Name: Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4 + CD45RB Alta Células T em imunodeficientes Mice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a induzir colite em camundongos imunodeficientes por transferência adotiva de células T CD4+ CD45RBhigh. Este modelo reproduz características da doença inflamatória intestinal humana para estudo de patogênese e terapias.

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Este trabalho foi financiado pela Associação Americana de Gastroenterologia (AGA) Research Award Scholars e Doença de Crohn e Colite Foundation of America (CCFA) Desenvolvimento de Carreira Award (a ENS), NIH NIDDK F30 DK089692 (a ECS) e University of North Carolina Centro de Biologia Gastrointestinal e Doença Grant P30 DK34987 (Histologia Core). O Mecanismo UNC Citometria de Fluxo Core é apoiado em parte por uma NCI Centro de Suporte Grant Núcleo (P30CA016086) à Comprehensive Cancer Center UNC Lineberger. Agradecemos Luke B. Borst da North Carolina State University College de Medicina Veterinária por sua ajuda com a análise histopatológica e imuno-histoquímica.

NOTA: Certifique-se que todos os protocolos de animais são aprovados por e em conformidade com Institutional Animal Care e do Comitê Use regulamentos (IACUC) e no Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para a Conservação e Uso de Animais de Laboratório. Camundongos doadores podem ter sexo masculino ou feminino, mas ratos destinatário devem ser do sexo masculino. Se os destinatários do sexo feminino devem ser utilizados, os camundongos doadores têm que ser fêmeas 5. Manter colónias usando, roupa de cama não estéril normal e água não acidificado, uma vez que estes podem causar impacto na microbiota intestinal, e, portanto, o fenótipo dos ratinhos colite 5,6. 1. Preparação Experimental <ol><li> Use mídia e buffers geladas. Mantenha as células no gelo durante todo o experimento. </li><li> Realizar o experimento na capa de risco biológico estéril usando técnica estéril. </li></ol> 2. Isolamento de células T do baço <ol><li> Sacrificá camundongo doador / mice em CO 2 câmara seguido por dislocatio cervicaln. Spray de abdômen com etanol 70%. </li><li> Faça uma incisão horizontal no abdômen e descascar a pele para expor peritônio. Segure peritônio longe dos órgãos internos com a pinça e fazer uma incisão no peritônio abdominal esquerda para expor e extirpar o baço. </li><li> Inserir o baço em 10 ml de Meios completa em uma placa de Petri. Retire e elimine o excesso de tecido do baço. </li><li> Use duas lâminas de vidro esterilizados para esmagar e provocar uma separação baço em suspensão de uma única célula. Suspensão de células Filtrar através de um filtro de 70 mm em um tubo de 50 ml e lavar filtro com 5 ml de Meio Completo. Coloque até 5 baços em um tubo de 50 ml cônico. </li><li> Centrifugar células a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos. </li><li> Suavemente ressuspender as células em 5 ml por baço de um tampão de lise, para lisar as células vermelhas do sangue durante 10 min à temperatura ambiente. Adicionar um volume igual de meio completo (5 ml por baço) para o tubo. </li><li&gt; células centrifugar a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos. </li><li> Volte a suspender suavemente as células em 10 ml de Etiquetagem Buffer. </li><li> Contagem de células por exclusão de azul de tripano. <ol><li> Retirar 20 l de suspensão de células e adicionar 180 mL de azul tripano para um tubo de microcentrífuga e misture bem. Após 5 min, adicionar 10 ul de células e contagem em hemocitómetro células não-azul sob o microscópio rotulados. Determinar o número total de células viáveis. Descarte de células / trypan azul mix. </li></ol></li><li> Centrifugar células em 10 ml de Etiquetagem tampão a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos. </li></ol> 3. O enriquecimento de células T CD4 + NOTA: Siga as instruções do fabricante para produtos específicos utilizados nesta seção. <ol><li> Suavemente ressuspender as células a uma suspensão de uma única célula de 20 x 10 6 células / ml em Etiqueta frioing Buffer. </li><li> Adicionar 5 mL por 1 x 10 6 células de anticorpos de enriquecimento de células T CD4 bioestanhados. Incubar as células em gelo durante 15 min. </li><li> Adicionar 10x volume de Etiquetagem Buffer. Centrifugar células a 450 × g por 7 min. Aspirar cuidadosamente todo o sobrenadante usando sucção a vácuo em um recipiente de resíduos. </li><li> Absolutamente vortex partículas magnéticas de estreptavidina conjugada. Adiciona-se 5 ul de partículas por 1 x 10 6 células. </li><li> Misture bem, mas com cuidado. Mantenha a mistura a 6-12 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar Etiquetagem Tampão a uma concentração de 20-80 x 10 6 células / ml. Transferir-se para 1,0 ml de células marcadas por 12 x 75 mm Tubo de ensaio de fundo redondo (referido como o &quot;tubo-fracção positiva&quot;). </li><li> Coloque cada tubo fração positivo no ímã para 6-8 min. </li><li> Com os tubos de fração positiva ainda no ímã, transferir cuidadosamente sobrenadante do tubo-fração positiva com Pasteur de vidro pipeta para uma nova estéreis tubo de 50 ml (referred como a &quot;fracção enriquecida&quot;). Esta fração enriquecida contém células T CD4 +. Tenha cuidado para não perturbar as células marcadas atraídos pelo ímã. </li><li> Suspenda as células deixaram nos tubos-fração positiva no mesmo volume de Etiquetagem tampão como no passo 3,6 por pipetagem cima e para baixo vigorosamente. Coloque tube-fração positiva para trás em ímã para 6-8 min. </li><li> Com tubos de fração positiva ainda no ímã, transferir cuidadosamente sobrenadante (fração enriquecida, CD4 +) a partir de tubo-fração positiva com vidro Pasteur pipeta para estéril tubo de 50 ml a partir do passo 3.8, sem perturbar as células unidas a ímã. </li><li> Repita os passos 3,9-3,10 para aumentar o rendimento de células CD4 + T obtidas. Continuar protocolo utilizando fracção enriquecida (células CD4 +). </li></ol> 4. Rotulagem e Classificando Cells 7 <ol><li> Centrífuga enriquecido células a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou suct vácuoíon no recipiente de resíduos. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de Etiquetagem buffer. Remover alíquota de células para contar, para avaliar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano como no passo 2.9. </li><li> Adicionar um volume de Etiquetagem Buffer para 10 x 10 6 células / ml; se as células já estão &lt;10 x 10 6, centrifugar a 450 g durante 7 min, elimine o sobrenadante por vazamento off ou de sucção a vácuo em um recipiente de resíduos, e adicionar volume de Etiquetagem Buffer para 10 x 10 6 células / ml. <ol><li> Configure alíquotas separadas de aproximadamente 5-10 × 10 5 células cada para células de controlo não coradas, manchada de isótipo, e single-coradas em tubos de microcentrífuga. </li></ol></li><li> Adicionam-se 5 ug / ml de CD4-FITC e 1 ug / ml a CD45RB-PE para as células. Adicionar manchas de controlo de isotipo e as manchas individuais com a mesma concentração de alíquotas em tubos de microcentrífuga apropriados. Misture bem, mas com cuidado e incubar em gelo protegida da luz durante 30 min. </li><li> Adicionar 10x volume de Etiquetagem Buffer para células e controles. Centrífuga 450 g durante 7 min. Elimine o sobrenadante por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos. </li><li> Ressuspender em Labeling Buffer para o volume na etapa 4.5. Centrífuga 450 g durante 7 min. Elimine o sobrenadante por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos. </li><li> Ressuspender em Labeling Buffer para 10 x 10 6 células / ml. Passa através de células 70 um filtro em tubo FACS. Mantenha no gelo protegido da luz até que esteja pronto para FACS. </li><li> Configure e determinar a compensação apropriada no separador de células com células não coradas e controles individuais manchada. </li><li> Excluir células não viáveis ​​com forwarder e side-dispersão gating (Figura 1A). Configure gating para células CD45RB + CD4 + e com controles manchada de isótipo. Células portão à população CD4 +. </li><li> Ordenar CD4 + células em CD45RB alta e CD45RB populações de baixa usando um histograma simples para as células marcadas com PE em tubos com 2 ml de Meio Completo. O CD45RB alta </sup&gt; população representa o mais alto de 40% das células T CD4 + CD45RB + células (CD45RB alta), e a população de baixa CD45RB é o mais baixo de 20% das células CD4 + CD45RB + (CD45RB baixo; Figura 1B). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig1.jpg" /> Figura 1: citometria de fluxo representativas parcelas de populações de células T CD4 + CD45RB durante a análise FACS (A - C) com FITC e CD4-PE esplenócitos CD45RB-corados de dadores murganhos C57BL / 6 foram classificadas por FACS em células CD4 + CD45RB high e CD4 +. populações de células T CD45RB baixo. Eventos (A) Doublet foram excluídos do gráfico de dispersão para a frente. (B) Os linfócitos foram fechado na trama dispersão frontal e lateral. (C) CD4 + </sup&gt; células T foram fechado, e células (D) CD4 + CD45RB + T foram plotados em um PE contra Eventos histograma. As células T CD4 + CD45RB baixas foram consideradas ser a mais baixa de 20% de células + CD45RB. As células T CD4 + CD45RB elevados foram definidos como a mais alta de 40% de células + CD45RB. <ol start="11"><li> Executar uma alíquota de cada população de células sobre a máquina de FACS para avaliar a pureza das populações. </li><li> Centrífuga classificadas células a 450 xg por 7 min. Ressuspender em 1 ml de PBS. Remover alíquota de células para contar, para avaliar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano como no passo 2.9. </li></ol> 5. injeção de células em Destinatários <ol><li> Ressuspender classificados células a 4 x 10 6 células / ml (alta CD45RB) ou 2 x 10 6 células / ml (CD45RB baixo) em PBS. </li><li> Transferir 100 ml de células de alta CD45RB por beneficiário para novo tubo estéril. Adicionar 100 ul de PBS pordestinatário a este tubo. Assim, o volume total de injecção por animal é de 200 l, e valor total de células por beneficiário é de 4 x 10 5 CD4 + CD45RB células T naive elevados. </li><li> Se o grupo experimental receber células T reguladoras é desejada, transferir 100 ml de células de alta CD45RB por beneficiário para novo tubo estéril. Adicionar 100 ul de células de baixa CD45RB por recipiente para o mesmo tubo. O volume total de injecção por animal é de 200 uL; proporção de CD45RB alta: células de baixa CD45RB é 2: 1. </li><li> Injectar 100 ul de CD45RB alta ou CD45RB alta CD45RB baixo CD4 + células / intraperitoneal em o lado direito e esquerdo do abdômen (total de 200 ul) de cada destinatário. </li></ol> 6. Monitoramento da progressão da doença em animais receptores <ol><li> Para avaliar o estado clínico dos animais receptores, atribuir escores clínicos agregados para o seguinte parameters 8 no dia da injecção, decorrida uma semana, e no momento do sacrifício: <ol><li> Determine desperdiçando medindo a perda de peso: 0 - sem perda de peso; Perda de 0,1-10% do peso corporal inicial - 1; 2 - A perda de mais de 10% do peso corporal inicial (Figura 2A). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" width="650" /> Figura 2: sinais patológicos clínicos e brutas de inflamação ocorrem após a transferência de tipo selvagem CD4 + CD45RB células T em alta RAG1 - / - e ratos destinatário NRDKO 11 (a) destinatários NRDKO perderam, em média, 10% do seu peso corporal inicial por 5. semanas após a transferência, enquanto RAG1- / - Os beneficiários não apresentaram sinais clínicos da doença neste momento. Cada ponto representa a média percentual do peso corporal inicial para a coorte ± SEM. **, P &lt;0,005. (B) Alguns ratos desenvolveram inflamação intestinal grave, como demonstrado pela presença de prolapso retal. Esta é uma imagem representativa de prolapso retal em um mouse destinatário NRDKO. (C) Grosseiramente, a partir de dois pontos, tanto RAG1 - / - e ratinhos receptores NRDKO são espessadas e menor do que os dois pontos de RAG1 - / - e ratinhos NRDKO sem transferência adoptiva de células T. Colons de ratos receptores NRDKO mostrar inflamação grave e aumentou o peso dos dois pontos (dados não mostrados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52533/52533fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol><li><ol start="2"><li> Determinar a qualidade das fezes dos animais, colocando em recipiente limpo até que ele passoubanquinho: 0 - none; 1 - fezes moles; 2 - fezes aquosas e / ou com sangue. </li><li> Determinar a saúde geral do animal através presença dos seguintes sinais da doença: 0 - nenhuma postura arqueada, eriçou pele, ou pele lesões; 1 - qualquer um de presente o seguinte: debruçado postura, eriçou pele, ou lesões de pele. </li><li> Determinar a presença de prolapso retal: 0 - ausente; 1 - presente (Figura 2B). </li></ol></li><li> Sacrificar animais por inalação de CO2 seguido por deslocamento cervical, quando eles perderam 20% do seu peso corporal inicial ou no ponto de tempo desejado, o que ocorrer primeiro. A doença clínica é tipicamente evidente a partir de 5 semanas de pós-repletion. </li><li> Avaliar para a gravidade da doença, como descrito anteriormente 5,7. <ol><li> Atribuir escores clínicos como no passo 6.1 8. </li><li> Medir o comprimento do cólon e do peso (Figura 2C). </li><li> Realizar análise histológica de inflamação5. </li><li> Determine a expressão das citocinas espontânea em intestinais culturas de explantes tecido 9, linfa mesentéricos 10, e / ou soro 11. <ol><li> Resumidamente, para culturas de explantes 9, remover dois pontos após o sacrifício, aberta longitudinalmente, e limpo, com PBS. Incubar dois pontos, num agitador orbital a 250 rpm, em Meio Completo, durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Picar o tecido em pequenos pedaços e incubados a 37 ° C em Meio Completo, durante 24 h. Recolhe-se o sobrenadante e utilizar para a quantificação de citocinas por 100 mg de tecido por ELISA. </li></ol></li><li> Realizar ex vivo caracterização de fenótipos de células T e / ou função 10. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li>
