Name: Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Descubra como identificar pares quinase-substrato usando triagem de alto rendimento com células de mamífero. Este método permite análise rápida da atividade de quinases em vias de sinalização celular.

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Este trabalho foi apoiado pela concessão NSERC 386634. Gostaríamos de agradecer aos membros do Laboratório Screaton para discussões úteis.

1. Preparação dos reagentes, placas, e Células <ol><li> Adicione 500 ml de tampão de lise: Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glicerofosfato, 5% de glicerol. Armazenar a 4 ° C. Imediatamente antes da utilização, adicionar 1 mM de ditiotreitol (DTT), 1 mM de fluoreto de fenilmetil sulfonil (PMSF), e 1 mM de vanadato de sódio. Após este passo, PMSF não é necessária em qualquer tampão de lavagem. </li><li> Adicione 20 ml de cinase 10X: Tris Buffer de 200 mM de pH 7,5, 50 mM beta-glicerofosfato (FW 216), vanadato de sódio a 2 mM. Da alíquota em tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C. Imediatamente antes de usar, adicionar DTT 5 mM. </li><li> Adicione 20 mL de tampão H-ATP 10x: 300 uM de adenosina trifosfato (ATP), 66 mM de MgCl2, 33 mM de MnCl 2. alíquota para tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C. </li><li> Adicione 100 ml de 2x dodecil sulfato de sódio (SDS) de tampão de lise: 1,5 g de base Tris, 20 ml de glicerol, 30 ml de H 2 O. Dissolver e ajustar o pH para 6,8 com HCl. Adicionar 40ml de SDS a 10%, ajustar o volume para 100 ml. Adicionar 25 mg de azul de bromofenol. </li><li> Spot 4 ul de 25 ng / uL do plasmídeo de expressão de mamífero que codificam uma cinase de GST-14 por poço em placas de conjuntos de 96 poços e as placas de etiqueta em conformidade. Seal e congelar placas a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> 1-2 dias antes da transfecção, as células HEK293T cultura em meio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM) + 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos numa incubadora a 37 ° C com CO 2 suplementado (final de 5%). Passage com tripsina e não permitir que o estoque para se tornar&gt; 80% confluentes durante a expansão. Um mínimo de 6 x 10 7 células são necessárias para a tela (aproximadamente 3 x 15 cm pratos de células HEK293T em 80% de confluência). </li></ol> 2. Transfecção Nota: Consulte a Figura 1 para um fluxograma de protocolo inteiro. <ol><li> Se placas contendo plasmídeos quinase foram congelados, descongele em temperatura ambiente umaND, centrifugar a 1900 xg durante 3 minutos para recolher a humidade no fundo dos poços. </li><li> Misturar 8,6 ml de meio de soro reduzido (por exemplo, meio OPTI-MEM), com 312,7 ul de reagente de transfecção à base de lípidos. Deixe descansar por 5 min. </li><li> Adicionar 10 ul de meio de soro reduzido para cada cavidade utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete. </li><li> Adiciona-se 10 uL por poço de reagente de forma a mistura de soro / transfecção reduzida a partir do passo 2.2 utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete. Deixe descansar por 20 a 45 min. </li><li> Ressuspender as células 293T em 7,5 x 10 5 células / ml em 80 ml ​​de DMEM completo. Adicionar 100 ul de suspensão de células (isto é, 7,5 x 10 4 células) por poço usando um distribuidor de líquido automático equipado com uma cassete de volume padrão. </li><li> Verifique poços sob o microscópio para distribuição uniforme de células e retornar à incubadora durante 24 h. </li></ol> 3. pulldown de GST-cinase <ol><li> Faça fresh: 4 mM de solução pervanadato por mistura de 60 ul de 0,2 M de vanadato de sódio, com 540 mL de H 2 O. Numa segunda mistura tubo de 2,7 mL de peróxido de 30% e 1,4 ml de PBS. Adicionar as duas soluções em conjunto e deixe descansar por 15 min antes do uso. