Name: Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Aprenda a realizar o ensaio de mobilidade eletroforética (EMSA) para analisar interações RNA-proteína em extratos celulares. Este método permite visualizar complexos específicos usando eletroforese em gel não desnaturante.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Canadian Institutes for Health Research (MOP-86514).

Os procedimentos experimentais com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animal da McGill University (protocolo 4966). 1. Preparação de extratos de proteínas a partir de células cultivadas <ol><li> Lavar as células cultivadas duas vezes com 10 ml de fosfato de gelo-solução salina tamponada (PBS). </li><li> Raspe células aderentes quer com um polícia de borracha ou um raspador de células de plástico em 1 ml de suspensão de PBS, arrefecido com gelo transferência para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugação numa microcentrífuga durante 5 min a 700 xg, a 4 ° C. Aspirar PBS. </li><li> Adicionar 100 ul de tampão de lise arrefecido com gelo citoplasmática (Tabela 1) por 10 7 células, e pipetar para cima e para baixo. </li><li> Incubar em gelo durante 20 min. </li><li> Centrifugação durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga a 4 ° C. </li><li> Pellet Descartar. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e manter em gelo. </li><li> Detarminho concentração de proteína (normalmente 1-10 mg / mL) utilizando o 23 ensaio de Bradford. </li><li> Alíquotas e armazenar extractos celulares a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 2. Preparação de extratos de proteína de rato fígado e baço <ol><li> Euthanize um rato com inalação de CO 2. </li><li> Coloque o animal sacrificados em uma almofada limpo sobre uma placa de dissecação. Abra o abdômen com uma tesoura. </li><li> Dissecar o fígado e o baço, utilizando tesouras e pinças, e lave cada tecido em aproximadamente 50 ml de PBS gelado. </li><li> Tecidos em pequenos pedaços imediatamente cortada com um bisturi (por exemplo: cerca de 1 - 2 mm 3). </li><li> Sem demora, coloque pedaços de tecidos em uma nova cryotube e em seguida, encaixe congelá-los em nitrogênio líquido. Snap-congelados loja alíquotas de tecido a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Homogeneizar um pedaço de tecido congelado (cerca de 1 - 2 mm 3) em 0,25-0,5 ml degelo-tampão de lise frio citoplasmática (Tabela 1) com um homogeneizador de tecidos de 10 seg. </li><li> Transferir homogeneizado a 1,5 ml tubo de microcentrífuga e frio em gelo durante 20 min. </li><li> Centrifugação durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga a 4 ° C. </li><li> Descarte pellet e transferência sobrenadante para novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenha no gelo. </li><li> Determinar a concentração de proteína (normalmente 1-10 mg / mL) utilizando o 23 ensaio de Bradford. </li><li> Alíquotas e armazenar extractos celulares a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol> 3. Preparação de sonda radiomarcada-IRE <ol><li> Linearizar o plasmídeo contendo IRE-I-12.CAT 22 por incubação a 37 ° C durante 1 h com a endonuclease de restrição Xbal (1 U por ug de plasmídeo), que cliva a jusante da sequência IRE. O plasmídeo linearizado vai ser utilizado como molde para a transcrição in vitro. </li><li> Configurar uman na reacção de transcrição in vitro num volume total de 20 ul. Use as soluções stock mostrados na Tabela 2 e adicionar: 1 ul molde de plasmídeo linearizado, 4 ul de tampão de transcrição; 1 uL de mistura de mistura de ATP / CTP / GTP, 10 ul [α- 32 P] -UTP, 2 ul de ditiotreitol, 1 ul de inibidor de RNase e 1 ul de RNA-polimerase de T7. Misturar por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Incubar