Name: Técnicas Experimentais e de imagem para o exame de Estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes Unidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprenda a analisar estruturas anormais de coágulos em diabetes e anemia falciforme usando microscopia confocal. Este método avalia taxas de fibrinólise em coágulos glicados e normais.

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Os autores gostariam de agradecer ao Lam Lab da Georgia Tech por muitas discussões úteis no desenvolvimento dos ensaios experimentais. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número K01HL115486 e pelo New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 do Gabinete do Diretor, Institutos Nacionais de Saúde. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

NOTA: O protocolo a seguir segue as diretrizes estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) no Georgia Tech. 1. Coleta de Sangue e Blood Red isolamento de células Procedimento <ol><li> Recolha 40-120 ml de sangue de doadores em 10 ml tubos Vacutainer contendo heparina. Comece PBMC (célula mononucleated sangue periférico) isolamento dentro de 4 horas da coleta. Durante este tempo, manter o sangue à temperatura ambiente. NOTA: O armazenamento / N de sangue na RT ou em 4 ° C não é recomendada como isso irá resultar em menor rendimento PBMC. </li><li> Dilui-se todo o sangue 1: 1 em arrefecido em gelo (4 ° C) PBS estéril. </li><li> Pipetar 10 ml de gelado polissacarídeo hidrofílico em um, estéril tubo de 50 ml vazio. Suavemente transferir sangue total diluído em cima do polissacárido hidrófilo. </li><li> Usar uma pipeta de 25 ml no ajuste lento e sangue pipeta ao longo do lado do tubo muito lentamente. Certifique-se de que o sangue não é misturado com o sacárido antes centrifugation porque o polissacárido hidrófilo é tóxico para as células e de outro modo, o rendimento de PBMC será menor. </li><li> Centrifugar as amostras de sangue durante 30 minutos a 400 xg, a 4 ° C. Se disponíveis, reduzir a velocidade do travão da centrífuga para metade do máximo para uma melhor separação, após a centrifugação. </li><li> Aspirar fora da fracção de plasma / plaquetas da amostra de sangue centrifugado. Aspirar cuidadosamente a camada hidrofílica polissacarídeo diretamente acima da camada RBC lotado. </li><li> Recolha 8-10 ml de concentrado de eritrócitos e diluir 1: 1 com unsterile 0,9% NaCl salina. </li></ol> 2. microscopia confocal de Avaliação de Estruturas glicada Clot (simulado diabéticos coágulos) <ol><li> Descongelar o fibrinogénio humano marcado com fluorescência e conjugado de fibrinogénio humano a 37 ° C. </li><li> Pipeta a seguinte em um 0,5 ml graduada tubo de microcentrífuga. <ol><li> Para os saudáveis, coágulos normais de fibrinogênio, misturar fibrinogénio humano com 10% fluorescente etiquetado fibrinogénio humanoconjugado em tampão Tris 50 mM / NaCl 100 mM a uma concentração de 5 mg / ml. </li><li> Para o fibrinogénio glicada artificialmente (para simular a formação de coágulos diabéticos), incubar fibrinogénio humano e 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio numa solução 5 mM de glucose dissolvida em mM Tris / NaCl 100 mM para 50 a consequente concentração de 6,8 mg / ml. </li></ol></li><li> Cubra os tubos micro-centrífuga, usando um material opaco para evitar a exposição à luz. Incubar os tubos num banho de água a 37 C ° durante 48 h. </li><li> Faça uma câmara em uma lâmina de microscópio de vidro por aposição de um adesivo fino em 2 lados do slide. </li><li> Após o período de incubação de 48 horas, para preparar reagentes e a formação de fibrina por trombina e descongelação FXIIIa alfa humano à TA. </li><li> Diluir FXIIIa a 80 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM. </li><li> Dilui-se a trombina a 4 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM. <ol><li> Para coágulos normais, garantir que as concentrações finais de fibrinogênio, FXIIIa, e trombina são 2,5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, em um volume de 50 ul. </li><li> Para os coágulos glicada, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 3,4 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul. </li></ol></li><li> Imediatamente pipeta 30 ul da solução de fibrina para dentro da câmara formada pelo adesivo. </li><li> Coloque um 22 milímetros x 22 mm deslizamento tampa de vidro com espessura de 0,15 mm no topo das duas camadas de adesivo. Selar os lados abertos com adesivo transparente para evitar que o coágulo de fibrina de secar. Certifique-se de que o adesivo não interage com o coágulo de fibrina. </li><li> Permitir que os coágulos de fibrina para polimerizar a 21-23 ° C por 2 horas antes de imagem confocal. </li><li> Tome imagens de microscopia confocal dos coágulos usando um microscópio confocal com uma lente de 40x / 1,30 Oil M27 com 488 nm laser de argônio. </li></ol> 3. microscopia confocal Avaliação de fibrina coágulos que