfira todo o conteúdo para o VBO devidamente rotulado. Placas de 96 poços giram as placas a 1900 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius durante a rotação enchem as placas revestidas de glutationa com 100 microlitros por poço de tampão de lise gelada.

Como enxágue, mantenha os pratos no gelo. Após a centrifugação das placas inferiores, inverta as placas de glutationa sobre uma pia para sacudir o tampão de lise e seque em uma toalha de papel. Transfira o tampão de lise das placas inferiores em V para as placas de glutationa inclinando a placa e usando uma pipeta multicanal, tomando cuidado para não perturbar o pellet no fundo.

Em seguida, cubra os pratos e deixe no gelo por no mínimo duas horas. Para ligar perto do final da etapa de encadernação de duas horas, prepare uma estação de trabalho de radioatividade garantindo que as precauções de segurança necessárias estejam em vigor para o trabalho radioativo. Defina o forno de hibridização para 30 graus Celsius.

Inverta as placas de glutationa sobre uma pia para sacudir o tampão de lise e seque em uma toalha de papel. Enxágue os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lise sem PMSF. Não deixe os poços secarem.

Mantenha-os no enxágue até que estejam prontos para prosseguir. Em seguida, prepare 55 mililitros de um tampão X quinase ou um x kb conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 50 microlitros de um x kb a cada poço da placa usando um dispensador de líquido automatizado equipado com um de volume padrão.

Em seguida, prepare a solução A fazendo uma solução contendo o substrato de interesse e a proteína básica de mielina ou MVP, conforme detalhado no protocolo de texto, um de cada vez. Inverta as placas sobre uma pia para remover a parcela de enxágue XKB em uma toalha de papel e adicione imediatamente 30 microlitros de solução A. Usando um dispensador de líquido automatizado equipado com um de pequeno volume. Mantenha os pratos no gelo.

Em seguida, prepare a solução B na área de trabalho de radioatividade, conforme descrito no protocolo de texto, a 20 microlitros de solução B por poço. Usando uma pipeta repetidora, que auxilia na mistura devido à força de ejeção, cubra e incube a placa em um forno de hibridização a 30 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, transfira os pratos de volta para o gelo.

Em seguida, adicione 50 microlitros de dois x sulfato de eccle de sódio ou tampão de lise SDS a cada poço usando uma pipeta multicanal. Todo o trabalho nesta seção deve ser realizado em uma área designada para atividade de rádio. Ligue o forno de hibridização e ajuste-o para 85 graus Celsius.

Assim que o forno atingir a temperatura, transfira as placas para o forno e incube por 10 minutos para desnaturar as amostras. Próxima carga. 26 géis pré-moldados de poço com 15 microlitros de cada reação.

Usando uma pipeta multicanal para encher vários poços ao mesmo tempo, deve-se tomar cuidado para que todas as pontas estejam alinhadas com os poços correspondentes. Antes de adicionar as amostras, execute o gel a 150 volts. Não deixe a linha azul escorrer da parte inferior do gel, pois ela contém o A TP não incorporado. Em seguida, desmonte os géis e remova o TP não incorporado, pois isso escurecerá a exposição do gel nos filmes.

Coloque os géis em recipientes rotulados e cubra com a coloração de kumasi por 15 minutos. Em seguida, remova a mancha de kumasi. Enxágue brevemente os géis com água e adicione a solução de detenção.

Deter os géis até que as proteínas estejam claramente visíveis. Uma banda para MVP e uma banda para o substrato devem ser visíveis para cada amostra. Para secar os géis, corte uma folha grande de papel de filtro e coloque-a na secadora.

Molhe uma folha de celofane em água destilada até que fique lisa e sem rugas e coloque-a em cima do papel. Coloque os géis em cima da folha de celofane, anotando a ordem dos géis. Molhe uma segunda folha de celofane e coloque por cima dos géis.

Estenda todas as bolhas para obter uma superfície uniforme e agradável. Feche a tampa, ligue o aspirador e conduza os géis por três horas a 80 graus Celsius. Assim que os géis estiverem secos, exponha-os a filme de auto-radiografia de emulsão dupla usando uma tela para intensificar o sinal.

Enrole o com filme plástico ou um saco plástico e feche com fita adesiva para evitar o congelamento antes de armazenar o a 80 graus Celsius negativos durante a noite. No dia seguinte, retire o do freezer e deixe-o descongelar em temperatura ambiente. Revele o filme em uma sala escura usando um processador de filme de acordo com as instruções do fabricante mostradas.

Aqui estão os resultados representativos de uma triagem 180 quinases foram rastreadas usando um substrato peptídico marcado com GST correspondente aos aminoácidos 268 a 283 do coativador transcricional regulado por kreb dois ou C RTC dois, bem como o substrato de ensaio de quinase clássico proteína básica de mielina ou MBP apenas dois. As quinases marcam dois e a quinase altamente relacionada, marca três, fosforilada. O MBP de dois peptídeos CRTC é incluído como um controle interno em todos os ensaios, pois contém muitos resíduos relacionados ao fosforil e corre a 18 kilodaltons em direção ao fundo do gel.

Isso permite uma interpretação da especificidade. Algumas quinases fosforilam de forma robusta um substrato e MVP. Digno de nota aqui é que os poços contendo GST sozinhos sempre purificam alguma atividade endógena da quinase.

Assim, sempre há fosforilação de fundo no ensaio. Embora isso não exclua que a fosforilação do substrato seja real, sugere que, no cenário in vitro, a quinase pode ser menos seletiva. É particularmente informativo incluir vários substratos de diferentes pesos moleculares para tirar conclusões sobre a especificidade do substrato da quinase.

Como a triagem é in vitro e níveis adicionais de complexidade ocorrem in vivo, uma quinase candidata deve ser validada em células. Por exemplo, uma quinase candidata pode ter a capacidade de fosforilar um substrato in vitro e não ser expressa no mesmo tipo de célula ou nas mesmas subcélulas de um compartimento que o substrato. Isso normalmente é feito usando silenciamento mediado por RNAi do candidato.

Também é possível realizar uma triagem secundária usando um mutante não relacionado ao fosforil do substrato para confirmar a especificidade.