Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T
18 de setembro de 2016
Neste modelo de colite dirigida por antígeno, as células T OT-II CD4+ que expressam uma proteína fluorescente vermelha foram transferidas adotivamente para camundongos RAG-/- que expressam uma proteína fluorescente verde em fagócitos mononucleares (MPs). Os hospedeiros foram desafiados com Escherichia coli (E.coli) expressando a proteína ovalbumina (OVA) fundida a uma proteína fluorescente ciano (CFP).
O objetivo geral deste modelo de colite induzida por antígeno é determinar se fagócitos mononucleares positivos para CX3CR1 interagem com e ativam linfócitos T CD4 positivos durante a colite específica para antígeno e se essa expansão de linfócitos T efetores dependente de fagócitos mononucleares ocorre na lâmina própria intestinal. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área das doenças inflamatórias intestinais, como quais tipos de interação ocorrem entre células apresentadoras de antígenos e linfócitos T efetores na lâmina própria do cólon. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo da interação entre células imunes e dos elementos que levam à patogenicidade da doença inflamatória intestinal.
Este método utiliza o modelo de colite por transferência de células T, no qual linfócitos T CD4 naïve específicos por antígeno, marcados com fluorescência vermelha, são transferidos para um hospedeiro imunodeficiente que expressa a proteína verde fluorescente em células mononucleares. Após a transferência celular, realiza-se a gavagem oral com bactérias que expressam antígeno marcado com fluorescência azul. Os eventos imunológicos que ocorrem na lâmina própria intestinal dos hospedeiros podem ser monitorados em diversas fases do desenvolvimento da doença.
Use uma tesoura de dissecação para abrir o cólon longitudinalmente e lave o tecido em uma placa de Petri contendo 25 mililitros de PBS para remover qualquer detrito e muco. Corte o cólon em pedaços de cinco a oito milímetros e coloque os fragmentos resultantes em 20 mililitros de DPBS fresco sem cálcio e magnésio, suplementado com 10 milimolares de HEPES e 5 milimolares de EDTA. Vortexe o tubo com a amostra por 30 segundos na velocidade máxima.
Em seguida, incubar a 37 graus Celsius por dez minutos com agitação suave para remover o epitélio. Ao final da incubação, vortexar novamente por 30 segundos. Depois disso, descartar o sobrenadante contendo as células epiteliais.
Transfira os fragmentos de tecido para um novo tubo contendo 20 mililitros de tampão PBS, HEPES e EDTA fresco, e repita a incubação com os passos de vortexação antes e depois. Após a terceira repetição, todas as células epiteliais são removidas e o sobrenadante fica claro. Lave suavemente os fragmentos de tecido em PBS para remover quaisquer células epiteliais residuais.
Corte os fragmentos de tecido em pedaços de dois por dois milímetros e transfira-os para digestão em dez mililitros de meio RPI, suplementado com 0,5 miligramas por mililitro de colagenase tipo oito e dez unidades por mililitro de DNAse um. Vortexe as amostras por 30 segundos. Em seguida, incube os fragmentos de tecido a 37 graus Celsius com agitação por 30 a 35 minutos, vortexando o tubo a cada cinco minutos durante a incubação.
Quando o tecido estiver digerido, filtre a suspensão resultante através de um filtro celular de 70 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros. Lave o filtro celular uma vez e centrifugue a suspensão de células isoladas. Por fim, lave as células uma vez com PBS e centrifugue.
Em seguida, determine o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano. A proteína ovalbumina com proteína fluorescente ciano produzida por e. coli ativa a produção de interferon gama em células OT-II in vitro, em contraste com e.
coli que expressam apenas CFP. A imagem confocal tridimensional ex vivo do tecido colônico de camundongos transgênicos que expressam proteína verde fluorescente, alimentados com ovos de E. coli PCFP, demonstra a presença de bactérias que expressam a proteína fluorescente dentro das criptas colônicas próximas às células epiteliais intestinais e co-localizadas com os fagócitos intestinais do hospedeiro.
Em animais OT-II vermelhos, os linfócitos T positivos para CD4 são caracterizados pela sua coexpressão da proteína fluorescente vermelha e do V beta cinco ponto um. Quando desafiados com E. coli PCFP ova, camundongos transgênicos deficientes em linfócitos BNT e que expressam proteína fluorescente verde, os quais foram transplantados adotivamente com linfócitos T positivos para CD4 OT-II vermelhos e positivos para ligante CD62, perdem rapidamente peso corporal e desenvolvem sinais clínicos de colite.
Sete dias após a transferência das células, apenas alguns fagócitos do hospedeiro ingeriram ovas de e. coli PCFP e células OT-II vermelhas positivas não são detectadas. Quatorze dias após a transferência das células, fagócitos do hospedeiro que ingeriram o e.
Os ovos de PCFP de e. coli estão localizados em estreita proximidade com as células OT-II vermelho positivas transferidas adotivamente. Vinte e um dias após a transferência celular, um grande número de células hospedeiras já amostrou os ovos de PCFP de e. coli e as células doadoras OT-II vermelho positivas, que são encontradas dispersas por toda a lâmina própria do cólon, estão em contato próximo com os fagócitos intestinais do hospedeiro.