contêm apenas hemácias de foice Pacientes Celulares <ol><li> Descongelar o fibrinogénio humano marcado com fluorescência e conjugado de fibrinogénio humano a 37 ° C. </li><li> Pipeta a seguinte em um 0,5 ml graduada tubo de microcentrífuga. <ol><li> Para o saudável, coágulo de fibrina normais, misturar fibrinogénio humano com 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio humano num tampão mM de NaCl 50 mM de Tris / 100 a uma concentração de 5 mg / ml. </li><li> Para os coágulos que contêm eritrócitos SCD, misturar fibrinogénio humano e 10% de conjugado marcado com fluorescência fibrinogénio humano em tampão Tris 50 mM / NaCl 100 mM, de tal modo que a concentração resultante do fibrinogénio é de 10 mg / ml. </li></ol></li><li> Rotular as hemácias isoladas (normais e as de doentes falciformes obtidos a partir do protocolo de isolamento RBC), utilizando uma solução de marcação celular. <ol><li> Suspender as células a uma densidade de 1 x 10 6 por ml em qualquer meio de cultura isento de soro escolhido. </li><li> Adicionam-se 5 ul / ml de suspensão de células para a solução de marcação celular. Misture bem por pipetagem suave suavemente. </li><li incubar durante min a c.><li> Centrifugar os tubos de suspensão rotulados a 1.500 rpm durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e re-suspender suavemente as células em meio de 37 ° C. </li><li> Repita o procedimento de lavagem (3.3.4 e 3.3.5) mais duas vezes. </li></ol></li><li> Diluir FXIIIa a 80 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM. </li><li> Dilui-se a trombina a 4 U / ml em tampão de CaCl 2 5 mM. <ol><li> Para a formação de coágulos normais, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 2,5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul. </li><li> Para os coágulos que contêm eritrócitos SCD, assegurar que as concentrações finais de fibrinogénio, FXIIIa, e trombina são de 5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, respectivamente, a um volume de 50 ul. </li></ol></li><li> Pipetar 10 ul de hemácias marcadas para a solução de fibrina. Pipeta 30 ul da fibrina com hemácias no vidro do microscópio (consulte a deslizar preparação para glcoágulos ycated). </li><li> Permitir que a fibrina para polimerizar a 21-23 ° C durante 2 h antes de imagem confocal. </li><li> Tome imagens confocal dos coágulos usando o microscópio confocal, e utilizar lasers de excitação com comprimentos de onda de 488 nm e 633 nm para excitar a fibrina marcado por fluorescência e hemácias. </li></ol> 4. Avaliação da microscopia confocal Fibrinolysis Tarifas em glicada Estruturas Clot <ol><li> Repita o protocolo de microscopia confocal de coágulos glicada (Protocolo Etapa 2) para a avaliação da taxa de fibrinólise em coágulos glicada. </li><li> Não selar as extremidades da câmara com adesivo transparente. Permitir que os coágulos de fibrina que polimerizam durante 1,5 h a 21-23 ° C num invólucro selado contendo 250 ml de água para evitar a desidratação. </li><li> Após a polimerização, obter imagens dos coágulos usando o microscópio confocal. </li><li> Pipeta plasmina dentro da extremidade aberta da câmara e dispersar a plasmina através do coágulo através da acção capilar. <ol><li> Paraas experiências normais e fibrinólise glicada com concentrações normais, de pipeta 25 ul a 200 ug / ml de plasmina para a abertura da câmara. </li><li> Para os coágulos glicada com concentrações reduzidas, pipeta 25 ul a 50 ug / ml para a abertura da câmara. </li></ol></li><li> Use o recurso de série de tempo (veja a Figura 1) no software microscópio confocal para capturar em tempo real imagens de vídeo do plasmina lise do coágulo. <ol><li> Clique em modo de aquisição e, em seguida, selecione "Séries Temporais". Selecione o número de ciclos e do intervalo de tempo de gravação. </li></ol></li></ol> 5. Cálculo Fibrinólise Rates <ol><li> Determinar a taxa de lise, definindo uma área (2.500 mm 2) e calculando o tempo decorrido necessário para dissolver uma área fixa do coágulo. Calcula-se a taxa de lise utilizando a seguinte equação (Figura 2): <img alt="Equação 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52019/52019eq1.jpg" files ftp_upload></li></ol> 6. Análise Estatística da fibrinólise Rates <ol><li> Analisar os dados de lise usando o software de análise estatística. Realize uma análise de variância one-way e um post hoc teste de Tukey-Kramer 44,45. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Para obter dados significativos sobre a estrutura de mecanismos de coagulação em estados de doença, é importante isolar os factores implicados na coagulação para determinar os efeitos das proteínas e células nestas condições. Este protocolo foi desenvolvido para os efeitos da análise da estrutura de coágulo de fibrina em estados diabéticos e DF in vitro. É necessário compreender os mecanismos envolvidos na formação de fibrina e fibrinólise em estados de doença, desde condições alter...