a 40 ° C durante 1 h 24. </li></ol> 4. Purificação de IRE-sonda radiomarcada <ol><li> Terminar em reação de transcrição in vitro, adicionando 1 ml de 0,5 M EDTA, pH 8. Mix pipetando cima e para baixo. </li><li> Adicionar 10 ul de 10 mg / ml de ARNt, como transportador para uma melhor precipitação. Misturar por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Adicionar 82.5 ul de acetato de amónio 3 M. Misture em vórtice. </li><li> Adicionar 273 ul de etanol. Misture em vórtice. </li><li> Deixar repousar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Girar durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga à temperatura ambiente. Sobrenadante Descartar. </li><li> Lave o peletizado com 100 ul de etanol a 70%. </li><li> Girar durante 10 minutos à velocidade máxima numa microcentrífuga à temperatura ambiente. Sobrenadante Descartar. </li><li> Ar sedimento seco durante 10 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em 100 ul de duas vezes destilada, previamente autoclavada H 2 O. </li><li> Quantificar a radioactividade num contador de cintilação líquida, a sonda radiomarcada IRE alíquota e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. Alíquotas congeladas podem ser utilizadas durante até 3 semanas. </li></ol> 5. Preparação de um gel de poliacrilamida nativa para EMSA <ol><li> Monte o gel (16 x 16 cm), usando 1,5 espaçadores mm e pente. </li><li> Para preparar um gel de poliacrilamida a 6% nativo, utilizar as soluções de estoque mostrados na Tabela 3 Misturar 7,5 ml de 40% de acrilamida:. Bisacrilamida, 5 ml de 5x TBE e 37,5 mldouble H2O destilada </li><li> Adicionar 0,5 ml de 10% de persulfato de amónio preparada recentemente (APS) e 25 ul tetrametiletilenodiamina (TEMED). </li><li> Derrame imediatamente a solução de acrilamida ao gel e deixá-lo polimerizar. Aguarde cerca de 30 min. </li><li> Montar o aparelho de eletroforese com gel, encher os tanques com 0,5x TBE e se conectar com a fonte de alimentação. </li></ol> 6. Electrophoretic Mobility Turno Assay <ol><li> Dilui-se 25 ug de extracto de proteína a partir de células ou tecidos com tampão de lise citoplasmática (Quadro 1) num volume total de 10 uL em (concentrações de proteína mais baixas podem também ser usados). Mantenha no gelo. Se necessário, adicionar 1 ml de 1: 4 diluído 2-mercaptoetanol (2-ME) para activar IRP1 dormente (concentração final: 2%) 25. </li><li> Dilui-se a sonda IRE radiolabeled em dobro H2O destilada para 200.000 cpm / mL, desnaturar calor em 95 °C durante 1 min, e arrefecer à temperatura ambiente durante pelo menos 5 min. </li><li> Configurar uma reação EMSA, adicionando 1 ml de sonda IRE radiolabeled ao extrato de proteína. </li><li> Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 1 ml de 50 mg / ml de heparina para a reacção (para inibir interacções de proteínas não-específicos com a sonda 9) e continuar a incubação durante mais 10 min. Alíquota da solução de reserva de heparina (50 mg / ml) e armazenar a -80 ° C. </li><li> Quando utilizando sondas radiomarcadas longas (&gt; 60 nucleótidos), adicionar 1 ul de ARNase T1 (1 U / ul) e incubar durante 10 min à temperatura ambiente para reduzir a proteína de ligação não específica com a sonda, e para permitir uma melhor separação do ARN / proteína complexo durante a electroforese. </li><li> Adicionar 3 ul de tampão de carga (glicerol a 80% + azul de bromofenol), misturar e carga sobre o não-desnaturante em gel de poliacrilamida a 6%. </li><li> Submeter o gel durante 60 minutos a 130 V (5 V / cm). </li><li> Transferência o gel para um grande papel de filtro e seco. </li><li> Expor a um filme e desenvolver auto-radiografia. O tempo de exposição pode variar desde 1 h (ou menos) até S / N. </li></ol>

