Técnicas Experimentais e de imagem para o exame de Estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes Unidos

O objetivo geral deste procedimento é examinar as diferenças morfológicas nas estruturas anormais do coágulo que ocorrem no diabetes e na anemia falciforme, condições de doença para coágulos diabéticos simulados. Isso é feito por meio de imagens de estruturas de coágulos glicados por microscopia confocal para amostras de sangue de pacientes falciformes. Os coágulos de fibrina contendo glóbulos vermelhos são visualizados em tempo real confocal.

A análise microscópica pode então ser realizada para avaliar as taxas de fibrinólise nas estruturas normais e glicadas do coágulo. Em última análise, essa análise em tempo real pode ser usada para avaliar as diferenças morfológicas que ocorrem em estruturas anormais de coágulos em resposta aos estados de doença em que surgem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da trombose e hemostasia, como Como as estruturas do coágulo de fibrina são diferentes em pacientes com diabetes ou doença falciforme.

Avaliar coágulos diabéticos simulados por microscopia confocal, primeiro descongele o fibrinogênio humano e o conjugado de fibrinogênio humano marcado com fluorescência a 10% a 37 graus Celsius quando as soluções de fibrinogênio humano aquecido misturadas ao fibrinogênio humano e o conjugado de fibrinogênio em uma solução de cloreto de sódio trics de glicose e incube a solução protegida da luz em banho-maria a 37 graus Celsius por 48 horas. Perto do final da incubação, use um adesivo não líquido para fixar um adesivo fino nos dois lados de uma lâmina de microscópio de vidro para fazer uma câmara, depois misture uma solução de fibrinogênio com fator de temperatura ambiente 13 e trombina até um volume final de 50 microlitros e transfira imediatamente 30 microlitros da solução de fibrina para a câmara da lâmina do microscópio. Agora coloque uma lamínula de vidro de 22 por 22 milímetros com uma ponta de 15 milímetros de espessura em cima do adesivo e sele os lados abertos da câmara com adesivo transparente, tomando cuidado para que o adesivo não interaja com o coágulo.

Deixe os coágulos de fibrina polimerizarem a 21 a 23 graus Celsius por duas horas. Em seguida, adquira imagens de microscopia confocal dos coágulos usando uma objetiva de 40 x e um laser de argônio de 488 nanômetros para avaliar coágulos de pacientes falciformes. Primeiro dilua a amostra de glóbulos vermelhos a 1 milhão de células por mililitro em meio de cultura de células livres de soro e misture as células com cinco microlitros da solução de marcação celular apropriada por pipetagem suave.

Após 20 minutos a 37 graus Celsius, lave as células três vezes em meio a 37 graus Celsius enquanto as células estão na centrífuga, misture a solução de fibrinogênio recém-preparada, fator 13 e trombina, como acabamos de demonstrar. Em seguida, transfira 10 microlitros dos glóbulos vermelhos marcados para a solução de fibrina e dispense imediatamente 30 microlitros da solução celular em uma câmara adesiva. Em uma lâmina de microscópio de vidro, permita que a fibrina polimerize a 21 a 23 graus Celsius após duas horas, adquira imagens confocais dos coágulos usando lasers de excitação com comprimentos de onda de 488 nanômetros e 633 nanômetros para excitar a fibrina e os glóbulos vermelhos marcados com fluorescência, respectivamente.

Para avaliar as taxas de fibrinólise e as estruturas dos coágulos glicados, primeiro prepare os coágulos glicados, como acabamos de demonstrar desta vez. No entanto, depois de dispensar a solução de coágulo de fibrina na câmara adesiva, não sele as extremidades da câmara. Em vez disso, permita que os coágulos polimerizem de 21 a 23 graus Celsius em um invólucro selado contendo 250 mililitros de água para evitar a desidratação.

Após uma hora e meia, adquira imagens dos coágulos por microscopia confocal, conforme demonstrado. Em seguida, pipete 25 microlitros de plasmina na extremidade aberta da câmara e permita que a plasmina se disperse por todo o coágulo por ação capilar. Por fim, abra os recursos de séries temporais do software do microscópio confocal, clique no modo de aquisição e selecione séries temporais.

Em seguida, selecione o número de ciclos e o intervalo de tempo de gravação para capturar imagens de vídeo em tempo real da lise do coágulo induzido por plasmina A análise de coágulos normais e glicados revela que os coágulos glicados são mais densos com poros menores do que os coágulos normais, com e sem a adição do fator 13 durante a polimerização do coágulo. De fato, nos coágulos glicados da ONU, há uma concentração de fibrina mais baixa, o que cria uma estrutura menos densa do que a observada nos coágulos glicados, que contêm uma concentração de fibrina mais alta. Os coágulos de fibrina de pacientes falciformes contêm glóbulos vermelhos e exibem estruturas mais densas do que as de coágulos de fibrina saudáveis devido a um aumento da concentração de fibrinogênio nesses indivíduos.

Além disso, a tendência natural dos glóbulos vermelhos de pacientes falciformes de formar agregados e gêneros, aglomerados de glóbulos vermelhos que se entrelaçam na rede de fibrina, resultando na formação de estruturas de coágulos aberrantes que são marcadamente diferentes em morfologia daquelas observadas em pacientes normais. Finalmente, a análise das taxas de fibrinólise de coágulos normais versus glicados demonstra uma capacidade significativamente prejudicada dos coágulos diabéticos simulados de lir a fibrina na ausência de plasmina suficiente. Esta pesquisa ajudará a pavimentar o caminho para pesquisadores no campo da trombose e hemostasia, especialmente para pacientes que desenvolvem patologias comórbidas como resultado de doença falciforme e diabetes.