Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

Aqui apresentamos um protocolo aceito pela comunidade em formato multimídia para injeção sub-retina de um bolus de células RPE em ratos e camundongos. Essa abordagem pode ser usada para determinar potenciais de resgate, perfis de segurança e capacidades de sobrevivência de células RPE enxertadas após implantação em modelos animais de degeneração retiniana.

O objetivo geral deste procedimento é injetar pigmento retiniano, epitélio ou células RPE no espaço sub-retiniano de roedores, minimizando o trauma. Isso é feito primeiro usando uma agulha afiada para fazer um buraco no olho de um animal calmo. Em seguida, as células são injetadas no espaço sub-retiniano usando uma agulha romba.

Na etapa final, o olho é revestido com hidratante para mantê-lo hidratado. Em última análise, as modalidades de histologia e imagem in vivo podem ser usadas para monitorar a eficácia da injeção. Embora o método que mostramos hoje tenha sido especificamente adaptado para a entrega de células RPE no espaço sub-retiniano, a técnica em si é amplamente aplicável à entrega de uma variedade de outros tipos de células e produtos químicos no espaço sub-retiniano para serem usados em uma variedade de estudos pré-clínicos.

Geralmente, os indivíduos que são novos nesse método terão dificuldades porque é difícil ver o quão bem a injeção foi executada. As demonstrações visuais desse método são críticas, pois as etapas de injeção são difíceis de aprender sem vê-las realizadas. Pessoalmente.

Cerca de uma hora antes da injeção, pré-aqueça uma solução de dissociação de células sem tripsina, PBS estéril e meios de cultura a 37 graus Celsius, desmonte e coloque os componentes de uma seringa com uma agulha romba de calibre 33 em água fervente. Em seguida, retire as células RPE da solução de dissociação celular por cinco a oito minutos. A 37 graus Celsius, raspando suavemente para liberar quaisquer células que ainda estejam presas e, em seguida, dilua as células em 15 mililitros de meio de cultura para inativar a enzima, transfira as células dissociadas para um tubo de 15 mililitros e, após a contagem, gire as células e ressuspenda o pellet em duas vezes 10 elevado à quinta célula por microlitro em pré-aquecimento estéril.

O PBS então transfere as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e carrega a seringa esterilizada com 0,5 microlitros de células para injeção imediata para injetar as células Após a confirmação da sedação pelo dedo do pé, aperte, coloque o roedor anestesiado de lado de forma que o olho que será injetado fique voltado para cima. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, segure a cabeça do animal com dois dedos logo acima da orelha e pela mandíbula e estique suavemente a pele paralela às pálpebras para que o olho saia ligeiramente da órbita. Em seguida, segurando-o em um ângulo.

Para evitar tocar na lente e tomar cuidado para evitar vasos, use a agulha afiada de calibre 30 para fazer um orifício imediatamente abaixo das injeções de limbo. Trabalhe melhor com duas pessoas para que uma pessoa possa passar o injetor, a agulha cega e a seringa, permitindo que o injetor mantenha o foco no olho do mouse. Agora retraia a agulha afiada descartável do olho, mantendo o aperto na cabeça.

Tomando cuidado para lembrar exatamente onde está o orifício e montar a seringa pré-carregada. Equipado com a agulha romba em um micro manipulador, insira a ponta da agulha romba através do orifício. Tomando cuidado, novamente, para não tocar na lente e empurre suavemente a agulha pelo olho até sentir resistência.

Mantendo todos os movimentos no mínimo. Injete cuidadosamente as células RPE lentamente no espaço sub-retiniano. Ocorrerá descolamento de retina do EPR.

No entanto, uma injeção mais limpa minimiza o descolamento e melhora muito as chances de recolocação, depois retraia a seringa lentamente e aplique gotas hidratantes para os olhos para manter os olhos hidratados, monitorando o animal até que esteja totalmente recuperado. As células RPE podem ser entregues no espaço sub-retiniano de roedores de forma rápida e consistente. Usando esta técnica.

Embora não seja necessário, os traumas podem ser bastante minimizados usando um micro manipulador. Com essa configuração, quando realizada de forma limpa, a fluorescência das células RPE marcadas pode ser detectada usando um oftalmoscópio de varredura confocal e o descolamento de retina induzido pode ser visualizado usando um sistema de tomografia de coerência óptica. A oftalmoscopia de varredura confocal foi usada para capturar essas imagens ao redor de todo o local da injeção imediatamente após a injeção sub-retiniana.

Observe que o descolamento que é o mais profundo, mas não grave, nas imagens centrais Uma vez dominado, a injeção real pode ser realizada em cinco minutos se for feita corretamente Ao participar deste procedimento, é importante trabalhar com cuidado e manter os movimentos desnecessários ao mínimo. Depois de assistir a este vídeo, esperamos que você tenha uma boa compreensão e apreciação da técnica de injeção sub-retiniana em roedores. Esperamos que esta seja uma maneira eficaz de entregar células, ao mesmo tempo em que minimiza o desconforto e o trauma para os olhos dos roedores.