<ol><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).</li>
<li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Luscieti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mutations+in+the+ferritin-L+iron-responsive+element+that+only+mildly+impair+IRP+binding+cause+hereditary+hyperferritinaemia+cataract+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+J+Rare+Dis%22%5BJournal%5D)">Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome.</a> Orphanet J Rare Dis. 8, 30(2013).</li>
<li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22Filter-binding+assay+for+analysis+of+RNA-protein+interactions%22">Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions</a>. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-mediated+degradation+of+IRP2%3A+an+unexpected+pathway+involving+a+2-oxoglutarate-dependent+oxygenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity.</a> Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).</li>
<li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5%27+untranslated+regions+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).</li>
<li>Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+interaction+of+the+iron-responsive+element+binding+protein+with+iron-responsive+RNA+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements.</a> Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).</li>
<li>Mueller, S., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+iron+regulatory+protein-1+%28IRP1%29+by+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress.</a> Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).</li>
<li>Wang, J., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular iron metabolism.</a> Biochem J. 434, 365-381 (2011).</li>
<li>Hentze, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+iron-responsive+element+for+the+translational+regulation+of+human+ferritin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA.</a> Science. 238, 1570-1573 (1987).</li>
<li>Casey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-responsive+elements%3A+regulatory+RNA+sequences+that+control+mRNA+levels+and+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation.</a> Science. 240, 924-928 (1988).</li>
<li>Dandekar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+iron-responsive+element+in+murine+and+human+erythroid+d-aminolevulinic+acid+synthase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA.</a> EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).</li>
<li>Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+regulation+of+mammalian+and+drosophila+citric+acid+cycle+enzymes+via+iron-responsive+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).</li>
<li>McKie, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duodenal+iron-regulated+transporter+IREG1%2C+implicated+in+the+basolateral+transfer+of+iron+to+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation.</a> Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).</li>
<li>Gunshin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+protein-coupled+metal-ion+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter.</a> Nature. 388, 482-488 (1997).</li>
<li>Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-regulatory+proteins+limit+hypoxia-inducible+factor-2alpha+expression+in+iron+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).</li>
<li>Sanchez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulation+and+the+cell+cycle%3A+Identification+of+an+iron-responsive+element+in+the+3%27-untranslated+region+of+human+cell+division+cycle+14A+mRNA+by+a+refined+microarray-based+screening+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy.</a> J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).</li>
<li>Santos, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iron+responsive+element-like+stem-loop+regulates+alpha-hemoglobin-stabilizing+protein+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA.</a> J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siderophore-mediated+iron+trafficking+in+humans+is+regulated+by+iron%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron.</a> J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).</li>
<li>Gray, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+iron+regulatory+factor+functions+as+an+iron-responsive+element-binding+protein%2C+a+translational+repressor+and+an+aconitase.+A+functional+assay+for+translational+repression+and+direct+demonstration+of+the+iron+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch.</a> Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Testa, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+iron+regulatory+element-binding+protein%28s%29+in+cell+extracts+of+activated+lymphocytes+versus+monocytes-macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages.</a> J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).</li>
<li>Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+and+the+molecular+mechanism+of+a+regulated+RNA-protein+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction.</a> Science. 244, 357-359 (1989).</li>
<li>Meyron-Holtz, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablations+of+iron+regulatory+proteins+1+and+2+reveal+why+iron+regulatory+protein+2+dominates+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis.</a> EMBO J. 23, 386-395 (2004).</li>
<li>Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+juvenile+hemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A mouse model of juvenile hemochromatosis.</a> J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).</li>
<li>Sebastiani, G., Pantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+associated+with+systemic+or+local+iron+overload%3A+from+pathophysiology+to+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice.</a> Metallomics. 3, 971-986 (2011).</li>
<li>Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+conditional+alleles+of+the+murine+iron+regulatory+protein+%28IRP%29-1+and+-2+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes.</a> Genesis. 43, 181-188 (2005).</li>
<li>Gkouvatsos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-dependent+regulation+of+hepcidin+in+Hjv-%2F-+mice%3A+Evidence+that+hemojuvelin+is+dispensable+for+sensing+body+iron+levels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels.</a> PLoS ONE. 9, 85530(2014).</li>
<li>Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+determinants+within+iron-responsive+elements+dictate+iron+regulatory+protein+binding+and+regulatory+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy.</a> RNA. 16, 154-169 (2010).</li>
<li>Gopinath, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Mapping of RNA-protein interactions.</a> Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos um protocolo que foi desenvolvido para estudar as atividades de ligação IRE de IRP1 e IRP2, e mostramos dados representativos. Usando diferentes sondas, este protocolo também pode ser ajustado para o estudo de outras proteínas de ligação ao RNA. Uma etapa crítica é o tamanho da sonda. O uso de sondas longas, que é comum quando o local exato de ligação é desconhecido, pode resultar em complexos de RNA/proteína que não migram de forma diferente do RNA livre. Neste caso, é aconselhável remover o RNA não li...