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos (não utilizar um distribuidor de líquido automatizado uma vez que cria demasiada turbulência no poço) dispensar 2 ul de 0,25 M de CaCl2 em cada poço, seguido de 2,5 mL do pervanadato preparado no passo 3.1. Incubar cada placa a 37 ° C durante 10 min e, em seguida, colocar em gelo. </li><li> Prepare 35 ml de tampão de lise adicionando DTT, PMSF, e vanadato de sódio, tal como indicado na Seção 1 (Preparação de Reagentes). </li><li> Mantendo as placas em gelo, remover o meio de cada poço utilizando um aspirador de vácuo. Imediatamente adicionar 50 ul / poço de tampão de lise arrefecido em gelo utilizando um dispensador de líquido automático equipado com uma cassete de padrão. Deixe descansar 30 min em gelo para lise (opcional: pode parar por aqui, se necessário, por meio de selagem platE e armazenar a -80 ° C. Para continuar, placas de descongelamento no gelo). </li><li> Chapas giram a 1900 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Raspe células de cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e para transferir todos os conteúdos apropriadamente marcada placas de 96 poços de fundo em V. Chapas giram a 1900 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Durante a rotação, encher placas revestidas com glutationa (um para cada placa de 96 poços) com 100 ul / poço de tampão de lise arrefecido em gelo (sem adição de PMSF) como uma lavagem. Mantenha as placas no gelo. </li><li> Remover placas de fundo em V da centrífuga. Um de cada vez, inverter as placas de glutationa sobre uma pia para esvaziar a solução de lise e blot em uma toalha de papel. Transferir tampão de lise a partir das placas de fundo em V para as placas de glutationa por inclinação da placa e utilizando uma pipeta de canais múltiplos, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento no fundo. Cubra as placas e deixar em gelo durante mínimo 2 horas de se ligar. </li><li> Perto do fim do passo de ligação 2 h, preparar uma estação de trabalho radioactividade, assegurando tele precauções de segurança necessárias estão no lugar para o trabalho radioativo. Definir forno de hibridação a 30 ° C. </li><li> Preparar 200 ml de tampão de lise por adição de DTT e vanadato de sódio tal como indicado no ponto 1. PMSF não é necessária nesta fase. </li><li> Inverter as placas de glutationa sobre uma pia para sacudir a tampão de lise e blot em uma toalha de papel. Lavar os poços 3x com 100 ul de tampão de lise (sem adição de PMSF). Não deixe que os poços sentar seco - mantê-los na lavagem até que esteja pronto para prosseguir. </li><li> Preparar 55 ml de tampão de quinase 1x (KB) diluindo o estoque de 10x e adição de DTT, tal como indicado no ponto 1. Lavar as placas uma vez com 50 ul de 1x KB utilizando um dispensador de líquido automático equipado com uma cassete de volume padrão. Deixar 1x KB em poços até uma solução pronta é: <ol><li> Prepare a Solução A pela adição de 500 a 530 ug de o substrato de interesse, 500 ug de proteína básica de mielina (MBP), 2,65 ml de 10x KB, 13,25 ul de DTT 1 M, e H2O até 15,9 ml. </li></ol></li&gt; <li> Um de cada vez, inverter as placas sobre uma pia para remover 1x KB enxaguamento, seque sobre toalha de papel, e imediatamente adicionar 30 ul de uma solução utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete. Mantenha as placas no gelo. </li><li> Preparar a solução B na área de trabalho a radioactividade por adição de 2,5 ml de 10x H-ATP, 500 uCi de 32 P ATP gama-, e H 2 O a 10 ml. <ol><li> Adicionar 20 ul de solução