<li>Cho, J. H., Brant, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+the+genetics+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease.</a> Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011).</li>
<li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li>
<li>Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypically+distinct+subsets+of+CD4%2B+T+cells+induce+or+protect+from+chronic+intestinal+inflammation+in+C.+B-17+scid+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice.</a> Int Immunol. 5 (11), 1461-1471 (1993).</li>
<li>Ostanin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+transfer+model+of+chronic+colitis%3A+concepts%2C+considerations%2C+and+tricks+of+the+trade%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (2), 135-146 (2009).</li>
<li>Ma, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+habitat+change%3A+a+source+of+unrecognized+transient+alteration+of+intestinal+microbiota+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Routine habitat change: a source of unrecognized transient alteration of intestinal microbiota in laboratory mice.</a> PLoS One. 7 (10), e47416(2012).</li>
<li>Read, S., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+inflammatory+bowel+disease+in+immunodeficient+mice+by+depletion+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction of inflammatory bowel disease in immunodeficient mice by depletion of regulatory T cells.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 15 (Unit 15 13), (1999).</li>
<li>Maillard, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wiskott-Aldrich+syndrome+protein+is+required+for+the+function+of+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Wiskott-Aldrich syndrome protein is required for the function of CD4(+)CD25(+)Foxp3(+) regulatory T cells.</a> J Exp Med. 204 (2), 381-391 (2007).</li>
<li>Hegazi, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide+ameliorates+chronic+murine+colitis+through+a+heme+oxygenase+1-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide ameliorates chronic murine colitis through a heme oxygenase 1-dependent pathway.</a> J Exp Med. 202 (12), 1703-1713 (2005).</li>
<li>Kole, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+regulate+effector+and+regulatory+T+cell+accumulation+and+anti-inflammatory+cytokine+production+during+T+cell-mediated+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs regulate effector and regulatory T cell accumulation and anti-inflammatory cytokine production during T cell-mediated colitis.</a> J Immunol. 191 (5), 2771-2779 (2013).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIL3-deficient+mice+develop+microbiota-dependent%2C+IL-12%2F23-driven+spontaneous+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NFIL3-deficient mice develop microbiota-dependent, IL-12/23-driven spontaneous colitis.</a> J Immunol. 192 (4), 1918-1927 (2014).</li>
<li>Steinbach, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+PI3K+p110delta+Regulates+Th1%2FTh17+Development+and+Microbiota-Dependent+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Innate PI3K p110delta Regulates Th1/Th17 Development and Microbiota-Dependent Colitis.</a> J Immunol. 192 (8), 3958-3968 (2014).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NFIL3+is+a+regulator+of+IL-12+p40+in+macrophages+and+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">NFIL3 is a regulator of IL-12 p40 in macrophages and mucosal immunity.</a> J Immunol. 186 (8), 4649-4655 (2011).</li>
<li>Leach, M. W., Bean, A. G., Mauze, S., Coffman, R. L., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease+in+C.B-17+scid+mice+reconstituted+with+the+CD45RBhigh+subset+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease in C.B-17 scid mice reconstituted with the CD45RBhigh subset of CD4+ T cells.</a> Am J Pathol. 148 (5), 1503-1515 (1996).</li>
<li>Powrie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Th1+responses+prevents+inflammatory+bowel+disease+in+scid+mice+reconstituted+with+CD45RBhi+CD4%5BTitle%5D)+AND+%22T+cells.+Immunity%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Th1 responses prevents inflammatory bowel disease in scid mice reconstituted with CD45RBhi CD4.</a> T cells. Immunity. 1 (7), 553-562 (1994).</li>
<li>Read, S., Malmstrom, V., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte-associated+antigen+4+plays+an+essential+role+in+the+function+of+CD25%28%2B%29CD4%28%2B%29+regulatory+cells+that+control+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation.</a> J Exp Med. 192 (2), 295-302 (2000).</li>
<li>Rogers, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+divergence+in+gastrointestinal+microbiota+in+physically-separated+genetically+identical+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Functional divergence in gastrointestinal microbiota in physically-separated genetically identical mice.</a> Sci Rep. 4, 5437(2014).</li>
<li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+differentiation+factor+88+%28MyD88%29+is+required+for+CD4%2B+T+cell+effector+function+in+a+murine+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The myeloid differentiation factor 88 (MyD88) is required for CD4+ T cell effector function in a murine model of inflammatory bowel disease.</a> J Immunol. 180 (3), 1886-1894 (2008).</li>
<li>Kurtz, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+adenosine+regulates+colitis+through+effects+on+lymphoid+and+nonlymphoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular adenosine regulates colitis through effects on lymphoid and nonlymphoid cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 307 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Naganuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Critical+role+for+A2A+adenosine+receptors+in+the+T+cell-mediated+regulation+of+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Critical role for A2A adenosine receptors in the T cell-mediated regulation of colitis.</a> J Immunol. 177 (5), 2765-2769 (2006).</li>
<li>Ranatunga, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protective+role+for+human+IL-10-expressing+CD4%2B+T+cells+in+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A protective role for human IL-10-expressing CD4+ T cells in colitis.</a> J Immunol. 189 (3), 1243-1252 (2012).</li>
<li>Srikrishna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxylated+glycans+mediate+colitis+through+activation+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Carboxylated glycans mediate colitis through activation of NF-kappa.</a> B. J Immunol. 175 (8), 5412-5422 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1153-1163 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui nós descrevemos um protocolo passo-a-passo induzindo a inflamação do cólon em camundongos por transferência adotiva de células CD4 + T + CD45RB em ratos imunodeficientes. Usamos baços C57BL / 6 doadores e RAG1 singeneico - / - ratinhos receptores, embora outras estirpes (por exemplo, BALB / c, 129S6 / SvEv, não-obesos diabéticos (NOD)) modelos e genéticos da imunodeficiência (por exemplo, SCID, RAG2 - / -) também pode ser utilizado <sup...

