A fase líquida ensaio de captura de afinidade usando pérolas magnéticas para estudar interação proteína-proteína: O Exemplo Poliovírus Nanobody-

Este protocolo usa a interação entre poliovírus e poliovírus, reconhecendo nanocorpos para demonstrar um ensaio quantitativo simples de captura de afinidade de fase líquida. Principalmente, esferas magnéticas revestidas de cobalto são usadas para puxar para baixo proteínas marcadas, bem como quaisquer proteínas marcadas com rádio em interação. Primeiro, misture as proteínas rotuladas e marcadas e incube em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione esferas magnéticas que reconheçam a etiqueta, separe a fração ligada da proteína marcada da fração não ligada usando ímãs. Em seguida, meça o sinal da proteína marcada encontrada na fração não ligada e determine a quantidade de proteína marcada encontrada na fração não ligada. Os resultados deste ensaio de afinidade de fase líquida são extremamente úteis quando proteínas sensíveis à conversão confirmacional são testadas.

Este ensaio de captura de afinidade em fase líquida pode fornecer informações sobre a interação entre o poliovírus, reconhecendo nano boies e diferentes antígenos de poliovírus. O método também pode ser aplicado a outras interações proteína-proteína, desde que uma proteína possa ser marcada e a outra possa ser detectada. Tivemos o ID para esses métodos pela primeira vez quando estávamos interessados em investigar a interação entre o poliovírus, reconhecendo nanocorpos e diferentes antígenos de poliovírus.

Como o poliovírus é sensível à conversão confirmacional, quando ligado a uma superfície sólida, o uso de e LSA é limitado. Deve, portanto, ser preferido um sistema baseado em fase líquida. Um exemplo de tal sistema baseado em fase líquida frequentemente usado na pesquisa do poliovírus é a microproteína.

Um ensaio de imunoprecipitação. Embora este teste tenha comprovado sua aplicabilidade, ele requer a estrutura cristalizada de um anticorpo convencional, que está ausente em nanocorpos. Esses nanocorpos, que são anticorpos de domínio único interessantes e muito estáveis, podem ser facilmente projetados com texto diferente.

O amplamente utilizado. A pilha mostra afinidade por íons bivalentes, como níquel e cobalto, que por sua vez podem ser facilmente revestidos em esferas magnéticas. Portanto, desenvolvemos o ensaio de captura de afinidade quantitativa simples baseado em esferas magnéticas revestidas de cobalto.

Reese é o estoque de contas magnéticas por vórtice e transfere 10 microlitros para cada amostra em um tubo pellet as contas usando um ímã. Remova o supinado transparente para lavar as contas. Adicione 150 microlitros de tampão de ligação.

Colha as contas usando um ímã e remova o supinato após uma segunda lavagem. Ressuspenda os grânulos em 40 microlitros de tampão de ligação para cada amostra a ser controlada. Para o fundo da amostra um, prepare um poço sem vírus radiomarcado, mas com o mesmo volume de tampão de ligação para controle.

Amostra dois de 100% de atividade de rádio. Adicione todos os componentes em um poço, exceto substitua o nano corpo por um tampão de ligação. Agora adicione 2000 contagens por minuto de poliovírus marcado com S 35 tipo de cepa sete tipo um em um volume total de 80 microlitros de tampão de ligação a todas as amostras.

Aceite o controle. Amostra um. Adicione 10 microlitros de diluição de nano corpo a cada amostra.

Misture bem por 10 segundos em uma coqueteleira e incube por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 40 microlitros da suspensão magnética lavada e incube por 10 minutos à temperatura ambiente sob agitação contínua, pelete as esferas com um ímã e transfira o SUP claro para um tubo para medir a radioatividade de cada amostra, transfira 50 microlitros do supinato para um balão de contagem. Adicione três mililitros de mistura de fluido de cintilação e leia sobre este isolamento.

Contra-puxe as esferas magnéticas usadas em um tubo usando água e centrifugue 500 vezes G por dois minutos. Descarte o supinato e suspenda novamente as contas em seis mililitros de hidróxido de sódio 0,5 molar. Em seguida, alíquota da suspensão em vários tubos e incubar em um banho ultrassônico por cinco minutos.

Depois de peletar as esferas com um ímã e remover o supinato, adicione um mililitro de solução de SDS a 2% a cada tubo e, em seguida, misture por vórtice e papel alumínio por cinco minutos. Agora, colha as contas. Adicione um mililitro de EDTA 0,2 molar pH sete a cada tubo e incube os tubos em um banho ultrassônico por cinco minutos.

Em seguida, recolha as contas, lave-as com um mililitro de água três vezes, seguido de um mililitro de solução de cloreto de cobalto a 10 milimolares. Coloque os tubos em uma coqueteleira por 10 minutos. Prossiga para colher contas em um ímã e ressus, suspenda em um mililitro de tampão de ligação.

Lave duas vezes em um mililitro de 20% de etanol, finalmente ressuspenda os grânulos em seu volume original de 20% de etanol para obter grânulos regenerados em uma concentração de 40 miligramas por mililitro. Corrija a radioatividade de fundo definindo o controle. Amostra um como o valor de 0% de radioatividade e controle amostra dois como o valor de 100% de radioatividade.

Agora, para cada amostra, calcule a porcentagem de radioatividade no estado como uma medida da precipitação geral do vírus marcado com rádio pelo nanocorpo. Este experimento avalia a afinidade do PVSS 38 C e do anticorpo específico para o poliovírus usando três antígenos diferentes do poliovírus, antígeno nativo, antígeno aquecido e subunidades 14 s. Curiosamente, a radioatividade no estado das amostras contendo subunidades 14 s marcadas com rádio diminui com o aumento das concentrações do nano corpo PVSS 38 C. Isso indica um aumento na quantidade de subunidades do Poliovírus 14 s conectadas ao nano corpo P pvs, S 38 C e indiretamente aos grânulos magnéticos.

Uma vez que não é observada afinidade de pvs S 38 C para a forma antigênica N e antigênica H do poliovírus, o nanocorpo parece específico para a subunidade 14 s do poliovírus. A afinidade do nanocorpo com seus antígenos, medida por este método, é específica como o nanocorpo não relacionado. O NB um não mostra reatividade contra as três formas antigênicas do poliovírus.

Este sistema produz alta reprodutibilidade, conforme indicado nesta curva de resposta à dose gerada por diferentes investigadores em dias diferentes. Uma vez dominada esta fase líquida confiável, o ensaio de captura de afinidade pode ser realizado adequadamente dentro de duas horas, reciclando as batidas incluídas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar este ensaio de captura de afinidade de fase líquida baseado em batimentos magnéticos ao estudar a interação entre diferentes proteínas, especialmente quando sistemas baseados em fase sólida não podem ser usados.