B por poço utilizando uma pipeta de repetidor que auxilia na mistura, devido à força de ejecção. Cobrir e incubar em 30 ° C forno de hibridação durante 30 min. </li></ol></li><li> Após 30 minutos, a transferência de volta para as placas de gelo. Adicionar 50 ul de tampão de lise 2x SDS para cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Pode prosseguir neste ponto para a próxima etapa, ou selar as placas com folha de alumínio e armazenar a -20 ° C até conveniente. </li></ol> 4. corrida, coloração e géis de secagem Nota: Todo o trabalho deve ser realizado em uma área DESIGNAted para a radioactividade. <ol><li> Ligue forno de hibridação e ajustado para 85 ° C. Placas de descongelamento em temperatura ambiente. Uma vez forno atingiu a temperatura, placas de transferência para forno e incubar por 10 min para desnaturar amostras. </li><li> Carga 26 poços géis pré-moldados com 15 ul de cada reacção utilizando uma pipeta de canais múltiplos para preencher vários poços de uma só vez. Cuidados devem ser tomados para que todas as dicas alinhar com as correspondentes bem antes de adicionar amostras. Execute gel em 150 V. Não deixe que o corante de rastreio (linha azul) funcionar fora do fundo do gel como esta contém a ATP não incorporado. </li><li> Desmontar os géis e cortou a ATP não incorporado (linha azul), utilizando um bisturi ou borda reta como ele vai expor demais os filmes. Coloque os gels em recipientes rotulados e cubra com Coomassie mancha para 15 min. </li><li> Remover a mancha de Coomassie, brevemente enxaguar os géis com água, e adicionar destain solução. Destain os géis até que as proteínas são claramente visíveis. Uma banda para MBP e uma banda para o substrato deveser visível para cada amostra. </li><li> Para secar o gel: <ol><li> Corte uma folha grande de papel de filtro e coloque-o no secador. </li><li> Molhe uma folha de celofane em água destilada até que esteja lisa e sem rugas, e colocá-lo no topo do papel. </li><li> Coloque os géis em cima da folha de celofane, fazendo uma nota da ordem de géis. Molhar uma segunda folha de celofane e colocar na parte superior dos géis. </li><li> Rolar para fora todas as bolhas (um rolo de vedação placa funciona bem para isso) para uma superfície uniforme agradável. Fechar a aba, ligar o vácuo, e secar o gel durante 3 horas a 80 ° C. </li></ol></li><li> Uma vez géis estão secos, expô-los a filme XAR com um ecrã de intensificar o sinal. Enrole a fita com saran wrap ou um saco plástico e feche com fita adesiva para impedir a entrada de geada. Armazenar a cassete a -80 ° C durante a noite. </li></ol> 5. Desenvolver XAR Films <ol><li> No dia seguinte, remove cassete do congelador e deixar descongelar à temperatura ambiente. Desenvolver o filme emuma câmara escura usando um processador de filme de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Examinar os filmes para provas de pares quinase-substrato. Uma segunda exposição mais longa pode também ser útil para detectar eventos de fosforilação fracas. </li></ol>

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<li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li>
<li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Uma vez que as publicações originais que descrevem a abordagem 14,15, a biblioteca original de 180 GST-quinases foi ampliada para 420 membros, ou ~ 80% do kinome proteína humana. Com a biblioteca ampliada, o protocolo conforme descrito leva 4-5 dias e, em seguida, 1-4 dias para desenvolver filmes (como necessário), o que pode ser encurtado através da utilização de imagiologia com fósforo e o aumento do sinal digital. Há várias etapas-chave em que os cuidados devem ser tomados (veja a Figura <...