Lesão de revestimento endotelial de um vaso sanguíneo é reparada através da resposta hemostática, ou a formação de um coágulo de sangue. Quando o sangue penetra na matriz extracelular, os factores de tecidos activar as plaquetas do sangue que facilitam a iniciação da cascata de coagulação. O componente mecânico chave deste processo de cicatrização é a matriz de fibrina, composto de fibras de fibrina que são altamente elástico, e pode suportar grandes forças de 1-4. Muitos pesquisadores têm estudado a estrutura de formação e função de fibrina extensivamente nas últimas décadas 13/05. Pacientes com doenças como diabetes mellitus e falciforme têm um risco aumentado de desenvolvimento de complicações trombóticas, tais como infarto do miocárdio, doença isquêmica do coração e acidentes vasculares cerebrais 14-19. Mais de 2 milhões de pessoas são diagnosticadas com diabetes mellitus a cada ano nos Estados Unidos. Existem dois tipos de diabetes: Tipo I, onde ocorpo não consegue produzir quantidades adequadas de insulina, e Tipo II, em que o corpo se torna resistente à insulina. Nos pacientes com diabetes, doença cardiovascular (DCV) é a causa de 80% da morbidade e mortalidade associadas com a doença 20,21. A doença falciforme (SCD) é uma desordem genética do sangue que afeta mais de 100 mil pessoas nos Estados Unidos 22. SCD é uma doença ponto de mutação que faz com que as células vermelhas do sangue para se tornar em forma de crescente, fazendo com que seja difícil para as células que passam através da vasculatura sanguínea 23. Ambos os estados de doença aumentar as possibilidades de desenvolver condições aterotrombóticas no corpo. Uma das razões para isso é o resultado da estrutura da fibrina alterada e função em estados doentes 14,24-26. Em ambas as diabetes e doença das células falciformes, há um estado de hipercoagulabilidade e hipofibrinólise actividade que induz a aterotrombose e doença cardiovascular (CVD), em comparação com pacientes saudáveis ​​17,27,28. Sabe-se que hipofibrinólise promove a progressão da aterosclerose e gera eventos isquêmicos recorrentes para os pacientes com doença arterial coronariana prematura 29. No manuscrito atual, nós investigamos o papel das propriedades físicas de fibrina neste cenário particular. Estruturas de coágulos de fibrina em pacientes não-doentes são compostas por fibras finas, poros de maiores dimensões, e geralmente menos densa 14,24. O aumento da porosidade e coágulos de fibrina menos densas em pacientes saudáveis, foram encontrados para facilitar a fibrinólise 16. Em condições hyperthrombotic tais como a doença de células falciformes e diabética, há um aumento na produção de fibrinogénio, fazendo com que a concentração de fibrinogénio a partir de aumentar os níveis normais de 2,5 mg / ml em pacientes saudáveis ​​30-33. Coágulos de fibrina formados em pacientes diabéticos têm sido encontrados para ser menos poroso, mais rígida, têm mais pontos de ramificação, e mais denso quando comparado com saudável, não-diâmpacientes Bética 14,24,33-35. A estrutura de fibrina é alterada um resultado de glicação de mecanismos que ocorrem nas proteínas envolvidas na formação do coágulo. Não enzimática (irreversível) glicação ocorre quando as moléculas de glicose se ligar a resíduos de lisina na molécula de f ibrinogénio, que inibe XIIIa factor humano (FXIIIa) de glutamina e lisina apropriadamente de reticulação 33,36,37. A análise estrutural de redes de fibrina tem sido extensivamente estudado recentemente. Em particular, os pesquisadores utilizaram microscopia eletrônica e reconstrução 3D de redes de fibrina 38, investigou como ambas as células e extravasculares (fibroblastos e do músculo liso) intravascular (células endoteliais) afetam a estrutura da fibrina 39, viscoelástico utilizados e análise espectral para analisar estruturas de fibrina 40, e