As doenças inflamatórias intestinais (DII) A doença de Crohn e a colite ulcerativa resultam de uma interação complexa e incompletamente definida entre as respostas imunes do hospedeiro, a suscetibilidade genética, os fatores ambientais e o conteúdo luminal entérico1. Estudos recentes de associação de todo o genoma relatam associações entre genes reguladores de células imunes e suscetibilidade à DII2,3. Os genes intrínsecos das células imunes inatas e adaptativas estão representados nesses estudos, indicando um papel central para essas populações de células na patogênese da DII.
Atualmente, existem mais de 50 modelos animais de DII humana. Embora nenhum modelo fenocopie perfeitamente a DII humana, muitos são úteis para estudar vários aspectos da doença humana, incluindo o início e a progressão da doença e a resposta à cicatrização de feridas. No método descrito aqui, a inflamação intestinal é iniciada com transferência adotiva de células Taltas CD4+CD45RB esplênicas singénicas para camundongos receptores deficientes em células T e B4. A população de células Taltas CD4 + CD45RB contém principalmente células T virgens preparadas para ativação que são capazes de induzir inflamação crônica do intestino delgado e do cólon. Este método permite que o pesquisador modifique as principais variáveis experimentais, incluindo populações de células imunes inatas e adaptativas, para responder a questões biologicamente relevantes relacionadas à patogênese da doença. Além disso, este método fornece início preciso do início da doença e um curso de tempo experimental bem caracterizado. Isso permite o estudo cinético das características clínicas da progressão da doença em camundongos. A inflamação intestinal induzida por este método compartilha muitas características com a DII humana, incluindo inflamação transmural crônica do intestino grosso e delgado, patogênese impulsionada por citocinas como TNF e IL-12 e sintomas sistêmicos, como perda de peso5. Assim, é um sistema modelo ideal para estudar a patogênese da DII humana.
O método aqui descrito em detalhes o protocolo para induzir colite experimental por transferência adotiva de células Taltas CD4+CD45RB para camundongos Rag1-/-. Discutimos as principais etapas técnicas, resultados esperados, otimização e solução de problemas. Abordamos os elementos necessários para o desenvolvimento bem-sucedido deste modelo murino de inflamação intestinal para fins de pesquisa.