Proteína modificações pós-traducionais (PTMs) são essenciais para a comunicação intracelular. Talvez o melhor estudada de todas as PTMs fosforilação é catalisada por proteínas quinases, que regulam uma miríade de funções de proteínas, incluindo a sua actividade bioquímica, localização subcelular, conformação, e a estabilidade. A identificação de sítios de fosforilação de proteínas alvo pode ser realizada através de mapeamento triptico fosfopéptido ou por técnicas-padrão de proteómica agora utilizando amostras enriquecidas para péptidos fosforilados 1,2. Enquanto três quartos do proteoma expressas são esperados para ser fosforilada 3 e um identificado 200.000 locais de fosforilação 5, com estimativas de até 1 milhão de 6, muitos deles não têm atribuído biologia, via de sinalização, ou proteína quinase. Enquanto identificação de locais fosforilados é relativamente simples, uma comparativamente maior desafio éidentificar a cinase cognato (s) que tem como alvo estes locais, um processo que nos referimos como mapeamento de quinase: substrato pares. Várias abordagens para a identificação de quinase: substrato pares foram descritas, começando com uma quinase de interesse e procurando os seus substratos, ou a partir de um substrato de interesse e a tentativa de encontrar um modificador quinase 7-11 experimentalmente ou computacionalmente 12. Para identificar quinases para um substrato fosforilado conhecido, bioinformática pode ser usado para identificar proteínas que contêm uma sequência conservada curto de aminoácidos que flanqueiam o resíduo fosforilado (o local de consenso), bem como a identificação de quinases que formam um complexo com o substrato precipitável. No entanto, estas abordagens são demorados e muitas vezes não cumprem com sucesso. Nós desenvolvemos uma abordagem funcional sistemático para identificar rapidamente quinases que fosforilam pode um determinado substrato 13. O ensaio tela produz excelente específicodade, com a seleção muito clara para os potenciais quinases cognatas. Dada a centralidade da fosforilação de sinalização biológica, a tela é útil para a descoberta em praticamente todos os celulares vias de sinalização 14-16. A tela envolve a realização de um ensaio de quinase em larga escala com uma biblioteca de proteínas quinases humanos. As cinases foram marcados com glutationa bacteriano S-transferase (GST) de proteínas e são purificados a partir de extractos de células de mamíferos, o que significa que as enzimas recombinantes - ao contrário do que as preparadas a partir de bactérias - são gerados na presença das proteínas quinases a montante muitas vezes necessários para a enzimas recombinantes para ter actividade in vitro. Com efeito, enquanto que a actividade da cinase de serina, treonina e tirosina necessária para a activação a jusante de quinase estão presentes na levedura 10, o genoma da levedura codifica 122 cinases de proteína, indicando que o kinome de mamífero, com mais de 500 genes 17, tornou-se significativamente mais complexa, a fim de regulate os processos originais para os organismos de ordem mais elevada. Além disso, o efeito de diferentes estímulos relevantes para a biologia celular e doença humana (tal como pequenas moléculas, factores de crescimento, hormonas, etc.) podem ser usados ​​para modular a actividade de quinase 14,15 num contexto apropriado.

<table><tbody><tr><td>Tampão de lise</td><td>Feito em casa</td><td></td><td>Veja a etapa do protocolo 1.1</td></tr><tr><td>Tampão de quinase 10x</td><td>Feito em casa</td><td></td><td>Veja a etapa do protocolo 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Feito em casa</td><td></td><td>Veja a etapa do protocolo 1.3</td></tr><tr><td>Plasmídeos de quinase humana</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td> Placas de 96 poços marcados com <td>GST em casa</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>suplemento com 100&nbsp; U/ml de penicilina, 100&nbsp; &#956; g/ml de estreptomicina, soro fetal de bezerro a 10%.</td></tr><tr><td>Incubadora CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Meio de soro reduzido</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção à base de lipídios</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador de líquido automatizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Acessório de pequeno</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Acessório de padrão</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM de penetração</td><td>Feito em casa</td><td></td><td>Ver Protocolo passo 3.1</td></tr><tr><td>0,25 M CaCl2</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal (20-200 &#956; l)</td> <td>Pipeta multicanal Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>(1-10 &#956; l)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>placas de 