A EMSA foi originalmente desenvolvido para o estudo da associação de proteínas de ligação de DNA com sequências de ADN alvo 1,2. O princípio é semelhante para as interacções de ARN / proteína 3, o que é o foco deste artigo. Resumidamente, o ARN é negativamente carregado e irá migrar em direcção ao ânodo durante a electroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida (ou géis de agarose). A migração dentro do gel depende do tamanho do ARN, que é proporcional à sua carga. De ligação específica de uma proteína de ARN altera a sua mobilidade, e as complexo migra mais lenta em comparação com o ARN livre. Isto é devido principalmente a um aumento na massa molecular, mas também às alterações na carga e, eventualmente, conformação. Utilizando um RNA rotulado como sonda permite fácil monitoramento do &quot;atraso gel&quot; ou &quot;bandshift&quot;. Uso de 32 sondas de ARN marcadas com P é muito comum e oferece uma elevada sensibilidade. A migração de RNA / complexos de proteínas e RNA livre são detectadospor autorradiografia. Inconvenientes são o meia-vida curta de 32 P (14,29 dias), a deterioração gradual da qualidade da sonda devido a radiólise, a exigência de uma licença de radioatividade e infra-estrutura para o trabalho de radioatividade, e potenciais preocupações de biossegurança. Portanto, foram desenvolvidos métodos alternativos não isotópicas para etiquetar a sonda de RNA, por exemplo, com fluoróforos ou biotina, que permitem a detecção por imagem fluorescente ou quimioluminescente 4,5. As limitações destes métodos são o custo mais elevado e frequentemente sensibilidade reduzida em comparação com a marcação isotópica, e o potencial de marcadores não isotópicos para interferir com a interacção de ARN / proteína. Géis de poliacrilamida não desnaturantes são adequados para a maioria das aplicações de EMSA e são normalmente utilizados. Na ocasião, géis de agarose pode representar uma alternativa para a análise de grandes complexos. A principal vantagem de EMSA é que ele combina simplicidade, sensibilidade e robustez 4 &lt;/ Sup&gt;. O ensaio pode ser concluída dentro de algumas horas e não requer instrumentação sofisticada. Interacções de ARN / proteína pode ser detectada por EMSA em concentrações tão baixas como 0,1 nM ou menos, e dentro de uma ampla gama de condições de ligação (pH 4,0-9,5, a concentração de sal monovalente 1-300 mM, e a temperatura 0-60 ° C). ARN / proteína a formação do complexo também pode ser estudada pelo ensaio de ligação ao filtro. Este é um procedimento simples, rápido e barato, baseado na retenção dos complexos de ARN / proteína em um filtro de nitrocelulose, enquanto que uma sonda de RNA livre passa por 6. Em comparação com a EMSA, é limitado nos casos em que a sonda de ARN contém múltiplos locais de ligação, ou o extracto em bruto contém mais do que uma proteína de ligação a ARN que se ligam a sonda no mesmo local. Enquanto múltiplas interacções ARN / proteína vai escapar à detecção por ensaio de ligação ao filtro, que pode ser facilmente visualizado por EMSA. Em alguns casos, a visualização é vésperan possível quando dois complexos de ARN / proteína co-migrar (por exemplo, humano IRP1 / IRE e IRP2 / complexos IRE), por adição de um anticorpo contra uma das proteínas de ligação a ARN para a reacção de EMSA, obtendo-se ainda mais sobre o gel de retardo ( &quot;supershift&quot;) 7. O EMSA tem sido amplamente utilizado para estudar e IRP1 IRP2, que são reguladores pós-transcricional do metabolismo do ferro 8-10. Eles operam através da ligação a IRES, estruturas hairpin filogeneticamente conservados dentro das UTRs de vários mRNAs 11. IRES foram descobertos pela primeira vez nos mRNAs que codificam 12 ferritina e transferrina receptor 1 (TfR1) 13, proteínas de armazenamento de ferro e absorção, respectivamente. Mais tarde, IRES foram encontrados em específico-erythroid aminolevulinato sintase (ALAS2) 14, aconitase mitocondrial 15, ferroportin 16, transportador de metal divalente 1 (DMT1) 17, hipóxia fator induzível 2 <em&gt; α (HIF2α) 18, e outro mRNAs 19-21. O protótipo H- e mRNAs L-ferritina conter um IRE na sua UTR 5 &#39;, enquanto TfR1 ARNm contém múltiplos IRES em sua extremidade 3&#39; UTR. Interações IRE / PIA especificamente inibir a tradução do mRNA ferritina por estericamente bloqueando a sua associação dos 43S da subunidade ribossômica; Além disso, eles estabilizar TfR1 mRNA contra clivagem endonucleolítica. IRP1 e share IRP2 extensa seqüência de similaridade e apresentam alta atividade de ligação IRE em células sedentos de ferro. Em células repletas de ferro, IRP1 monta um aglomerado cubano Fe-S que converte para aconitase citosólico em detrimento da sua actividade de ligação ao IRE, enquanto IRP2 sofre degradação proteossoma. Assim, as interacções IRE / PIA depender do estado celular de ferro, mas também são regulados por outros sinais, tais como H 2 O 2, o óxido nítrico (NO) ou hipoxia. Aqui, descrevemos o protocolo para avaliar a atividade IRE de ligação a partir de extratos de células de tecido cru e por eMSA. Utilizou-se um marcado com 32 P H-ferritina sonda IRE que foi gerado por transcrição in vitro a partir de um molde de ADN de plasmídeo (I-12.CAT), onde a sequência IRE foi originalmente introduzido na orientação com sentido a jusante do local da polimerase de ARN de T7 pela clonagem de oligonucleótidos sintéticos 22 recozidos.