<table><tbody><tr><td>Nome do Reagente/ Equipamento</td><td>Número de catálogo da empresa</td><td></td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm tubo de fundo redondo</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>15 ml cônico</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 Agulha</td><td>BD Biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>50 ml cônico</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430828</tr><tr><td>70 &#956; Filtro de Células</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>BD IMagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>35602</td><td></td></tr><tr><td>CD4-FITC IgG2b</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td></td></tr><tr><td>CD45RB-PE IgG2a</td><td>BD Pharminogen</td><td>553101</td><td></td></tr><tr><td>Mídia</td><td></td><td></td> Completa <td>RPMI-1640, 1% Caneta/Estreptococo, 10% FBS, 0,0004% Tubo &beta;-ME</td></tr><tr><td>FACS + filtro</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio de Vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>12550A3</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de Rotulagem FBS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td>Inativado</tr> por <tr><td>Calor</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td><td></td><td></td><td>0,08% NH4Cl, 0,1% KHCO3, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse CD4 Conjunto de enriquecimento de linfócitos T - DM</td><td>BD Biosciences</td><td>558131</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2a-PE</td><td>BD Pharminogen</td><td>553457</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG2b-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4732</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Solução de</td> Penicilina-Estreptomicina <td>Fisherbrand 13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>, 100X</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>Etanol Puro 200 Prova</td><td>Decon Labs</td><td>2705-HC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11-875-093</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Trypan azul</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mídia</td><td></td><td></td> de lavagem <td>RPMI-1640, 1% caneta/estreptococos, 0,0004% &beta;-ME</td></tr></tbody></table>