6 poços com fundo em V</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços revestidas com glutationa</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>Substrato com etiqueta GST</td><td>Feito em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteína básica de mielina (MBP)</td><td>Pipeta Repetidora Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>32P gama-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x tampão de lise SDS (100&nbsp; ml)</td> <td>Feito em casa</td><td></td><td>Veja a etapa do protocolo 1.4</td></tr><tr><td>Géis TGX pré-moldados de 26 poços</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>A porcentagem de gel necessária depende do peso molecular do substrato de interesse</td></tr><tr><td>Coloração de Coomassie</td><td>Fabricado em casa</td><td></td><td>0,1% Coomassie R250, 10% ácido acético, 40% metanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Fabricado em casa</td><td></td><td>10% ácido acético, 20% metanol</td></tr><tr><td>Recipientes de gel rotulados</td><td>Feito em casa</td><td></td><td>Tampas de plástico usadas de caixas de pontas vazias, apenas grandes o suficiente para conter um gel</td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Folhas de celofane (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Secador de gel</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Filme de autorradiografia de emulsão dupla</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>de filme</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Tela intensificadora</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Rolo de borracha de vedação de placas</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de pares kinase-substrato utilizando high throughput screening

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Nós desenvolvemos uma plataforma de rastreio para identificar proteínas quinases específicas de substratos fosforilados humanos que podem ser utilizados para elucidar novas vias de transdução de sinal. A nossa abordagem apresenta a utilização de uma biblioteca de proteínas quinases humano marcado com GST purificada e um substrato da proteína recombinante de interesse. Usámos esta tecnologia para identificar MAP / microtúbulo-regulação afinidade quinase 2 (MARK2) como a quinase para um local regulada por glucose, em reguladas pela CREB transcricional coativador 2 (CRTC2), uma proteína necessária para a proliferação das células beta, assim como a família de tirosina-quinases Axl como reguladores de metástases de células por fosforilação da proteína adaptadora ELMO. Descrevemos essa tecnologia e discutir como ela pode ajudar a estabelecer um mapa abrangente de como as células respondem a estímulos ambientais.

Os resultados representativos de uma tela são mostrados na Figura 2. 180 quinases foram rastreadas utilizando um substrato de péptido marcado com GST correspondente aos aa 268-283 da CRTC2, bem como a proteína básica clássico ensaio de quinase substrato de mielina (MBP). Apenas duas cinases, MARK2 e o MARK3-quinase altamente relacionados com o peptídeo fosforilado CRTC2. MBP é incluído como um controlo interno em todos os ensaios, uma vez que contém muitos resíduos fosforilável e roda a...

A fosforilação de proteínas é uma característica central de como as células interpretam e respondem às informações em seu meio extracelular. Aqui, apresentamos um protocolo de triagem de alto rendimento usando quinases purificadas de células de mamíferos para identificar rapidamente quinases que fosforilam um (s) substrato (s) de interesse.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

O objetivo geral deste procedimento é identificar quinases que fosforilam um substrato de interesse utilizando métodos de triagem de alto rendimento. Isso é realizado primeiramente transfectando células com plasmídeos que expressam quinases FU como transferase de glutationa ou GST. O segundo passo é realizar um ensaio de precipitação com GST quinase.Em seguida, as amostras são carregadas nos géis, que são então eletroforéticos e corados com corante azul brilhante kumasi. O passo final é secar os géis e expô-los ao filme de autorradiografia. Finalmente, ao revelar e interpretar os filmes resultantes, é possível identificar pares de quinase-substrato, já que cada poço representa um ensaio de quinase distinto.Os métodos existentes para identificar uma quinase para um substrato fosforilado conhecido incluem o uso de abordagens bioinformáticas para buscar um sítio consenso no substrato, a detecção de complexos entre quinases e substratos utilizando técnicas bioquímicas e uma abordagem de tentativa e erro, e a busca por substratos consenso com base em suas funções biológicas conhecidas. Essas abordagens são demoradas e nem sempre obtêm sucesso. Nossa abordagem permite a