<table><tbody><tr><td>leupeptina</td><td>SIGMA</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína BioRad</td><td>BIORAD</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimerase</td><td>Termocientífico</td><td>EPO111</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>Invitrogen</td><td>15518-012</td><td></td></tr><tr><td>UTP [alfa-32P]</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td>NEG507H</tr><tr><td>Líquido de cintilação</td><td>Beckman Coulter</td><td>141349</td><td></td></tr><tr><td>heparina</td><td>SIGMA</td><td>H0777</td><td></td></tr><tr><td>Rnase T1</td><td>Thermoscientific</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Nome do equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecido Ruptor</td><td>Qiagen</td><td>9001271</td><td></td></tr><tr><td>Contador de cintilação</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi Cell</td><td>BIORAD</td><td>165-1834</td><td></td></tr><tr><td>Pentes de 20 poços</td><td>BIORAD</td><td>165-1868</td> Espaçadores de <td>1,5 mm de espessura</td></tr><tr><td>e 1,5 mm</td><td>BIORAD</td><td>165-1849</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac</td><td>BIORAD</td><td>164-5070</td><td></td></tr></tbody></table>

electrophoretic mobility turno assay (emsa) para o estudo das interações rna em proteínas: o ire / irp exemplo

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Interações RNA / proteínas são fundamentais para vias de regulação pós-transcricional. Entre as proteínas de ligação a ARN citosólicos melhor caracterizados são proteínas reguladoras de ferro, e IRP1 IRP2. Eles ligam-se a elementos responsivos de ferro (IRES) dentro das regiões não traduzidas (UTRs) de vários mRNAs alvo, controlando assim a tradução de mRNAs ou estabilidade. Interações IRE / PIA têm sido amplamente estudados pela EMSA. Aqui, nós descrevemos o protocolo de EMSA para analisar a actividade de ligação de IRE-IRP1 e IRP2, que pode ser generalizado para avaliar a actividade de outras proteínas de ligação a ARN, bem. Um lisato de proteína bruto contendo uma proteína de ligação de ARN, ou uma preparação purificada desta proteína, é incubado com um excesso de 32 sonda de ARN marcada com P, para permitir a formação do complexo. A heparina é adicionado para impedir a proteína não específica para sondar ligação. Subsequentemente, a mistura é analisada por electroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida. A sonda livremigra rapidamente, enquanto que o ARN / proteína apresenta complexos de mobilidade retardada; daí, o procedimento também é chamado de &quot;retardamento em gel&quot; ou ensaio &quot;bandshift&quot;. Depois de completada a electroforese, o gel é seco e complexos de ARN / proteína, bem como sonda livre, são detectados por auto-radiografia. O objetivo geral do protocolo é para detectar e quantificar IRE / IRP e outras interações RNA / proteína. Além disso, a EMSA também pode ser utilizado para determinar a especificidade, a afinidade de ligação, e a estequiometria da interacção de ARN / proteína sob investigação.

Uma sonda IRE radiomarcada foi preparada, conforme descrito nas seções 3 e 4 do protocolo. A sequência da sonda foi 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUGCUUCAAC AGUGCUUGGA CGGAUCCU-3'; os nucleotídeos em negrito representam um resíduo C não pareado e o loop, que são características críticas da IRE. A radioatividade específica da sonda foi de 4,5 x 109 cpm/μg de RNA.
Para avaliar os efeitos de perturbações no ferro sobre a atividade de ligação ao I...

Aqui apresentamos um protocolo para analisar as interações RNA/proteína. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) é baseado na migração diferencial de complexos de RNA/proteína e RNA livre durante a eletroforese em gel nativo. Usando uma sonda de RNA radiomarcada, os complexos RNA/proteína podem ser visualizados por autorradiografia.

Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar as interações da proteína de RNA de extratos celulares usando um ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Isso é conseguido preparando primeiro um extrato de proteína de células ou tecidos em uma etapa separada, uma sonda de RNA marcada com rádio específica do gene é sintetizada e purificada. O extrato de proteína é então misturado com a sonda de RNA marcada para permitir a formação de complexos proteicos de RNA específicos.Finalmente, o produto da reação é carregado em um gel de poliacrilamida não desnaturante e analisado por sonda de RNA livre de eletroforese é separado dos complexos proteicos de RNA em virtude de sua mobilidade mais rápida. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética é amplamente utilizado para analisar as interações RNA-proteína. Pudemos analisar a ligação das proteínas reguladoras de ferro, IRP um e IRP dois ao seu elemento de RNA alvo.Mas o método também pode ser aplicado para o estudo de outras proteínas de ligação ao RNA, demonstrando que este procedimento será feito pelo Dr. Kain Philippin, pesquisador associado em meu laboratório e pela Dra. Nicole Wilkinson, pós-doutoranda para aderir células cultivadas em pratos. Lave as células duas vezes com PBS gelado, adicione um mililitro de PBS gelado e colha as células com um raspador de células de plástico. Transfira a suspensão de células soltas para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.Coloque o tubo em uma microcentrífuga pré-resfriada de quatro graus Celsius. Gire para baixo em baixa velocidade por cinco minutos e aspire o alimentador. As células aparecerão como uma bolinha branca no fundo do tubo.Para cada 10 milhões de células colhidas, adicione 100 microlitros de tampão de lise citoplasmática gelada. Afrouxe o pellet celular pipetando para cima e para baixo várias vezes e, em seguida, incube a suspensão no gelo por 20 minutos. Isso solubilizará a membrana celular e liberará todo o conteúdo citosólico no tampão.Para isolar a fração citosólica solubilizada, gire o tubo para baixo em velocidade máxima por 10 minutos em uma centrífuga de quatro graus Celsius, transfira o snat clarificado para um novo tubo de 1,5 mililitro em gelo e descarte o pellet. Em seguida, determine a concentração total de proteína do extrato citoplasmático resultante usando o ensaio de Bradford. Alíquota do extrato citoplasmático resultante em tubos menores e armazená-lo a 80 graus Celsius negativos até o uso para produzir extratos citoplasmáticos de tecidos frescos.Comece o processo de colheita colocando o animal sacrificado em uma almofada limpa sobre uma tábua de dissecação. Abra o abdômen com uma tesoura. Remova o fígado e o baço usando tesouras e pinças.Enxágue cada tecido em aproximadamente 50 mililitros de PBS gelado para evitar a degradação do tecido. Corte imediatamente os tecidos em pequenos pedaços de aproximadamente um a dois milímetros cúbicos com um bisturi sem demora. Coloque os lenços em um novo tubo criogênico e encaixe.Congele uma amostra em nitrogênio líquido. Armazene os lenços congelados a menos 80 graus Celsius até que sejam necessários. Comece a fazer o extrato citoplasmático transferindo a amostra de tecido previamente congelada para um tubo de dois mililitros com fundo plano contendo 250 a 500 microlitros de tampão de lise gelada.Coloque uma ponta homogeneizadora de tecidos no tubo e ligue o aparelho em potência média. Após 10 segundos de homogeneização, coloque imediatamente o tubo no gelo por 20 minutos para evitar a desnaturação das proteínas. Para isolar a fração citosólica, gire o tubo para baixo em velocidade máxima por 10 minutos em uma centrífuga de quatro graus Celsius, transfira o sobrenadante clarificado para um novo tubo de 1,5 mililitro em gelo e descarte o pellet.Determinar a concentração total de proteínas do extracto citoplasmático resultante utilizando o ensaio de Bradford. Aqua o extrato citoplasmático resultante em tubos menores e armazene a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Antes de continuar com o protocolo, configure uma bancada de trabalho segura contra radiação completa com um contador Geiger de proteção de plexiglass.Faça etiquetas de monitoramento de citometria em jalecos e recipientes de resíduos perfurocortantes e não perfurantes específicos para radiação apropriados. Começando com um plasmídeo de DNA linearizado contendo um elemento de resposta de ferro clonado. Como modelo, configure uma reação de transcrição de RNA in vitro de 20 microlitros misturando o tampão de reação do molde, nucleotídeos parcialmente radioativos e a RNA polimerase com uma pipeta à temperatura ambiente.Para iniciar a síntese de RNA, incube a amostra a 40 graus Celsius por uma hora. Termine a reação de transcrição in vitro adicionando um microlitro de EDTA 0,5 molar pH 8,0. Misture o EDTA pipetando para cima e para baixo.Agora use um protocolo padrão de precipitação de álcool para purificar o produto de RNA. Para começar, adicione 10 microlitros de TRNA e 82,5 microlitros de acetato de sódio de três molares a pH 5,2 à mistura pós-síntese e ao vórtice. Para misturar o TRNA atuará como um transportador de precipitação e aumentará o rendimento final do RNA para precipitar o RNA.Adicione 273 microlitros de 95 a 100% de etanol e misture por