indução de murino inflamação intestinal por transferência adotiva de effector cd4<sup&gt; +</sup&gt; cd45rb<sup&gt; alta</sup&gt; células t em imunodeficientes mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Existem muitos modelos diferentes de animais disponíveis para estudar a patogênese de doenças humanas inflamatórias intestinais (DII), cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Descrevemos aqui um modelo de colite experimental que é iniciada por transferência adoptiva de células de baço singeneicas CD4 + CD45RB high T em ratinhos deficientes em receptores de células T e B. A população de células T CD4 + elevada CD45RB que consiste em grande parte de células efectoras naive é capaz de induzir a inflamação intestinal crónica, assemelhando-se intimamente os aspectos chave da DII humana. Este método pode ser manipulado para estudar os aspectos do aparecimento e progressão da doença. Além disso, ele pode ser utilizado para estudar a função de inata e adaptativa, e as populações de células imunitárias reguladoras, e o papel da exposição ambiental, ou seja, a microbiota, na inflamação intestinal. Neste artigo, ilustram a metodologia para a indução de colite com um protocolo passo-a-passo. Este includes um vídeo de demonstração de aspectos técnicos essenciais necessários para desenvolver com sucesso este modelo murino de colite experimental para fins de pesquisa.

Aproximadamente 10 x 10 6 de células T CD4 + CD45RB high T de baços de 10 adultos C57BL / 6 murganhos dadores são seguramente isolado. Este número variará, dependendo da idade e estirpe do rato dador e a proficiência do investigador. Quando 4 x 10 5 C57BL / 6 células CD4 + T CD45RB alta são transferidos para C57BL / 6 RAG1 - / - ratinhos receptores, sinais clínicos da doença surgir em torno semana 5 pós-repletion ou antes, se os ratos ...

