Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar as interações da proteína de RNA de extratos celulares usando um ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Isso é conseguido preparando primeiro um extrato de proteína de células ou tecidos em uma etapa separada, uma sonda de RNA marcada com rádio específica do gene é sintetizada e purificada. O extrato de proteína é então misturado com a sonda de RNA marcada para permitir a formação de complexos proteicos de RNA específicos.

Finalmente, o produto da reação é carregado em um gel de poliacrilamida não desnaturante e analisado por sonda de RNA livre de eletroforese é separado dos complexos proteicos de RNA em virtude de sua mobilidade mais rápida. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética é amplamente utilizado para analisar as interações RNA-proteína. Pudemos analisar a ligação das proteínas reguladoras de ferro, IRP um e IRP dois ao seu elemento de RNA alvo.

Mas o método também pode ser aplicado para o estudo de outras proteínas de ligação ao RNA, demonstrando que este procedimento será feito pelo Dr. Kain Philippin, pesquisador associado em meu laboratório e pela Dra. Nicole Wilkinson, pós-doutoranda para aderir células cultivadas em pratos. Lave as células duas vezes com PBS gelado, adicione um mililitro de PBS gelado e colha as células com um raspador de células de plástico. Transfira a suspensão de células soltas para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.

Coloque o tubo em uma microcentrífuga pré-resfriada de quatro graus Celsius. Gire para baixo em baixa velocidade por cinco minutos e aspire o alimentador. As células aparecerão como uma bolinha branca no fundo do tubo.

Para cada 10 milhões de células colhidas, adicione 100 microlitros de tampão de lise citoplasmática gelada. Afrouxe o pellet celular pipetando para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, incube a suspensão no gelo por 20 minutos. Isso solubilizará a membrana celular e liberará todo o conteúdo citosólico no tampão.

Para isolar a fração citosólica solubilizada, gire o tubo para baixo em velocidade máxima por 10 minutos em uma centrífuga de quatro graus Celsius, transfira o snat clarificado para um novo tubo de 1,5 mililitro em gelo e descarte o pellet. Em seguida, determine a concentração total de proteína do extrato citoplasmático resultante usando o ensaio de Bradford. Alíquota do extrato citoplasmático resultante em tubos menores e armazená-lo a 80 graus Celsius negativos até o uso para produzir extratos citoplasmáticos de tecidos frescos.

Comece o processo de colheita colocando o animal sacrificado em uma almofada limpa sobre uma tábua de dissecação. Abra o abdômen com uma tesoura. Remova o fígado e o baço usando tesouras e pinças.

Enxágue cada tecido em aproximadamente 50 mililitros de PBS gelado para evitar a degradação do tecido. Corte imediatamente os tecidos em pequenos pedaços de aproximadamente um a dois milímetros cúbicos com um bisturi sem demora. Coloque os lenços em um novo tubo criogênico e encaixe.

Congele uma amostra em nitrogênio líquido. Armazene os lenços congelados a menos 80 graus Celsius até que sejam necessários. Comece a fazer o extrato citoplasmático transferindo a amostra de tecido previamente congelada para um tubo de dois mililitros com fundo plano contendo 250 a 500 microlitros de tampão de lise gelada.

Coloque uma ponta homogeneizadora de tecidos no tubo e ligue o aparelho em potência média. Após 10 segundos de homogeneização, coloque imediatamente o tubo no gelo por 20 minutos para evitar a desnaturação das proteínas. Para isolar a fração citosólica, gire o tubo para baixo em velocidade máxima por 10 minutos em uma centrífuga de quatro graus Celsius, transfira o sobrenadante clarificado para um novo tubo de 1,5 mililitro em gelo e descarte o pellet.

Determinar a concentração total de proteínas do extracto citoplasmático resultante utilizando o ensaio de Bradford. Aqua o extrato citoplasmático resultante em tubos menores e armazene a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Antes de continuar com o protocolo, configure uma bancada de trabalho segura contra radiação completa com um contador Geiger de proteção de plexiglass.

Faça etiquetas de monitoramento de citometria em jalecos e recipientes de resíduos perfurocortantes e não perfurantes específicos para radiação apropriados. Começando com um plasmídeo de DNA linearizado contendo um elemento de resposta de ferro clonado. Como modelo, configure uma reação de transcrição de RNA in vitro de 20 microlitros misturando o tampão de reação do molde, nucleotídeos parcialmente radioativos e a RNA polimerase com uma pipeta à temperatura ambiente.

Para iniciar a síntese de RNA, incube a amostra a 40 graus Celsius por uma hora. Termine a reação de transcrição in vitro adicionando um microlitro de EDTA 0,5 molar pH 8,0. Misture o EDTA pipetando para cima e para baixo.

Agora use um protocolo padrão de precipitação de álcool para purificar o produto de RNA. Para começar, adicione 10 microlitros de TRNA e 82,5 microlitros de acetato de sódio de três molares a pH 5,2 à mistura pós-síntese e ao vórtice. Para misturar o TRNA atuará como um transportador de precipitação e aumentará o rendimento final do RNA para precipitar o RNA.