correlações desenvolvidos entre a estrutura da fibrina e propriedades mecânicas usando experimental e computacional se aproxima 41 </sup&gt;. O foco do estudo foi a formulação de estruturas coágulo em condições trombose célula diabética e foice simulados e usar microscopia confocal para análise da estrutura e função dos coágulos nos estados doentes. Coágulos de fibrina foram formados a partir de fibrinogénio humano, trombina humana, e FXIIIa. Os coágulos foram lisadas utilizando plasmina. Para simular condições diabéticas, o aumento da concentração de fibrinogénio foi incubada em solução de glicose para induzir in vitro fibrinogénio glicação. Para simular a doença de células falciformes condições de coagulação, o aumento da concentração de fibrinogênio foram misturados com hematócrito falciforme coletadas de pacientes como feito anteriormente pelo nosso grupo 42. Estes métodos foram usados ​​para examinar a estrutura e as funções envolvidas na formação do coágulo de fibrina e fibrinólise sob condições de doença, bem como os mecanismos que induzem a DCV. Com base em informações atuais sobre essas doenças, as estruturas do coágulo de fibrina glicada foram mais denso com menos umnd poros menores. Os coágulos de fibrina com hemácias de pacientes com anemia falciforme (hemácias) também eram mais densas e exibido agregação das hemácias e aglomerados de fibrina aglomeradas. Este é um fenômeno bem estabelecido que tenha sido determinado anteriormente 43. Também foi levantada a hipótese de que a taxa de fibrinólise seria significativamente menor nos coágulos de fibrina glicada com e sem plasmina reduzida em comparação com saudável, normal, de fibrina. Os resultados mostraram que, para a formação de coágulos de fibrina glicada, resultados significativamente diferentes taxas de lise foram observados apenas sob condições de baixa concentração de plasmina. Esta técnica experimental utilizando microscopia confocal oferece vantagens significativas sobre outros métodos de imagem, porque as células e proteínas permanecem no seu estado nativo, que permite a captação de vídeo em tempo real da actividade de coagulação. Este método de coagulação sinteticamente indutor também é mais barato e mais eficiente do que o tempo de obtenção de amostras de pacientes e filtrar indivíduoproteínas e enzimas. Além disso, utilizando proteínas e enzimas separados para sintetizar a formação de coágulos, os coágulos foram normalizados de modo que não existe variabilidade entre as amostras, como resultado de outras proteínas do plasma.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque (polissacarídeo hidrofílico)</td> <td>GE Healthcare</td><td>45-001-749</td><td></td></tr><tr><td>Tubos vacutainer heparinizados de 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>Laboratórios de Pesquisa de Enzimas</td><td>de Fibrinogênio Humano</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 conjugado de fibrinogênio humano</td><td>Sondas Moleculares</td><td>F13191</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga graduado de 0,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Glicose em pó</td><td>Life Technologies</td><td>15023-02</td><td></td></tr><tr><td>FXIIIa</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VIS Microscópio Confocal</td><td>Zeiss LSM 510</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>50 mM Tris</td><td>Lonza</td><td>S50-642</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio (CaCl2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de marcação de células Vybrant DiD</td><td>Life Technologies</td><td>L7781</td><td></td></tr><tr><td>Plasmin</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (5 M NaCl)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Software de modelagem estatística</td><td>IBM</td><td>SPSS Statistics 22</td><td></td></tr></tbody></table>

