Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados

Este manuscrito descreve um protocolo para crescer em redes modulares vitro que consistem em espacialmente confinados, circuitos neuronais funcionalmente inter-relacionados. Uma máscara polimérico é utilizado para uma camada de padrão de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. Neurônios Banhado crescer em áreas revestidas estabelecendo conexões espontâneas e exibem atividade eletrofisiológica.

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver redes modulares in vitro que consistem em circuitos neuronais interconectados, funcionais e espacialmente confinados. Isso é feito preparando primeiro os estênceis PDMS para padronizar uma camada de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. O segundo passo é limpar os substratos de cultura.

Especificamente as superfícies de placas de Petri, lamínulas e matrizes de vários eletrodos. Em seguida, os estênceis PDMS são depositados no substrato de cultura e os padrões de camada de proteína adesiva desejados são criados. A etapa final é o revestimento das células gliais neuronais.

Em última análise, gravações de múltiplos eletrodos e imagens de cálcio são usadas para mostrar a dinâmica das redes neuronais modulares alcançadas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em aberto no campo da neurociência, como investigar a dinâmica da comunicação entre conjuntos neuronais, e isso contrariará as condições experimentais. O polimetil soano ou PDMS é feito misturando primeiro uma parte do agente de cura com 10 partes do agente base.

Após cinco minutos de mistura, mova a mistura para uma câmara de vácuo por 15 minutos. Após 15 minutos, verifique se há bolhas e retorne a solução à câmara por mais 15 minutos. Em seguida, prepare um wafer no codificador de rotação.

Abra os botões de gás para gás nitrogênio. Coloque uma bolacha no spinner e prenda-o no lugar com o aspirador. Em seguida, despeje uma fina camada de PDMS sobre o wafer.

Gire o wafer com PDMS por um minuto a 1000 RPM para fazer um revestimento PDMS de 100 mícrons de espessura no wafer. Em seguida, transfira o wafer para uma placa quente a 100 graus Celsius. Deixe assar por 30 minutos.

Depois que o PDMS endurecer, use uma pipeta para contornar as bordas dos estênceis com mais PDMS. Em seguida, asse o PDMS adicionado no wafer. Como antes, quando as bordas do PDMS endurecerem, corte o estêncil ao longo das bordas com o estêncil de silicone do wafer para iniciar os RINs.

Lamínulas de vidro quadradas de 23 milímetros com água destilada, seguida de etanol a 70%, acetona, isopropanol e, finalmente, água destilada. Novamente, seque os quadrados sob uma corrente de gás nitrogênio. Em seguida, pressione suavemente um estêncil PDMS padrão em cada lamínula.

Coloque as lamínulas com os estênceis em uma câmara de vácuo por 15 minutos. Depois de aspirado, coloque um mililitro de PDL nos estênceis e retorne os conjuntos à câmara de vácuo por 20 minutos. Repita o ciclo de vácuo de 20 minutos uma vez e, em seguida, deixe o PDL secar durante a noite no dia seguinte.

Prepare as placas de Petri que darão suporte às células de rede. Primeiro. Cubra pratos de 3,5 centímetros com um mililitro de PDL por duas horas. Posteriormente, à temperatura ambiente, remova o PDL do prato por aspiração.

Em seguida, lave a louça com água destilada e deixe secar. Depois que um prato estiver seco, adicione um pequeno volume de graxa de silicone ao prato de acordo com os quatro cantos da lamínula. Coloque as lamínulas no prato com o PDMS voltado para cima e pressione-as suavemente para baixo para garantir que estejam presas.

Agora pinça suavemente A-P-D-M-S das lamínulas deixando o padrão PDL. Por fim, esterilize a louça expondo-a aos raios UV por sete minutos. Primeiro, limpe o conjunto de eletrodos múltiplos lavando-o em água da torneira e, em seguida, sonicando-o em um detergente enzimático concentrado.

