Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T

O objetivo geral deste modelo de colite conduzida por antígeno é determinar se os fagócitos mononucleares CX3, CR1 positivos interagem e ativam as células T CD4 positivas durante a colite antígeno-específica e se essa expansão de células T efetoras dependentes de fagócitos mononucleares ocorre dentro da lâmina própria intestinal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da doença inflamatória intestinal, como quais tipos de interação ocorrem entre as células apresentadoras de antígenos e as células T efetoras na lâmina própria do cólon. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o estudo da interação das células imunes e dos elementos que levam à patogenicidade da doença inflamatória intestinal.

Este método utiliza o modelo de colite de transferência de células T, no qual as células T CD4 virgens fluorescentes vermelhas específicas do antígeno são transferidas para o hospedeiro imunodeficiente, expressando a proteína fluorescente verde em células mononucleares. A transferência celular é seguida pela sonda oral da bactéria fluorescente azul que expressa o antígeno. Os eventos imunológicos que ocorrem na lâmina própria intestinal dos hospedeiros podem ser monitorados em vários estágios do desenvolvimento da doença.

Use uma tesoura de dissecção para abrir o cólon longitudinalmente e lave o tecido em uma placa de Petri contendo 25 mililitros de PBS para remover quaisquer detritos e muco. Corte o cólon em pedaços de cinco a oito milímetros e coloque os fragmentos resultantes em 20 mililitros de DPBS fresco sem cálcio e magnésio, suplementado com dez HEPES milimolares e cinco EDTA milimolar. Vortex o tubo com a amostra por 30 segundos na velocidade máxima.

Em seguida, incube a 37 graus Celsius por dez minutos com agitação suave para remover o epitélio. No final da incubação, Vortex novamente por 30 segundos. Em seguida, descarte o sobrenadante que contém as células epiteliais.

Transfira os pedaços de tecido para um novo tubo contendo 20 mililitros de tampão PBS, HEPES e EDTA fresco e repita a incubação com as etapas de vórtice antes e depois. Após a terceira repetição, todas as células epiteliais são removidas e o sobrenadante está limpo. Lave os fragmentos de tecido suavemente em PBS para remover quaisquer células epiteliais residuais.

Corte os fragmentos de tecido em pedaços de dois por dois milímetros e transfira os pedaços para digestão em dez milímetros de meio RPI, suplementado com 0,5 miligramas por mililitro de colagenase tipo oito e dez unidades por mililitro de DNAse um. Vortex as amostras por 30 segundos. Em seguida, incube os pedaços de tecido a 37 graus Celsius com agitação por 30 a 35 minutos e vortex o tubo a cada cinco minutos durante a incubação.

Quando o tecido for digerido, coe a pasta resultante através de um filtro de células de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Lave o filtro de células uma vez e gire a suspensão de célula única por centrifugação. Finalmente, lave as células uma vez em PBS e centrifugue.

Em seguida, determine o número de células viáveis pela exclusão do azul de tripano. Proteína fluorescente ciano A proteína ovalbumina produtora de E. coli ativa a produção de interferon gama em células OT-II in vitro em contraste com e.

coli que expressam apenas CFP. Imagens confocais 3D ex vivo do tecido colônico de camundongos transgênicos que expressam proteína fluorescente verde, alimentados com ovos de E. coli PCFP demonstram a presença da bactéria que expressa proteína fluorescente dentro das criptas colônicas perto das células epiteliais intestinais e co-localizadas com os fagócitos intestinais do hospedeiro.

Em animais vermelhos OT-II, as células T CD4 positivas são caracterizadas por sua co-expressão de proteína fluorescente vermelha e V beta cinco vírgula um. Quando desafiados com óvulos de PCFP de E. coli, camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente verde com deficiência de linfócitos BNT que foram transplantados adotivamente com células T positivas para ligante CD4 CD62 vermelho OT-II perdem rapidamente o peso corporal e desenvolvem sinais clínicos de colite.

Sete dias após a transferência celular, apenas alguns fagócitos hospedeiros coletaram amostras de ovos PCFP de E. coli e os glóbulos vermelhos positivos OT-II não são detectados. 14 dias após a transferência celular, os fagócitos hospedeiros que amostraram o e.

coli Os óvulos PCFP estão localizados nas proximidades das células vermelhas positivas OT-II transferidas adotivamente. Aos 21 dias após a transferência celular, um grande número de células hospedeiras amostraram os óvulos de E. coli PCFP e os glóbulos vermelhos positivos do doador OT-II, que se encontram dispersos por toda a lâmina própria do cólon, estão em contato próximo com os fagócitos intestinais do hospedeiro.

Quando dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como coloração dos linfócitos intestinais e análise de citocinas séricas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre o estado de ativação das células T CD4 e confirmar a gravidade da colite. Após cada desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisas no campo da imunologia para explorar os pequenos eventos que levam à doença inflamatória intestinal no modelo de camundongo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células imunes da lâmina própria do cólon para a análise ex vivo a jusante.