técnicas experimentais e de imagem para o exame de estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes unidos

Experimental and Imaging Techniques for Examining Fibrin Clot Structures in Normal and Diseased States

A fibrina é uma proteína da matriz extracelular responsável por manter a integridade estrutural dos coágulos sanguíneos. Muitas pesquisas foram feitas sobre a fibrina nos últimos anos para incluir a investigação da síntese, estrutura-função e lise de coágulos. No entanto, ainda há muito desconhecido sobre as características morfológicas e estruturais dos coágulos que resultam de pacientes com doença. Neste estudo de pesquisa, são apresentadas técnicas experimentais que permitem o exame de diferenças morfológicas de estruturas anormais de coágulos devido a estados de doença, como diabetes e anemia falciforme. Nosso estudo se concentra na preparação e avaliação de coágulos de fibrina, a fim de avaliar diferenças morfológicas usando vários ensaios experimentais e microscopia confocal. Além disso, também é descrito um método que permite o cálculo contínuo e em tempo real das taxas de lise em coágulos de fibrina. As técnicas aqui descritas são importantes para pesquisadores e clínicos que buscam elucidar patologias trombóticas comórbidas, como infartos do miocárdio, doença isquêmica do coração e acidente vascular cerebral em pacientes com diabetes ou doença falciforme.

Microscopia Confocal Análise de glicada fibrina Coágulo Estruturas As imagens de microscopia confocal de coágulos normais e glicadas são apresentados na Figura 3. A análise por microscopia confocal dos coágulos normais e glicada revela que a formação de coágulos glicada são mais densos com poros mais pequenos do que os coágulos normais ambos com e sem a adição de FXIIIa coágulo durante a polimerização. Na Figura 3A e 3B, não é uma concentraç...

Neste manuscrito, são apresentadas técnicas experimentais, incluindo preparação de sangue, microscopia confocal e análise da taxa de lise, para examinar as diferenças morfológicas entre estruturas normais e anormais do coágulo devido a estados doentes.

Técnicas Experimentais e de imagem para o exame de Estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes Unidos

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on ...