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir inflamação colônica em camundongos por transferência adotiva de células Taltas CD4+CD45RB singênicas para receptores deficientes em células T e B. As características clínicas e histopatológicas mimetizam as doenças inflamatórias intestinais humanas. Este método permite o estudo do início da inflamação colônica e da progressão da doença.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir inflamação intestinal por meio da transferência adotiva de linfócitos T ingênuos para camundongos imunodeficientes. Isso é realizado primeiramente isolando células dos baços de camundongos, lisando as células sanguíneas e, em seguida, enriquecendo a população para linfócitos T positivos para CD4. O segundo passo consiste em marcar essas células com anticorpos fluorescentes conjugados com DI anti-CD4 e anti-CD45RB.Em seguida, as células marcadas são separadas por meio de citometria de fluxo em populações CD45 RB baixo e CD45 RB alto. O passo final consiste em transferir as células CD45 RB alto para camundongos imunodeficientes por injeção intraperitoneal. Em última instância, as células transferidas são ativadas e causam dano tecidual local na ausência de células T reguladoras, resultando em colite experimental.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo das doenças inflamatórias intestinais, como o papel de populações celulares específicas e da microbiota gastrointestinal na patogênese da doença. Após eutanasiar o camundongo doador, pulverize o abdômen com etanol a 70% para esterilizar a área. Em seguida, faça uma incisão horizontal no abdômen e puxe para trás a pele com pinça para expor o peritônio.Mantenha o peritônio afastado dos órgãos internos e faça uma incisão no peritônio abdominal esquerdo. Em seguida, excise o baço do camundongo e coloque-o em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de meio completo gelado. Esmague o baço com duas lâminas de vidro estéreis para obter uma suspensão simples de células.Filtre as células através de uma peneira de 70 micrômetros para um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, lave a peneira com cinco mililitros de meio completo, combinando até cinco baços em um único tubo cônico. Em seguida, centrifugue as células a 450 × g durante sete minutos a quatro graus Celsius. Aspire o sobrenadante para um recipiente de resíduos e, então, ressuspenda suavemente as células em 10 mililitros de tampão de marcação gelado.Combine 20 microlitros da suspensão celular com 180 microlitros de solução de azul de tripano a 0,4% e incube as células por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 10 microlitros da suspensão celular a um hemocitômetro e conte o número de células não azuladas ao microscópio para iniciar o pellet de enriquecimento e ressuspenda suavemente as células em tampão de marcação gelado, numa concentração de 20 × 10⁶ células por mililitro. Adicione cinco microlitros do anticorpo de enriquecimento de células T marcado com biotina anti-CD4 por 1 × 10⁶ células e, em seguida, incube as células no gelo com o anticorpo por 15 minutos.Adicione 10 vezes o volume do tampão de marcação à suspensão celular e, em seguida, centrifugue as células a 450 × g durante sete minutos. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular. Em seguida, re-suspenda as partículas magnéticas conjugadas com estreptavidina por vortex e adicione cinco microlitros de partículas por 1 × 10⁶ células às células.Misture as partículas com as células batendo suavemente no tubo e, em seguida, incube a mistura a seis a 12 graus Celsius por 30 minutos. Ressuspenda as células em uma concentração de 20 a 80 vezes 10 à sexta células por mililitro com tampão de marcação. Em seguida, transfira um mililitro de células marcadas para um tubo de ensaio redondo de fundo com dimensões de 12 milímetros por 75 milímetros e coloque este tubo da fração positiva sobre um ímã por seis a oito minutos.Com o tubo no ímã, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur sem perturbar as células marcadas e transfira-o para um novo tubo cônico estéril de 50 mililitros. Esta fração contém as células T positivas para CD4. Remova o tubo da fração positiva do ímã e ressuspenda as células no tampão de marcação pipetando vigorosamente.Retorne o tubo ao ímã por mais seis a oito minutos. Novamente, transfira cuidadosamente o SUP nain para o tubo da fração enriquecida. Aumente o rendimento de células T positivas para CD four repetindo o enriquecimento conforme necessário para preparar as células para marcação. Primeiro, centrifugue a fração enriquecida a 450 vezes G por sete minutos e descarte o sobrenadante.Em seguida, ressuspenda as células no tampão de marcação até uma concentração de 10 vezes 10 à sexta células por mililitro. Aliquote cinco vezes 10 à quinta células em tubos microfuge individuais para as células controle não coradas, coradas com isótopo e coradas com um único corante. Em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro de anticorpos CD4 FE e um micrograma por mililitro de anticorpos CD45RB PE ao tubo contendo a suspensão original de células.Adicione as colorações de controle isotópico e as colorações simples nas mesmas concentrações às alíquotas celulares apropriadas. Misture suavemente as células com os anticorpos e, em seguida, incube os tubos no gelo por 30 minutos. Cubra os tubos para protegê-los da luz.Em seguida, lave as células duas vezes em tampão de marcação conforme indicado no protocolo descrito no texto e re-suspenda as células a 10 vezes 10 à sexta células por mililitro em tampão de marcação. Em seguida, passe a suspensão celular através de um filtro de 70 mícrons para um tubo fax. Coloque o tubo no gelo e cubra-o para evitar o desbotamento fotoquímico das colorações.Utilize as células controle não coradas e com marcação simples para calibrar a compensação no classificador de células. Exclua as células não viáveis utilizando o porteamento com base na dispersão anterior e lateral. Em seguida, defina o porteamento para células positivas para CD4 e positivas para CD4 RB com os controles corados com isótopo.Próximo passo, a população positiva para CD4 e, em seguida, separar as células em populações CD45 RB alta e CD45 RB baixa. Coletar as células em tubos contendo dois mililitros de meio completo e, então, analisar uma alíquota de aproximadamente 10 vezes 10 à terceira células de cada fração no classificador de células para avaliar a pureza da amostra. Preparar as células CD45 RB alta e CD45 RB baixa para injeção, lavando e ressuspendendo-as em PBS até a densidade celular apropriada conforme indicado no protocolo do texto. Em seguida, restringir firmemente o camundongo receptor e injetar 100 microlitros da suspensão celular por via intraperitoneal nos lados direito e esquerdo do abdômen.Monitore os camundongos receptores quanto aos parâmetros clínicos conforme indicado no protocolo textual a cada semana. A progressão da doença após a injeção geralmente é aparente na quinta semana. Sacrifique um camundongo em um ponto temporal predeterminado ou quando houver perda de 20% do seu peso corporal inicial e extraia o cólon.Em seguida, meça e registre o comprimento e o peso do cólon. Células T CD4 positivas CD45RB elevadas foram transferidas para camundongos receptores com knockouts de rag1 e NFIL3 RAG1 duplo knockout cinco semanas após a injeção. Os camundongos duplo knockout perderam 10% de seu peso corporal inicial, cólons de ambos os camundongos com knockout de rag1 e duplo knockout.Os camundongos receptores apresentavam espessamento e encurtamento em comparação com os cólons dos camundongos controle CD4 positivos para células T CD45RB alta transferidas para camundongos receptores knockout para rag1 e para o mutante rag1 knockout P110δ. A análise histológica realizada três semanas após a transferência indicou hiperplasia epitelial, infiltrados de células inflamatórias e abscessos criptais nos receptores knockout para rag1 com mutação delta, mas não nos camundongos knockout para rag1. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro a seis horas, se for executada corretamente.