Quando dominada, esta técnica pode ser concluída em quatro horas, se realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como a coloração dos linfócitos intestinais e a análise de citocinas no soro, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre o estado de ativação dos linfócitos T CD4 e para confirmar a gravidade da colite. Após cada avanço, esta técnica abre caminho para pesquisas na área de imunologia, permitindo explorar os pequenos eventos que levam à doença inflamatória intestinal no modelo murino.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células imunes da lâmina própria colônica para análise ex vivo subsequente.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo utiliza um modelo de colite induzida por antígeno para investigar as interações entre fagócitos mononucleares positivos para CX3CR1 e células T positivas para CD4. O modelo permite o monitoramento de eventos imunológicos na lâmina própria intestinal durante o desenvolvimento da doença.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Doença inflamatória intestinal
- Interações celulares
Antecedentes
- Compreender o papel dos fagócitos mononucleares na ativação de linfócitos T.
- Explorar as interações entre células imunes na lâmina própria colônica.
- Investigar os mecanismos patogênicos na doença inflamatória intestinal.
- Utilizar proteínas fluorescentes para rastrear respostas imunes.
Objetivo do Estudo
- Determinar a interação entre fagócitos mononucleares e células T CD4.
- Avaliar a expansão de células T efetoras na lâmina própria intestinal.
- Fornecer informações sobre os mecanismos da doença inflamatória intestinal.
Métodos Utilizados
- Transferência adotiva de linfócitos T CD4+ OT-II para camundongos RAG -/-.
- Uso de proteínas fluorescentes para marcar células imunes.
- Gavagem oral com E.coli expressando ovalbumina fundida à CFP.
- Monitoramento de eventos imunes em diversos estágios da doença.
Resultados Principais
- Identificação de interações entre fagócitos mononucleares e células T.
- Evidência de expansão de células T efetoras na lâmina própria intestinal.
- Informações sobre a patogenicidade da doença inflamatória intestinal.
- Demonstração da utilidade do modelo de colite por transferência de células T.
Conclusões
- O estudo destaca interações críticas na resposta imune durante a colite.
- Os achados contribuem para a compreensão dos mecanismos da doença inflamatória intestinal.
- O modelo fornece uma estrutura para pesquisas futuras em imunologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de colite induzida por antígeno permite a investigação mecanicista das interações entre células apresentadoras de antígenos e células T em um contexto imunológico definido, apoiando a validação de alvos na pesquisa de doenças inflamatórias intestinais. Ao fornecer um sistema reprodutível para estudar a comunicação entre células imunes patogênicas na lâmina própria, ele aumenta a confiança preditiva na desconsideração pré-clínica de candidatos imunomoduladores. O modelo está alinhado com fluxos de trabalho de descoberta precoce focados no esclarecimento de vias e no engajamento do alvo biológico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relativas à ativação de linfócitos T específicos por fagócitos mononucleares.
- Valor Operacional: Fornece um sistema definido, impulsionado por antígeno, para esclarecer as vias biológicas envolvidas na patogênese da colite.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao isolar eventos de expansão de linfócitos T efetores no tecido intestinal.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera sistemas biológicos validados com células imunes marcadas fluorescentemente para análise ex vivo subsequente.
- Resultados Quantitativos: Permite a medição de interações entre células imunes e produção de citocinas em resposta à exposição definida a antígenos.
- Reprodutibilidade: O isolamento padronizado de células e o processamento de tecidos apoiam o monitoramento consistente de eventos imunes em réplicas experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela inflamação intestinal induzida por antígeno para estudar mecanismos relevantes a subgrupos de doenças inflamatórias intestinais.
- Continuidade Translacional: Conecta dados imunológicos da fase de descoberta com a validação pré-clínica de candidatos terapêuticos.
- Decisões com Ajuste de Risco: Facilita a avaliação do engajamento do alvo e dos efeitos mecanicistas antes da otimização do fármaco líder.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método auxilia a biologia de descoberta precoce ao permitir a verificação de hipóteses sobre as funções de células apresentadoras de antígenos na ativação de linfócitos T, posicionando-se antes das fases de identificação de compostos líderes. Ele gera dados quantitativos sobre eventos imunológicos, úteis para comparação orientada por análises de condições experimentais em triagens imunológicas. O sistema foi projetado como uma plataforma reutilizável para o estudo de vias mediadas pelo sistema imunológico em múltiplas campanhas de validação de alvos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias de respostas imunes específicas a antígenos no intestino.
- Triagem: Oferece protocolos reprodutíveis de isolamento e estimulação de células imunes para avaliação de compostos ou moduladores.
- Análises: Fornece leituras mensuráveis, como a produção de interferon gama e a localização de células imunes, para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta insights mecanicistas à continuidade pré-clínica por meio de modelos de doenças definidos e impulsionados por antígenos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece um fluxo de trabalho padronizado para o estudo de interações entre APCs e células T, aplicável a múltiplos alvos em imunologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas interações entre células imunes.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos de desafio antigênico e transferência de células.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao permitir a avaliação precoce de efeitos biológicos mediados pelo alvo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos imunomoduladores com base em dados de eventos imunes na lâmina própria.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em imunologia, citometria de fluxo e microscopia fluorescente para o isolamento e análise de células imunes.
- Depende do acesso a modelos de camundongos transgênicos, bactérias que expressam proteínas fluorescentes e equipamentos para processamento de tecido intestinal.
- Necessita padronização entre equipes quanto ao momento da transferência celular, dosagem de antígeno e cronograma de coleta de tecidos.
- As considerações para adaptação incluem a compatibilidade do sistema modelo com diferentes receptores de células T específicos para antígenos e marcadores de fagócitos.
- As limitações práticas incluem a complexidade técnica do isolamento de células da lâmina própria e a necessidade de monitoramento contínuo por vários dias do desenvolvimento da doença.