Adicione 273 microlitros de 95 a 100% de etanol e misture por vórtice. Permita que a reação de precipitação prossiga deixando o tubo na bancada por 10 minutos em temperatura ambiente para isolar o RNA, gire o tubo para baixo em uma centrífuga em temperatura ambiente em velocidade máxima por 10 minutos. Com uma pipeta, descarte cuidadosamente o sobrenadante e não perturbe o pellet.

O RNA precipitado pode existir como uma pequena pelota branca perto do fundo do tubo ou pode ser invisível a olho nu. Lave o pellet adicionando 100 a 500 microlitros de etanol a 70%. Centrifugar a amostra a velocidade máxima durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, transvasar o snat com a tampa.

Abra a secagem do pellet de RNA deixando o tubo aberto na bancada por 10 a 15 minutos. Reconstitua o RNA sólido marcado com rádio adicionando 100 microlitros de água livre de nuclease. Quantifique a extensão da incorporação de nucleotídeos radioativos colocando a solução de RNA em um contador de sação líquida Eloqua.

O rádio rotulou a sonda de RNA em tubos menores e armazena a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Alíquotas congeladas podem ser usadas por até três semanas antes de iniciar o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, prepare um gel de acrilamida padrão de 6% não desnaturante de pelo menos 16 por 16 centímetros de tamanho para facilitar maiores volumes de amostra por pista. E para aumentar a estabilidade mecânica de um gel desse tamanho.

Use espaçadores de vidro e pentes de pelo menos um milímetro de espessura. Para iniciar o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, descongele o lisado citoplasmático previamente congelado e as sondas de RNA marcadas com rádio nos olhos para o componente proteico do experimento. Diluir 25 microgramas do extracto citoplasmático com o tampão de lise citoplasmática até obter um volume total final de 10 microlitros.

Quando necessário, adicione um microlitro de solução estoque de dois metros à mistura e mantenha a amostra de proteína no gelo. Para o componente de RNA, dilua a sonda de RNA marcada com rádio em água livre de nuclease até 200.000 contagens por minuto por microlitro de calor para naturalizar o RNA a 95 Celsius por um minuto e resfrie a solução em temperatura ambiente por pelo menos cinco minutos. Para iniciar a reação de ligação ao RNA da proteína, adicione um microlitro de sonda de RNA marcada com rádio ao extrato da proteína para permitir que a ligação ocorra por 20 minutos à temperatura ambiente.

Para aumentar a especificidade do ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, adicione um microlitro de estoque de heparina à reação. Se as sondas de RNA radiomarcadas tiverem mais de 60 nucleotídeos, adicione mais um microlitro de RNAs T um. Permita que a reação de ligação continue por mais 10 minutos à temperatura ambiente para aumentar ainda mais a especificidade e permitir uma melhor separação do complexo de proteínas de RNA.

Adicione três microlitros de tampão de carregamento e pipete para cima e para baixo para misturar. Em seguida, carregue toda a reação no gel de acrilamida a 6% e execute o gel a cinco volts por centímetro por 60 minutos. Certifique-se de cobrir o aparelho com proteção contra radiação adequada.

Desmonte o aparelho de gel e transfira o gel para um papel de filtro grande. Seque o gel usando um aparelho de vácuo de secagem de gel em uma sala escura. Coloque a combinação de gel e papel de filtro em cima de uma peça.

Filme após exposição, revele e seque o filme ao ar. O tempo de exposição ideal pode variar de uma hora a uma noite. Pode-se avaliar a capacidade de ligação dependente de ferro de I RRP um e I RRP dois às sondas IRE radioativas em células de cultura de tecidos com teor variável de ferro.

Assim, a atividade de ligação do IRE é induzida em células empobrecidas em ferro previamente tratadas com a K mais tarde desferroxamina. Por outro lado, a atividade de ligação do IRE é suprimida em células carregadas de ferro previamente tratadas com heman em células carregadas de ferro. A atividade de ligação IRE de I RRP um é perdida após a montagem de um aglomerado de enxofre de ferro, enquanto I RRP dois sofre degradação dependente de ferro.

O aglomerado de células de ferro do IRP um pode ser destruído pelo tratamento de extratos celulares com 2%dois me, o que permite monitorar sua atividade de ligação IRE dormente. A atividade de I RRP dois não é recuperada por dois me. Neste próximo experimento, as atividades de ligação IRE de I RRP um e IRP dois em função da concentração de ferro celular são avaliadas no contexto de tecidos hepáticos frescos de camundongos selvagens tipo I RRP um knockout e I RRP dois knockout.

Aqui, os dados mostram que alimentar camundongos com uma dieta rica em ferro conhecida por aumentar a carga hepática de ferro promove uma redução nas atividades de ligação IRE de I RRP um e IRP dois em extratos hepáticos de camundongos selvagens. I rrp dois complexos IRE são distorcidos pela presença de I RRP um. Eles são facilmente visualizados em extratos hepáticos de camundongos knockout I RRP one.

Aqui, a dieta rica em ferro leva à inativação completa do IRP dois. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar as interações da proteína de RNA pelo ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Lembre-se de que a qualidade da sonda de RNA é fundamental para o sucesso.