Função Pulmonar Fenotipagem Rato In Vivo Com a capacidade pulmonar Diffusing

O objetivo geral do experimento a seguir é aprender a medir a capacidade de difusão dos pulmões de um camundongo usando um cromatógrafo gasoso calibrado. Isso é feito inflando os pulmões de um camundongo anestesiado com gás contendo neon e monóxido de carbono, mantendo o gás nos pulmões por nove segundos e coletando o gás. O gás retirado dos pulmões é então diluído em dois mililitros e injetado no cromatógrafo gasoso.

A absorção diferencial de néon e monóxido de carbono no pulmão é usada para calcular a capacidade de difusão. Essa medição pode ser usada para avaliar a perda da função pulmonar em um amplo espectro de modelos de doenças pulmonares. A principal vantagem desta técnica sobre todos os outros métodos existentes para medir a função pulmonar no camundongo é que esta é uma medida reprodutível muito simples que pode ser comparada diretamente com medições semelhantes em humanos.

Este método pode ser usado para acompanhar as mudanças na estrutura pulmonar que ocorrem com uma variedade de patologias pulmonares. Este protocolo começa com a configuração do módulo de cromatógrafo gasoso fornecido com a máquina para medir picos de nitrogênio, oxigênio, néon e monóxido de carbono. Para esta aplicação, apenas os dados de néon e monóxido de carbono são necessários.

O instrumento usa uma coluna de peneira molecular com hélio como gás transportador. Este cromatógrafo gasoso em particular tem uma coluna de 0,8 mililitros e uma amostra de dois mililitros é usada para garantir a limpeza adequada desta coluna antes de começar. Uma série de medições sempre calibra a máquina usando dois mililitros de gás diretamente do saco de amostra de gás.

O primeiro pico a aparecer é o neon, depois o oxigênio e o nitrogênio, que não medimos para este procedimento. Por fim, o pico de monóxido de carbono aparece na hora do cromatógrafo gasoso. Medir todos esses picos leva pouco menos de um minuto.

Para começar, anestesie os camundongos com cetamina e xilazina. Confirme a anestesia pela ausência de movimento reflexo em resposta a um beliscão do dedo do pé. Em seguida, para proteger os olhos, aplique pomada veterinária e, em seguida, traqueostomia os camundongos com uma cânula studen.

Use uma cânula de calibre 18 para adultos ou uma cânula de calibre 20 para camundongos muito jovens. Em seguida, inicie o metrônomo com cliques audíveis a cada segundo. Para camundongos com mais de seis semanas, use uma seringa de três mililitros para retirar 0,8 mililitros de gás da bolsa de mistura de gases.

Se o camundongo tiver menos de quatro semanas de idade, use 0,4 mililitros de gás, conecte a seringa à cânula traqueal e infle rapidamente os pulmões. Comece a contar mentalmente de um a 10 em sincronia com os cliques do metrônomo. Quando a contagem chegar a 10, retire rapidamente o volume de 0,8 mililitro.

Dilua esse gás exalado em dois mililitros adicionando espaço, ar e peso por pelo menos 15 segundos. É muito importante inflar e desinflar os pulmões o mais rápido possível. Uma inflação rápida é muito fácil, mas é preciso um pouco de prática para retirar com precisão os 0,8 mls rapidamente, Em seguida, injete toda a amostra no cromatógrafo gasoso.

Para análise, é importante evitar a contaminação da amostra ao transferir de e para o animal e para o cromatógrafo gasoso. Isso pode ser feito com cuidado, tampando o sinal com um dedo enquanto o GC está medindo a amostra. Encha o pulmão do rato com mais 0,8 mililitros de mistura de gases do saco e, em seguida, processe esta amostra de forma idêntica à primeira.

Usando os valores médios das duas medições, calcule o DFCO. O subscrito C refere-se aos gases de calibração e o subscrito nove refere-se às amostras coletadas do animal. Após os nove segundos, segure a respiração.

Um valor DFCO de controle nominal retirado de C 57 camundongos pretos de seis é de cerca de 0,77. Em um estudo usando um modelo de influenza PR oito, uma perda progressiva de função foi observada no sexto e oitavo dia em um modelo de enfisema 21 dias após a instalação de elastases. A DFCO foi moderadamente diminuída, mas houve mudanças muito maiores no modelo de fibrose induzida pela instalação de Blio Mycin.

A via fibrótica causada pela bleomicina resultou na maior alteração na DFCO observada em qualquer um dos modelos patológicos. Isso é importante, pois a capacidade de difusão também é um marcador confiável de fibrose em humanos. O gene CFTR desempenha um papel crucial na fibrose cística e em um estudo de camundongos sem esse gene, houve uma diminuição significativa no DFCO.

O DFCO foi ainda mais diminuído com a infecção fúngica nesses camundongos knockout. Um modelo comumente usado para lesão pulmonar é causado por LPS. Em camundongos expostos ao LPS, houve perda progressiva da função pulmonar dependente do tempo do primeiro ao quarto dia, conforme avaliado pelas medições de DFCO, a medição de DFCO pode ser feita com sucesso em camundongos a partir de duas semanas de idade.

O tamanho menor do pulmão requer um volume de insuflação menor de 0,4 mililitros. O DFCO medido com esse volume menor é capaz de mostrar o aumento esperado à medida que o pulmão amadurece Uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita em apenas alguns minutos por camundongo antes de fazer qualquer outra medição ou avaliação da função pulmonar.

Ao tentar este procedimento, é importante certificar-se de executar a etapa de inflação e deflação rapidamente e ter cuidado ao transferir a amostra para evitar a contaminação.