Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados
15 de abril de 2015
Este manuscrito descreve um protocolo para crescer em redes modulares vitro que consistem em espacialmente confinados, circuitos neuronais funcionalmente inter-relacionados. Uma máscara polimérico é utilizado para uma camada de padrão de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. Neurônios Banhado crescer em áreas revestidas estabelecendo conexões espontâneas e exibem atividade eletrofisiológica.
O objetivo geral deste procedimento é desenvolver redes modulares in vitro que consistem em circuitos neuronais interconectados, funcionais e espacialmente confinados. Isso é feito preparando primeiro os estênceis PDMS para padronizar uma camada de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. O segundo passo é limpar os substratos de cultura.
Especificamente as superfícies de placas de Petri, lamínulas e matrizes de vários eletrodos. Em seguida, os estênceis PDMS são depositados no substrato de cultura e os padrões de camada de proteína adesiva desejados são criados. A etapa final é o revestimento das células gliais neuronais.
Em última análise, gravações de múltiplos eletrodos e imagens de cálcio são usadas para mostrar a dinâmica das redes neuronais modulares alcançadas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em aberto no campo da neurociência, como investigar a dinâmica da comunicação entre conjuntos neuronais, e isso contrariará as condições experimentais. O polimetil soano ou PDMS é feito misturando primeiro uma parte do agente de cura com 10 partes do agente base.
Após cinco minutos de mistura, mova a mistura para uma câmara de vácuo por 15 minutos. Após 15 minutos, verifique se há bolhas e retorne a solução à câmara por mais 15 minutos. Em seguida, prepare um wafer no codificador de rotação.
Abra os botões de gás para gás nitrogênio. Coloque uma bolacha no spinner e prenda-o no lugar com o aspirador. Em seguida, despeje uma fina camada de PDMS sobre o wafer.
Gire o wafer com PDMS por um minuto a 1000 RPM para fazer um revestimento PDMS de 100 mícrons de espessura no wafer. Em seguida, transfira o wafer para uma placa quente a 100 graus Celsius. Deixe assar por 30 minutos.
Depois que o PDMS endurecer, use uma pipeta para contornar as bordas dos estênceis com mais PDMS. Em seguida, asse o PDMS adicionado no wafer. Como antes, quando as bordas do PDMS endurecerem, corte o estêncil ao longo das bordas com o estêncil de silicone do wafer para iniciar os RINs.
Lamínulas de vidro quadradas de 23 milímetros com água destilada, seguida de etanol a 70%, acetona, isopropanol e, finalmente, água destilada. Novamente, seque os quadrados sob uma corrente de gás nitrogênio. Em seguida, pressione suavemente um estêncil PDMS padrão em cada lamínula.
Coloque as lamínulas com os estênceis em uma câmara de vácuo por 15 minutos. Depois de aspirado, coloque um mililitro de PDL nos estênceis e retorne os conjuntos à câmara de vácuo por 20 minutos. Repita o ciclo de vácuo de 20 minutos uma vez e, em seguida, deixe o PDL secar durante a noite no dia seguinte.
Prepare as placas de Petri que darão suporte às células de rede. Primeiro. Cubra pratos de 3,5 centímetros com um mililitro de PDL por duas horas. Posteriormente, à temperatura ambiente, remova o PDL do prato por aspiração.
Em seguida, lave a louça com água destilada e deixe secar. Depois que um prato estiver seco, adicione um pequeno volume de graxa de silicone ao prato de acordo com os quatro cantos da lamínula. Coloque as lamínulas no prato com o PDMS voltado para cima e pressione-as suavemente para baixo para garantir que estejam presas.
Agora pinça suavemente A-P-D-M-S das lamínulas deixando o padrão PDL. Por fim, esterilize a louça expondo-a aos raios UV por sete minutos. Primeiro, limpe o conjunto de eletrodos múltiplos lavando-o em água da torneira e, em seguida, sonicando-o em um detergente enzimático concentrado.
Repita essas etapas três vezes. Em seguida, sonice o MEA em água destilada pura três vezes e, em seguida, sob um capuz. Lave o MEA com água destilada antes.
Esterilizando com luz ultravioleta por 30 minutos. Em seguida, prepare a rede de suporte primeiro. Despeje o PDMS em uma placa de 12 ou 24 poços.
Assim que o PDMS endurecer, remova-o com uma agulha. Agora faça furos no centro dos discos para fazer anéis, que funcionam como suporte do molde. Agora coloque um suporte de molde no centro do MEA e cubra a superfície externa exposta do MEA.
Deixe isso descansar por duas horas no quarto. Em seguida, aspire a lavagem PDL, a superfície externa exposta do MEA com água destilada e remova o suporte do molde para que o MEA possa secar. Agora prenda um estêncil a um micromanipulador preparado sob um microscópio invertido.
Inspecione e alinhe a estrutura padronizada para corresponder aos eletrodos do MEA. Em seguida, use o micro manipulador para abaixar o estêncil até a superfície MEA. Uma vez conectado, levante o manipulador microm e, se necessário, use uma pinça para aplicar uma pequena quantidade de pressão para evitar que o PDMS se solte.
Agora transfira o MEA para a câmara de vácuo por 15 minutos. Em seguida, aplique uma gota de um mililitro de PDL no estêncil e retorne à câmara de vácuo por dois ciclos de 20 minutos. Deixe o PDL secar durante a noite no dia seguinte.
Remova os estênceis P DM S das medidas usando uma pinça. Por fim, esterilize os meas por UV por sete minutos. Eles estão então prontos para as células em preparação, células de cultura e suspensões preparadas como no protocolo de texto.
Depois de suspender o número necessário de células, coloque-as no centro da área padronizada no MEA ou na lamínula. Um MEA deve ser carregado com volumes de 100 microlitros e uma lamínula. Acomoda 1000 microlitros.
