Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4 ⁺ CD45RB ^Alta Células T em imunodeficientes Mice

O objetivo geral deste procedimento é induzir a inflamação intestinal pela transferência adotiva de células T virgens para camundongos imunodeficientes. Isso é feito primeiro isolando as células do baço de camundongos, lisando as células sanguíneas e, em seguida, enriquecendo a população de células T CD quatro positivas. O segundo passo é marcar essas células com anticorpos CD quatro conjugados com DI fluorescente e CD 45 RB.

Em seguida, as células marcadas são classificadas usando fatos em populações CD 45, RB baixo e CD 45 RB alto. A etapa final é transferir as células altas do CD 45 RB para camundongos imunodeficientes por injeção intraperitoneal. Em última análise, as células transferidas são ativadas e causam danos teciduais locais na ausência de células T reguladoras, resultando em colite experimental.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo de doenças inflamatórias intestinais, como o papel de populações de células específicas e a microbiota gastrointestinal na patogênese da doença. Após a eutanásia do camundongo doador, borrife o abdômen com etanol a 70% para esterilizar a área. Em seguida, faça uma incisão horizontal no abdômen e retire a pele para expor o peritônio usando uma pinça.

Mantenha o peritônio longe dos órgãos internos e faça uma incisão no peritônio abdominal esquerdo. Em seguida, retire o baço do camundongo e coloque-o em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de meio completo gelado. Esmague o baço com duas lâminas de vidro estéreis para fazer uma suspensão de célula única.

Filtre as células através de um filtro de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros e, em seguida, enxágue o filtro com cinco mililitros de tensão média completa até cinco baços em um tubo cônico. Em seguida, centrifugue as células a 450 vezes G por sete minutos a quatro graus Celsius. Aspire o sobrenadante em um recipiente de resíduos e, em seguida, ressuspenda suavemente as células em 10 mililitros de tampão de rotulagem gelado.

Combine 20 microlitros da suspensão celular com 180 microlitros de solução azul 0,4% trian e incube as células por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 10 microlitros da suspensão celular a um hemocitômetro e conte o número de células não azuis sob o microscópio para iniciar o pellet de enriquecimento e reuse suavemente suspender as células em tampão de rotulagem gelado a uma concentração de 20 vezes 10 elevado a seis células por mililitro. Adicione cinco microlitros de anticorpo de enriquecimento de células T CD quatro biotiniladas por um vezes 10 às seis células e, em seguida, incube as células no gelo com o anticorpo por 15 minutos.

Adicione 10 vezes o volume de tampão de marcação à suspensão celular e, em seguida, centrifugue as células a 450 vezes G por sete minutos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular. Em seguida, ressuspenda as partículas magnéticas conjugadas com estreptavidina por vórtice e adicione cinco microlitros de partículas por um vezes 10 às seis células das células.

Misture as partículas com as células sacudindo suavemente o tubo e, em seguida, incube a mistura a seis a 12 graus Celsius por 30 minutos. Ressuspenda as células a uma concentração de 20 a 80 vezes 10 elevado a seis células por mililitro com tampão de marcação. Em seguida, transfira um mililitro de células marcadas para um tubo de ensaio de fundo redondo de 12 milímetros por 75 milímetros e coloque esse tubo de fração positiva em um ímã por seis a oito minutos.

Com o tubo no ímã, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de paster de vidro sem perturbar as células marcadas e transfira-o para um novo tubo cônico estéril de 50 mililitros. Esta fração contém o CD quatro células T positivas. Remova o tubo de fração positiva do ímã e ressuspenda as células no tampão de marcação pipetando vigorosamente.

Retorne o tubo ao ímã por mais seis a oito minutos. Novamente, transfira cuidadosamente o SUP nain para o tubo de fração enriquecida. Aumentar o rendimento de quatro células T positivas para CD repetindo o enriquecimento conforme necessário para preparar as células para a marcação: primeiro centrifugar a fração enriquecida a 450 vezes G durante sete minutos e rejeitar o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda as células no tampão de marcação a uma concentração de 10 vezes 10 elevado à sexta célula por mililitro. Alíquota cinco vezes 10 das quintas células em tubos de microfuga individuais para células de controle não coradas com isótopos e coradas simples. Em seguida, adicione cinco microgramas por mililitro de CD quatro, FE e um micrograma por mililitro de anticorpos CD 45 RB PE ao tubo que contém a suspensão celular original.

Adicionar as colorações de controlo isotópico e as rubricas isoladas na mesma concentração às alíquotas celulares adequadas. Misture delicadamente as células com os anticorpos e, em seguida, incube os tubos no gelo por 30 minutos. Cubra os tubos para protegê-los da luz.

Em seguida, lave as células duas vezes no tampão de rotulagem, conforme indicado no protocolo de texto, e ressuspenda as células em 10 vezes 10 das seis células por mililitro no tampão de rotulagem. Em seguida, passe a suspensão celular por um filtro de 70 mícrons em um tubo de fax. Coloque o tubo no gelo e cubra-o Para evitar o branqueamento fotográfico das manchas.

Use as células de controle não coradas e de estágio único para calibrar a compensação no classificador de células. Exclua as células não viáveis usando canais espalhados para frente e para os lados. E, em seguida, defina o gating para células CD quatro positivas e CD quatro RB positivas com os controles corados com isótopos.

Em seguida, a população positiva de CD quatro e, em seguida, classifique as células em populações de CD 45, RB alto e CD 45 RB baixo. Coletar as células em tubos contendo dois mililitros de meio completo e, em seguida, executar uma alíquota de aproximadamente 10 vezes 10 para as terceiras células de cada fração no classificador de células para avaliar a pureza da amostra para preparar as células CD 45 RB alto e CD 45 RB baixo para lavagem por injeção e ressuspendê-las em PBS até a densidade celular apropriada, conforme indicado no protocolo de texto. Em seguida, prenda firmemente o camundongo receptor e injete 100 microlitros da suspensão celular intraperitoneal nos lados direito e esquerdo do abdômen.

Monitore os camundongos receptores quanto aos parâmetros clínicos, conforme indicado no protocolo de texto, todas as semanas. A progressão da doença pós-injeção é tipicamente aparente na quinta semana. Sacrifique um camundongo em um ponto de tempo predeterminado ou quando ele perder 20% de seu peso corporal inicial e extraia o cólon.

Em seguida, meça e registre o comprimento e o peso do cólon. CD quatro células T altas CD 45 RB positivas foram transferidas para camundongos receptores de rag one knockout e NFIL três RAG one double knockout cinco semanas após a injeção. Nocaute duplo Os camundongos perderam 10% de seu peso corporal inicial, cólons de nocaute um e nocaute duplo.

Os camundongos receptores foram engrossados e encurtados em comparação com os cólons dos camundongos controle CD quatro células T altas CD 45 RB positivas para uma transferência para rag um knockout e rag one knockout P um 10 camundongos receptores mutantes delta análise histológica três semanas após a transferência indicou hiperplasia epitelial, infiltrados de células inflamatórias e abscessos de cripta em receptores mutantes delta knockout rag one, mas não camundongos knockout rag one Uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita em quatro a seis horas se for realizada corretamente.