vórtice. Permita que a reação de precipitação prossiga deixando o tubo na bancada por 10 minutos em temperatura ambiente para isolar o RNA, gire o tubo para baixo em uma centrífuga em temperatura ambiente em velocidade máxima por 10 minutos. Com uma pipeta, descarte cuidadosamente o sobrenadante e não perturbe o pellet.O RNA precipitado pode existir como uma pequena pelota branca perto do fundo do tubo ou pode ser invisível a olho nu. Lave o pellet adicionando 100 a 500 microlitros de etanol a 70%. Centrifugar a amostra a velocidade máxima durante 10 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, transvasar o snat com a tampa.Abra a secagem do pellet de RNA deixando o tubo aberto na bancada por 10 a 15 minutos. Reconstitua o RNA sólido marcado com rádio adicionando 100 microlitros de água livre de nuclease. Quantifique a extensão da incorporação de nucleotídeos radioativos colocando a solução de RNA em um contador de sação líquida Eloqua.O rádio rotulou a sonda de RNA em tubos menores e armazena a 80 graus Celsius negativos até que seja necessário. Alíquotas congeladas podem ser usadas por até três semanas antes de iniciar o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, prepare um gel de acrilamida padrão de 6% não desnaturante de pelo menos 16 por 16 centímetros de tamanho para facilitar maiores volumes de amostra por pista. E para aumentar a estabilidade mecânica de um gel desse tamanho.Use espaçadores de vidro e pentes de pelo menos um milímetro de espessura. Para iniciar o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, descongele o lisado citoplasmático previamente congelado e as sondas de RNA marcadas com rádio nos olhos para o componente proteico do experimento. Diluir 25 microgramas do extracto citoplasmático com o tampão de lise citoplasmática até obter um volume total final de 10 microlitros.Quando necessário, adicione um microlitro de solução estoque de dois metros à mistura e mantenha a amostra de proteína no gelo. Para o componente de RNA, dilua a sonda de RNA marcada com rádio em água livre de nuclease até 200.000 contagens por minuto por microlitro de calor para naturalizar o RNA a 95 Celsius por um minuto e resfrie a solução em temperatura ambiente por pelo menos cinco minutos. Para iniciar a reação de ligação ao RNA da proteína, adicione um microlitro de sonda de RNA marcada com rádio ao extrato da proteína para permitir que a ligação ocorra por 20 minutos à temperatura ambiente.Para aumentar a especificidade do ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, adicione um microlitro de estoque de heparina à reação. Se as sondas de RNA radiomarcadas tiverem mais de 60 nucleotídeos, adicione mais um microlitro de RNAs T um. Permita que a reação de ligação continue por mais 10 minutos à temperatura ambiente para aumentar ainda mais a especificidade e permitir uma melhor separação do complexo de proteínas de RNA.Adicione três microlitros de tampão de carregamento e pipete para cima e para baixo para misturar. Em seguida, carregue toda a reação no gel de acrilamida a 6% e execute o gel a cinco volts por centímetro por 60 minutos. Certifique-se de cobrir o aparelho com proteção contra radiação adequada.Desmonte o aparelho de gel e transfira o gel para um papel de filtro grande. Seque o gel usando um aparelho de vácuo de secagem de gel em uma sala escura. Coloque a combinação de gel e papel de filtro em cima de uma peça.Filme após exposição, revele e seque o filme ao ar. O tempo de exposição ideal pode variar de uma hora a uma noite. Pode-se avaliar a capacidade de ligação dependente de ferro de I RRP um e I RRP dois às sondas IRE radioativas em células de cultura de tecidos com teor variável de ferro.Assim, a atividade de ligação do IRE é induzida em células empobrecidas em ferro previamente tratadas com a K mais tarde desferroxamina. Por outro lado, a atividade de ligação do IRE é suprimida em células carregadas de ferro previamente tratadas com heman em células carregadas de ferro. A atividade de ligação IRE de I RRP um é perdida após a montagem de um aglomerado de enxofre de ferro, enquanto I RRP dois sofre degradação dependente de ferro.O aglomerado de células de ferro do IRP um pode ser destruído pelo tratamento de extratos celulares com 2%dois me, o que permite monitorar sua atividade de ligação IRE dormente. A atividade de I RRP dois não é recuperada por dois me. Neste próximo experimento, as atividades de ligação IRE de I RRP um e IRP dois em função da concentração de ferro celular são avaliadas no contexto de tecidos hepáticos frescos de camundongos selvagens tipo I RRP um knockout e I RRP dois knockout.Aqui, os dados mostram que alimentar camundongos com uma dieta rica em ferro conhecida por aumentar a carga hepática de ferro promove uma redução nas atividades de ligação IRE de I RRP um e IRP dois em extratos hepáticos de camundongos selvagens. I rrp dois complexos IRE são distorcidos pela presença de I RRP um. Eles são facilmente visualizados em extratos hepáticos de camundongos knockout I RRP one.Aqui, a dieta rica em ferro leva à inativação completa do IRP dois. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar as interações da proteína de RNA pelo ensaio de mudança de mobilidade eletroforética. Lembre-se de que a qualidade da sonda de RNA é fundamental para o sucesso.