identificação rápida de pares quinase-substrato com base em resultados funcionais.Quando tivemos pela primeira vez a ideia para este método, estávamos preocupados com a possibilidade de haver especificidade insuficiente in vitro. Na verdade, a especificidade do substrato é excelente, e frequentemente observamos que apenas quinases de membros da mesma família são capazes de fosforilar um determinado substrato na triagem. Isso é particularmente evidente quando realizamos multiplexação usando múltiplos substratos em cada triagem, demonstrando que o procedimento será Courtney, uma técnica do meu laboratório Inicie o procedimento com o preparo dos reagentes, placas e células conforme descrito no protocolo textual.Se as placas contendo os plasmídeos de cinase tiverem sido congeladas, descongele-as à temperatura ambiente e centrifugue a 1900 vezes G durante três minutos para recolher qualquer umidade no fundo dos poços. Misture 8,6 mililitros de meio com soro reduzido com 312,7 microlitros de reagente de transfeção baseado em lipídios e deixe a mistura repousar por cinco minutos em cada poço. Da placa de 96 poços contendo os plasmídeos de cinase, adicione 10 microlitros do meio com soro reduzido.Usando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de pequeno volume, adicione então 10 microlitros da mistura do reagente de transfeção em meio de soro reduzido por poço, utilizando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de pequeno volume, e deixe a placa repousar por 20 a 45 minutos. Em seguida, ressuspenda 2 93 T células a 0,75 milhão de células por mililitro em 80 mililitros de meio DMEM modificado completo ou meio DMEM, adicionando 100 microlitros da suspensão celular por poço. Usando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de volume padrão, verifique os poços ao microscópio para garantir distribuição uniforme das células antes de devolver a placa ao incubador a 37 graus Celsius por 24 horas.Para iniciar o experimento de precipitação por afinidade com GST quinase. Prepare uma solução de vanadato a quatro milimolares misturando 60 microlitros de vanadato de sódio 0,2 molar com 540 microlitros de água em um segundo tubo, misture 2,7 microlitros de peróxido a 30% e 1,4 mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS. Adicione as duas soluções juntas e deixe a mistura repousar por 15 minutos antes do uso.Usando uma pipeta multicanal, distribua dois microlitros de cloreto de cálcio 0,25 molar em cada poço, seguido por 2,5 microlitros da solução de fosfato de data comprovada. Incube cada placa a 37 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, coloque na gelo, mantendo as placas sobre gelo. Remova o meio de cada poço, usando um vácuo imediatamente com 50 microlitros por poço de tampão de lise frio.Usando um dispensador automático de líquidos equipado com o cassete padrão, deixe a placa repousar por 30 minutos sobre gelo para lisar. Após centrifugar as placas a 1900 × g por três minutos a quatro graus Celsius, raspe as células de cada poço utilizando uma pipeta multicanal e transfira todo o conteúdo para vbo devidamente rotulados. Placas de 96 poços: centrifugue as placas a 1900 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius; durante a centrifugação, preencha as placas revestidas com glutationa com 100 microlitros por poço de tampão de lise gelado.Como enxágue, mantenha as placas sobre gelo. Após a centrifugação das placas com fundo V, inverta as placas de glutationa sobre uma pia para remover o tampão de lise, agitando levemente e secando com um papel toalha. Transfira o tampão de lise das placas com fundo V para as placas de glutationa inclinando a placa e utilizando uma pipeta multicanal, tomando cuidado para não perturbar o pellet no fundo. Em seguida, cubra as placas e deixe em gelo por um mínimo de duas horas. Pouco antes do final do período de ligação de duas horas, prepare uma estação de trabalho com radioatividade, garantindo que as precauções necessárias de segurança estejam em vigor para trabalhos com materiais radioativos. Ajuste o forno de hibridização para 30 graus Celsius.Inverta as placas de glutationa sobre uma pia para remover o tampão de lise e seque em uma toalha de papel. Enxágue os poços três vezes com 100 microlitros de tampão de lise sem PMSF. Não deixe os poços secarem.Mantenha-os na solução de lavagem até o momento de prosseguir. Em seguida, prepare 55 mililitros de tampão de quinase 1 X ou 1x KB conforme descrito no protocolo do texto. Adicione 50 microlitros de 1x KB a cada poço da placa usando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de volume padrão.Em seguida, prepare a solução A fazendo uma solução contendo o substrato de interesse e a proteína básica da mielina ou MVP conforme detalhado no protocolo textual, um de cada vez. Inverta as placas sobre uma pia para remover o lavado de um XKB em uma toalha de papel e adicione imediatamente 30 microlitros da solução A usando um dispensador automático de líquidos equipado com um cassete de pequeno volume. Mantenha as placas sobre gelo.Em seguida, prepare a solução B na área de trabalho com radioatividade conforme descrito no protocolo do texto, utilizando 20 microlitros da solução B por poço. Usando uma pipeta repetidora, que auxilia na mistura devido à força de ejeção, cubra e incube a placa em um forno de hibridização a 30 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, transfira as placas de volta para o gelo.Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de lise de dodecil sulfato de sódio a duas vezes ou SDS a cada poço utilizando uma pipeta multicanal. Todo o trabalho nesta seção deve ser realizado em uma área designada para atividade radioativa. Ligue o forno de hibridização e ajuste-o para 85 graus Celsius.Uma vez que o forno tenha atingido a temperatura, transfira as placas para o forno e incube por 10 minutos para desnaturar as amostras. Em seguida, carregue géis pré-moldados de 26 poços com 15 microlitros de cada reação.Usando uma pipeta multicanal para preencher vários poços ao mesmo tempo, é necessário ter cuidado para que todas as ponteiras estejam alinhadas com os respectivos poços. Antes de adicionar as amostras, execute o gel a 150 volts. Não permita que a linha azul saia pela parte inferior do gel, pois ela contém o ATP não incorporado. Em seguida, desmonte os géis e remova o ATP não incorporado, pois isso escurecerá a exposição do gel nos filmes.Coloque os géis em recipientes etiquetados e cubra com o corante kumasi por 15 minutos. Em seguida, remova o corante kumasi. Enxágue brevemente os géis com água e adicione a solução de descoragem.Retenha os géis até que as proteínas sejam claramente visíveis. Uma faixa para MVP e uma faixa para o substrato devem ser visíveis em cada amostra. Para secar os géis, corte uma folha grande de papel filtro e coloque-a no secador.Umedeça uma folha de celofane em água destilada até que fique lisa e sem rugas e coloque-a sobre o papel. Coloque os géis sobre a folha de celofane, anotando a ordem dos géis. Umedeça uma segunda folha de celofane e coloque-a sobre os géis.Alise todas as bolhas para obter uma superfície uniforme. Feche a aba, ligue o vácuo e seque os géis por três horas a 80 graus Celsius. Uma vez que os géis estejam secos, exponha-os a um filme de auto-radiografia de emulsão dupla utilizando uma tela para intensificar o sinal.Envolva o cassete com filme plástico ou um saco plástico e feche com fita adesiva para evitar a formação de gelo antes de armazenar o cassete a menos 80 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, retire o cassete do congelador e deixe descongelar à temperatura ambiente. Revele o filme em um local escuro usando um processador de filmes, conforme as instruções do fabricante indicadas.Aqui estão resultados representativos de uma triagem na qual 180 quinases foram analisadas usando um substrato peptídico com marcação GST correspondente aos aminoácidos de 268 a 283 do coativador transcricional regulado por Krebs dois, ou CRTC dois, bem como o substrato clássico para ensaio de quinase, a proteína básica da mielina ou MBP apenas dois. As quinases mark dois e a quinase altamente relacionada, mark três, foram fosforiladas. O peptídeo CRTC dois MBP é incluído como controle interno em todos os ensaios, pois contém muitos resíduos passíveis de fosforilação e migra a 18 quilodaltons, na parte inferior do gel.Isso permite uma interpretação da especificidade. Algumas quinases fosforilarão robustamente um substrato e a MVP. É importante observar que as poças contendo GST isoladamente purificam sempre alguma atividade quinase endógena.Assim, há sempre uma fosforilação de fundo no ensaio. Embora isso não descarte a possibilidade de a fosforilação do substrato ser real, sugere que, em condições in vitro, a quinase pode ser menos seletiva. É particularmente informativo incluir múltiplos substratos com diferentes pesos moleculares para tirar conclusões sobre a especificidade da quinase em relação aos substratos.Como a triagem é realizada in vitro e níveis adicionais de complexidade ocorrem in vivo, uma quinase candidata deve ser validada em células. Por exemplo, uma quinase candidata pode ter a capacidade de fosforilar um substrato in vitro, mas não estar expressa no mesmo tipo celular ou nas mesmas subcélulas de um compartimento que o substrato. Isso é geralmente feito utilizando o silenciamento mediado por RNAi do candidato.Também é possível realizar uma tela secundária utilizando um mutante não fosforilável do substrato para confirmar a especificidade.

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