Repita essas etapas três vezes. Em seguida, sonice o MEA em água destilada pura três vezes e, em seguida, sob um capuz. Lave o MEA com água destilada antes.

Esterilizando com luz ultravioleta por 30 minutos. Em seguida, prepare a rede de suporte primeiro. Despeje o PDMS em uma placa de 12 ou 24 poços.

Assim que o PDMS endurecer, remova-o com uma agulha. Agora faça furos no centro dos discos para fazer anéis, que funcionam como suporte do molde. Agora coloque um suporte de molde no centro do MEA e cubra a superfície externa exposta do MEA.

Deixe isso descansar por duas horas no quarto. Em seguida, aspire a lavagem PDL, a superfície externa exposta do MEA com água destilada e remova o suporte do molde para que o MEA possa secar. Agora prenda um estêncil a um micromanipulador preparado sob um microscópio invertido.

Inspecione e alinhe a estrutura padronizada para corresponder aos eletrodos do MEA. Em seguida, use o micro manipulador para abaixar o estêncil até a superfície MEA. Uma vez conectado, levante o manipulador microm e, se necessário, use uma pinça para aplicar uma pequena quantidade de pressão para evitar que o PDMS se solte.

Agora transfira o MEA para a câmara de vácuo por 15 minutos. Em seguida, aplique uma gota de um mililitro de PDL no estêncil e retorne à câmara de vácuo por dois ciclos de 20 minutos. Deixe o PDL secar durante a noite no dia seguinte.

Remova os estênceis P DM S das medidas usando uma pinça. Por fim, esterilize os meas por UV por sete minutos. Eles estão então prontos para as células em preparação, células de cultura e suspensões preparadas como no protocolo de texto.

Depois de suspender o número necessário de células, coloque-as no centro da área padronizada no MEA ou na lamínula. Um MEA deve ser carregado com volumes de 100 microlitros e uma lamínula. Acomoda 1000 microlitros.

Incube as células da placa por 40 minutos e, em seguida, adicione meio de revestimento para manter as células a cada quatro dias. Adicione de volta o meio de crescimento suplementado fresco. Após o sexto ou sétimo dia, as conexões neuronais entre os módulos devem começar a se formar nesse ponto.

Dilua o meio de cultura com um agente antimitótico para evitar o crescimento excessivo da glia. Após quatro dias in vitro, é possível observar que os neurônios ligados dentro do PD DL codificaram pontos de 600 mícrons quadrados após 14 dias. Em cultura, os neurônios estabeleceram espontaneamente a conexão dentro dos módulos e entre os módulos formando redes funcionais ativas.

Circuitos neuronais de 300 mícrons quadrados foram observados por terem o tamanho da característica PDMS, mantendo a mesma concentração de plaqueamento. A imagem de cálcio foi realizada usando um objetivo Forex para ampla atividade nas redes cultivadas. Entre os módulos verde e rosa, um número maior de conexões é visto, enquanto os módulos azul e vermelho estão menos conectados aos outros módulos.

Um gráfico de lista dos inícios de eventos de cálcio é mostrado para um filme adquirido a 30 hertz com uma imagem de 1 milhão de pixels. Os módulos verde e rosa foram altamente sincronizados, enquanto os módulos azul e vermelho foram menos. Assim.Uma rede modular cortical composta por três circuitos distintos foi registrada aos 21 dias in vitro.

Usando um MEA, descobriu-se que os circuitos neuronais separados por cerca de 600 mícrons estavam interconectados. Sua atividade eletrofisiológica foi reconstruída. Usando um algoritmo preciso de detecção de pico de tempo, um gráfico de lista de cinco minutos desses dados foi feito com dados de cluster codificados por cores.

Isso fornece uma comparação de atividades de rede inteira e cluster único e fornece informações sobre a sincronia intracluster. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar estênceis PDM e usá-los para padronizar a adesão de células neurogliais levando ao estabelecimento de uma rede modal funcional.