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa-for-study-rna-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Devido à natureza transitória do pré-mRNA, pode ser difícil isolar e...

Um método rápido de alta capacidade para Ribonucleoproteínas Mapping (RNPs) no pré-mRNA Humanos

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética para detectar interações proteína-DNA usando sondas de DNA marcadas com fluorescência infravermelha. Quando a proteína se liga à sonda de DNA, ela forma um grande complexo que migra lentamente e aparece como uma banda deslocada no gel.

Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética para Detecção de Complexos de Fator de Transcrição-DNA

Neste vídeo, descrevemos a evolução sistemática de ligantes pelo método de enriquecimento exponencial (SELEX) para identificar sequências específicas de ligação a RNA para uma proteína-alvo de interesse. A proteína é incubada com um grande conjunto de sequências de RNA aleatórias, e as sequências de RNA de ligação à proteína são isoladas, amplificadas por PCR e sequenciadas para identificar seus locais de ligação à proteína.

Ensaio de ligação in vitro baseado em SELEX para identificar interações RNA-proteína

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

A eletroforese em gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental para analisar as interações RNA-proteína. Tradicionalmente, a maioria das experiências usou géis verticais. No entanto, os géis horizontais oferecem várias vantagens, como a oportunidade de monitorar complexos durante a eletroforese. Nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal.

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no Ácido desoxirribonucleico (DNA). Este protocolo descreve como fazer o mutagenesis local-dirigido com um 2-passo e passo 3-cadeia da polimerase (PCR) com base em abordagem, que é aplicável a qualquer fragmento de DNA de interesse.

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Neste método, nós quantificamos a afinidade obrigatória de proteínas de ligação do RNA (rbps) aos locais de ligação cognato e non-cognato usando um simples, vivo, ensaio do repórter em pilhas bacterianas. O ensaio é baseado na repressão de um gene repórter.

Um ensaio para quantificar a ligação de RNA de proteína em bactérias

São apresentados aqui protocolos para ensaios bioquímicos in vitro usando rótulos de biotina que podem ser amplamente aplicáveis para o estudo de interações ácido proteína-nucleico.

Ensaios bioquímicos in vitro utilizando rótulos de biotina para estudar interações ácido proteína-nucleico

Aqui, nós apresentamos um protocolo para enriquecer locais de ligação do RNA endógeno ou "pegadas" de complexos do RNA: proteína (RNP) das pilhas de mamífero. Essa abordagem envolve duas imunoprecipitações de subunidades de RNP e, portanto, é apelidado de imunoprecipitação de RNA em tandem (RIPiT).

Identificação de pegadas de RNA: complexos proteicos via imunoprecipitação de RNA em tandem seguido de sequenciamento (RIPiT-Seq)

Aprenda a realizar o ensaio de mobilidade eletroforética (EMSA) para analisar interações RNA-proteína em extratos celulares. Este método permite visualizar complexos específicos usando eletroforese em gel não desnaturante.

Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

Explorar mais vídeos