induction-murine-intestinal-inflammation-adoptive-transfer-effector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de células de ratinho intestinais dendríticas (DC) e macrófagos. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada utilizando várias cores análise de fluxo citométrico enquanto enriquecimento grânulo magnético seguido por separação de células é usado para produzir populações altamente puros para estudos funcionais.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Este vídeo demonstra a indução da doença intestinal do enxerto contra o hospedeiro, GvHD, em um camundongo receptor letalmente irradiado usando células-tronco hematopoiéticas alogênicas e linfócitos T alorreativos esplênicos indutores de GvHD. Este protocolo ajuda a estabelecer um modelo de GvHD intestinal aguda grave para entender o mecanismo da doença e desenvolver opções terapêuticas inovadoras.

Indução da doença do enxerto contra o hospedeiro em modelos de camundongos via transplante alogênico de medula óssea e células esplênicas

Nós proporcionar um método reprodutível para induzir diabetes do tipo 1 (DM1) em ratinhos dentro de duas semanas pela transferência adoptiva de células T primárias de ilhéus, CD4 + específicas para o antigénio.

Accelerated Diabetes Tipo 1 Indução em Ratos por transferência adotiva de diabetogênicos TCD4 +

Neste modelo de colite dirigida por antígeno, as células T OT-II CD4+ que expressam uma proteína fluorescente vermelha foram transferidas adotivamente para camundongos RAG-/- que expressam uma proteína fluorescente verde em fagócitos mononucleares (MPs). Os hospedeiros foram desafiados com Escherichia coli (E.coli) expressando a proteína ovalbumina (OVA) fundida a uma proteína fluorescente ciano (CFP).

Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

Descrevemos aqui um modelo de camundongo repórter transgênico para visualizar as células produtoras de IL-22 dentro de diferentes tecidos de camundongos. Este método pode ser usado para rastrear a localização de outras citocinas ou proteínas secretas no camundongo.

Visualização de IL-expressando-22 Linfócitos Usando ratos repórter

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para o isolamento de linfócitos de sites indutivos incluindo o tecido linfoide associado intestino de Peyer e os drenagem linfonodos mesentéricos e os sites de efetor incluindo a propria do lamina e o epitélio intestinal do sistema imunitário intestinal pequeno.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

Aqui, apresentamos um protocolo que descreve o transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico e permite repetitivas avaliações miniendoscópica do cólon distal in situ para a presença, as características e gravidade da inflamação do cólon dentro ao vivo ratos sofrem intestinal enxerto versus doença-- host.

Indução de Intestinal enxerto versus doença-- host e sua avaliação endoscópica-Mini em ratos ao vivo

Neste protocolo, é descrito um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal. As células T CD4+ são isoladas de camundongos transgênicos CBir1 TCR. Estes são específicos para um antígeno de microbiota intestinal imunodominante CBir1 flagellin, que é transferido para camundongos Rag1-/- receptores, levando à inflamação intestinal.

Indução da Inflamação Intestinal por Transferência Adotiva de Células CD4+ T Transgênicas CBir1 T para camundongos imunodeficientes

A interação da suscetibilidade genética, imunidade mucosa e ambiente microecológico intestinal está envolvida na patogênese da doença inflamatória intestinal (DII). Neste estudo, aplicamos o transplante de microbiota fecal em camundongos deficientes de IL-10 e investigamos seu impacto na inflamação cólon e na função cardíaca.

Avaliação Terapêutica do Transplante de Microbiota Fecal em um Modelo de Camundongo deficiente interleucina

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

Aqui, relatamos um protocolo que estabelece um modelo de camundongo com artrite reumatóide (AR) por meio da transferência adotiva de células T CD4+ de camundongos SKG, fornecendo uma ferramenta experimental rápida e confiável para investigar os mecanismos imunológicos, progressão patológica e desenvolvimento de novos tratamentos para AR.

Um modelo de transferência adotiva de artrite reumatóide em camundongos

Aprenda a induzir colite em camundongos imunodeficientes por transferência adotiva de células T CD4+ CD45RBhigh. Este modelo reproduz características da doença inflamatória intestinal humana para estudo de patogênese e terapias.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4 + CD45RB Alta Células T em imunodeficientes Mice (Vídeo) | JoVE Journal

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4

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