O objetivo geral deste procedimento é examinar as diferenças morfológicas nas estruturas anormais do coágulo que ocorrem no diabetes e na anemia falciforme, condições de doença para coágulos diabéticos simulados. Isso é feito por meio de imagens de estruturas de coágulos glicados por microscopia confocal para amostras de sangue de pacientes falciformes. Os coágulos de fibrina contendo glóbulos vermelhos são visualizados em tempo real confocal.A análise microscópica pode então ser realizada para avaliar as taxas de fibrinólise nas estruturas normais e glicadas do coágulo. Em última análise, essa análise em tempo real pode ser usada para avaliar as diferenças morfológicas que ocorrem em estruturas anormais de coágulos em resposta aos estados de doença em que surgem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da trombose e hemostasia, como Como as estruturas do coágulo de fibrina são diferentes em pacientes com diabetes ou doença falciforme.Avaliar coágulos diabéticos simulados por microscopia confocal, primeiro descongele o fibrinogênio humano e o conjugado de fibrinogênio humano marcado com fluorescência a 10% a 37 graus Celsius quando as soluções de fibrinogênio humano aquecido misturadas ao fibrinogênio humano e o conjugado de fibrinogênio em uma solução de cloreto de sódio trics de glicose e incube a solução protegida da luz em banho-maria a 37 graus Celsius por 48 horas. Perto do final da incubação, use um adesivo não líquido para fixar um adesivo fino nos dois lados de uma lâmina de microscópio de vidro para fazer uma câmara, depois misture uma solução de fibrinogênio com fator de temperatura ambiente 13 e trombina até um volume final de 50 microlitros e transfira imediatamente 30 microlitros da solução de fibrina para a câmara da lâmina do microscópio. Agora coloque uma lamínula de vidro de 22 por 22 milímetros com uma ponta de 15 milímetros de espessura em cima do adesivo e sele os lados abertos da câmara com adesivo transparente, tomando cuidado para que o adesivo não interaja com o coágulo.Deixe os coágulos de fibrina polimerizarem a 21 a 23 graus Celsius por duas horas. Em seguida, adquira imagens de microscopia confocal dos coágulos usando uma objetiva de 40 x e um laser de argônio de 488 nanômetros para avaliar coágulos de pacientes falciformes. Primeiro dilua a amostra de glóbulos vermelhos a 1 milhão de células por mililitro em meio de cultura de células livres de soro e misture as células com cinco microlitros da solução de marcação celular apropriada por pipetagem suave.Após 20 minutos a 37 graus Celsius, lave as células três vezes em meio a 37 graus Celsius enquanto as células estão na centrífuga, misture a solução de fibrinogênio recém-preparada, fator 13 e trombina, como acabamos de demonstrar. Em seguida, transfira 10 microlitros dos glóbulos vermelhos marcados para a solução de fibrina e dispense imediatamente 30 microlitros da solução celular em uma câmara adesiva. Em uma lâmina de microscópio de vidro, permita que a fibrina polimerize a 21 a 23 graus Celsius após duas horas, adquira imagens confocais dos coágulos usando lasers de excitação com comprimentos de onda de 488 nanômetros e 633 nanômetros para excitar a fibrina e os glóbulos vermelhos marcados com fluorescência, respectivamente.Para avaliar as taxas de fibrinólise e as estruturas dos coágulos glicados, primeiro prepare os coágulos glicados, como acabamos de demonstrar desta vez. No entanto, depois de dispensar a solução de coágulo de fibrina na câmara adesiva, não sele as extremidades da câmara. Em vez disso, permita que os coágulos polimerizem de 21 a 23 graus Celsius em um invólucro selado contendo 250 mililitros de água para evitar a desidratação.Após uma hora e meia, adquira imagens dos coágulos por microscopia confocal, conforme demonstrado. Em seguida, pipete 25 microlitros de plasmina na extremidade aberta da câmara e permita que a plasmina se disperse por todo o coágulo por ação capilar. Por fim, abra os recursos de séries temporais do software do microscópio confocal, clique no modo de aquisição e selecione séries temporais.Em seguida, selecione o número de ciclos e o intervalo de tempo de gravação para capturar imagens de vídeo em tempo real da lise do coágulo induzido por plasmina A análise de coágulos normais e glicados revela que os coágulos glicados são mais densos com poros menores do que os coágulos normais, com e sem a adição do fator 13 durante a polimerização do coágulo. De fato, nos coágulos glicados da ONU, há uma concentração de fibrina mais baixa, o que cria uma estrutura menos densa do que a observada nos coágulos glicados, que contêm uma concentração de fibrina mais alta. Os coágulos de fibrina de pacientes falciformes contêm glóbulos vermelhos e exibem estruturas mais densas do que as de coágulos de fibrina saudáveis devido a um aumento da concentração de fibrinogênio nesses indivíduos.Além disso, a tendência natural dos glóbulos vermelhos de pacientes falciformes de formar agregados e gêneros, aglomerados de glóbulos vermelhos que se entrelaçam na rede de fibrina, resultando na formação de estruturas de coágulos aberrantes que são marcadamente diferentes em morfologia daquelas observadas em pacientes normais. Finalmente, a análise das taxas de fibrinólise de coágulos normais versus glicados demonstra uma capacidade significativamente prejudicada dos coágulos diabéticos simulados de lir a fibrina na ausência de plasmina suficiente. Esta pesquisa ajudará a pavimentar o caminho para pesquisadores no campo da trombose e hemostasia, especialmente para pacientes que desenvolvem patologias comórbidas como resultado de doença falciforme e diabetes.

experimental-imaging-techniques-for-examining-fibrin-clot-structures

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Kim, D., et. al. Imagem fluorescente combinada de infravermelho próximo e microtomografia computadorizada para visualização direta de tromboêmbolos cerebrais. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a visualização de trombos cerebrais em camundongos usando imagens de microtomografia computadorizada (micro-CT). Um modelo de camundongo tromboso cerebral é injetado com nanopartículas de ouro direcionadas à fibrina que atuam como um agente contrastante. O mouse é colocado na cama de uma...

Visualização de um trombo cerebral em um camundongo usando imagens de microtomografia computadorizada

Foram utilizadas técnicas de microscopia e processamento de imagem com lapso de tempo para observar e analisar a compactação de gel mediada por fibroblasto e o realinhamento da fibra fibrina em um bioreator ambientalmente controlado durante um período de 48 horas.

Observando e quantificando compactação de gel de fibrina mediada por fibroblasto

Este protocolo descreve a aplicação de tomografia combinada fluorescente no infravermelho próximo (NIRF) e imagiologia de micro-computadorizada (microCT) para visualizar tromboêmbolos cerebral. Esta técnica permite a quantificação da carga de trombo e evolução. A técnica de imagem NIRF visualiza fluorescente etiquetado trombo no cérebro extirpado, enquanto que a técnica microCT visualiza trombo no interior de animais vivos usando ouro-nanopartículas.

Combinada Near-infrared imagens fluorescentes e tomografia Micro-computado para Diretamente Visualizando Cerebral tromboêmbolos

Este trabalho descreve um método baseado em microscopia de fluorescência para o estudo da adesão, disseminação e secreção de plaquetas sob fluxo. Esta plataforma versátil permite a investigação da função plaquetária para pesquisas mecanicistas sobre trombose e hemostasia.

Imagens de células vivas de degradação e secreção de plaquetas sob fluxo

Aqui apresentados são dois métodos que podem ser usados individualmente ou em combinação para analisar o efeito da beta-amiloide na estrutura do coágulo de fibrina. Incluído é um protocolo para criar um em vitro coágulo de fibrina, seguido pelo coágulo turbidez e microscopia eletrônica métodos.

Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica

Apresentamos um modelo de doença vascular in vitro para investigar interações sanguíneas inteiras com o endotélio derivado do paciente. Este sistema permite o estudo de propriedades trombogênicas das células endoteliais primárias em várias circunstâncias. O método é especialmente adequado para avaliar em trombogenicidade situ e terapia anticoagulação durante diferentes fases de coagulação.

Modelo de doença microfluida in vitro para estudar interações endoteliais de sangue inteiro e dinâmica do coágulo sanguíneo em tempo real

A fibrina é responsável pela formação de coágulos durante a hemostasia e trombose. Ensaios de turbidez e tromboelastograhy (TEG) podem ser utilizados como ferramentas sinérgicas que fornecem avaliação complementar de um coágulo. Essas duas técnicas juntas podem dar mais informações sobre como as condições de coagulação afetam a formação de coágulos fibrinas.

Alavancando a Turbidez e a Tromboelastografia para Caracterização Complementar do Coágulo

O presente protocolo descreve como usar uma lesão mediada por FeCl3 para induzir trombose arterial e como coletar e preparar amostras de lesão arterial em vários estágios da trombose para análise por microscopia eletrônica.

Trombose Arterial Induzida por Cloreto Férrico e Coleta de Amostras para Análise de Microscopia Eletrônica 3D

Este estudo descreve um método rápido e eficaz para a análise de componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais através da dissolução de coágulos, coloração celular e exame de sangue de rotina.

Uma abordagem abrangente para analisar os componentes celulares de coágulos sanguíneos cerebrais

Os ensaios de trombólise in vitro muitas vezes têm lutado para replicar as condições in vivo, seja no trombo modelo que está sendo digerido ou no ambiente em que a trombólise está ocorrendo. Aqui, exploramos como o acoplamento do loop de Chandler e do ensaio de fibrinólise de fluxo fluorométrico em tempo real (RT-FluFF) é usado para monitoramento de lise de coágulo de alta fidelidade, ex-vivo.

Rastreamento da fibrinólise de coágulos sanguíneos totais formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento em um modelo de trombólise in vitro

Este trabalho descreve um ensaio microfluídico que utiliza o estresse de cisalhamento para desencadear a formação de trombos no sangue e caracteriza o trombo por múltiplas dimensões de leitura. O ensaio pode medir a tendência protrombótica de amostras de sangue e, portanto, é útil no diagnóstico de doenças, descoberta de fármacos, bem como em estudos mecanicistas básicos relacionados à trombose.

Ensaio de Perfil de Trombo: Uma Plataforma Baseada em Microfluídica para Caracterização Abrangente da Trombogênese Biomecânica

Aprenda a analisar estruturas anormais de coágulos em diabetes e anemia falciforme usando microscopia confocal. Este método avalia taxas de fibrinólise em coágulos glicados e normais.

Técnicas Experimentais e de imagem para o exame de Estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes Unidos

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