Incube as células da placa por 40 minutos e, em seguida, adicione meio de revestimento para manter as células a cada quatro dias. Adicione de volta o meio de crescimento suplementado fresco. Após o sexto ou sétimo dia, as conexões neuronais entre os módulos devem começar a se formar nesse ponto.
Dilua o meio de cultura com um agente antimitótico para evitar o crescimento excessivo da glia. Após quatro dias in vitro, é possível observar que os neurônios ligados dentro do PD DL codificaram pontos de 600 mícrons quadrados após 14 dias. Em cultura, os neurônios estabeleceram espontaneamente a conexão dentro dos módulos e entre os módulos formando redes funcionais ativas.
Circuitos neuronais de 300 mícrons quadrados foram observados por terem o tamanho da característica PDMS, mantendo a mesma concentração de plaqueamento. A imagem de cálcio foi realizada usando um objetivo Forex para ampla atividade nas redes cultivadas. Entre os módulos verde e rosa, um número maior de conexões é visto, enquanto os módulos azul e vermelho estão menos conectados aos outros módulos.
Um gráfico de lista dos inícios de eventos de cálcio é mostrado para um filme adquirido a 30 hertz com uma imagem de 1 milhão de pixels. Os módulos verde e rosa foram altamente sincronizados, enquanto os módulos azul e vermelho foram menos. Assim.Uma rede modular cortical composta por três circuitos distintos foi registrada aos 21 dias in vitro.
Usando um MEA, descobriu-se que os circuitos neuronais separados por cerca de 600 mícrons estavam interconectados. Sua atividade eletrofisiológica foi reconstruída. Usando um algoritmo preciso de detecção de pico de tempo, um gráfico de lista de cinco minutos desses dados foi feito com dados de cluster codificados por cores.
Isso fornece uma comparação de atividades de rede inteira e cluster único e fornece informações sobre a sincronia intracluster. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar estênceis PDM e usá-los para padronizar a adesão de células neurogliais levando ao estabelecimento de uma rede modal funcional.
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Visão Geral
Este manuscrito descreve um protocolo para cultivar redes modulares in vitro, compostas por circuitos neuronais funcionalmente interconectados e espacialmente confinados. Isso é realizado preparando estênceis de PDMS para moldar uma camada de proteína que promove a adesão celular sobre o substrato de cultivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- Redes neuronais in vitro são essenciais para o estudo da conectividade neuronal.
- O confinamento espacial de circuitos neuronais pode aumentar a interconectividade funcional.
- A adesão celular é fundamental para o crescimento neuronal bem-sucedido.
- Estêncil de PDMS é comumente usado para padronização em cultivo celular.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para criar redes neuronais modulares in vitro.
- Investigar as propriedades eletrofisiológicas dessas redes.
- Estabelecer conexões espontâneas entre neurônios cultivados.
Métodos Utilizados
- Preparação de estênceis de PDMS para o confinamento de proteínas.
- Limpeza de substratos de cultura, como placas de Petri e lamínulas.
- Deposição de estênceis de PDMS sobre o substrato para criar padrões adesivos.
- Plaqueamento de células neuronais e gliais sobre o substrato padronizado.
Resultados Principais
- Estabelecimento bem-sucedido de circuitos neuronais confinados espacialmente.
- Demonstração de conexões espontâneas entre neurônios.
- Atividade eletrofisiológica observada nas redes cultivadas.
- Validação do protocolo para estudos futuros sobre conectividade neuronal.
Conclusões
- O protocolo cria efetivamente redes neurais modulares in vitro.
- O confinamento espacial aumenta a interconectividade funcional.
- Este método pode ser utilizado para estudos eletrofisiológicos adicionais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa metodologia in vitro de rede neuronal modular permite controle espacial preciso de conjuntos neuronais, apoiando a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos para a descoberta de fármacos em neurociência. Ao estabelecer circuitos funcionalmente interconectados com leituras quantificáveis de eletrofisiologia e imagem de cálcio, a abordagem fornece confiança preditiva em ensaios de conectividade neuronal. Ela aborda um desafio fundamental na fase de descoberta: modelar a dinâmica de circuitos cerebrais para avaliar os efeitos de compostos sobre a sincronia e a comunicação da rede.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a modulação da distância entre compartimentos para regular a sincronização intermódulos.
- Valor Operacional: Oferece um sistema relevante para doenças na avaliação do engajamento de alvos por meio da formação espontânea de circuitos neuronais e do estabelecimento de redes funcionais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera medições quantitativas de variáveis dependentes por meio de gravações com matriz de eletrodos múltiplos e imagem de cálcio para avaliar a dinâmica da atividade em rede.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio de padronização reprodutível com estêncil de PDMS e deposição de camada de proteína para adesão celular consistente.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece alinhamento translacional de biomarcadores ao correlacionar a densidade de conexões com a ocorrência de sincronização, permitindo decisões de avanço ajustadas ao risco.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade do modelo pré-clínico ao permitir a observação da formação de conexões neuronais após 6-7 dias in vitro e sua estabilização no 14º dia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir testes de hipóteses sobre a dinâmica da comunicação neuronal, com resultados que informam diretamente a identificação de compostos promissores por meio do perfil de atividade da rede.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao permitir a investigação controlada de como a densidade de conexões regula a sincronização entre módulos em redes modulares.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de protocolos padronizados de tratamento de superfície e semeadura celular que garantem a adesão reprodutível de neurônios às áreas padronizadas com PDL.
- Análises: Fornece detecção de potenciais de ação eletrofisiológicos e medições do início de eventos de cálcio, permitindo a comparação quantitativa da sincronia intra e interaglomerados sob diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica ao demonstrar a formação espontânea de redes funcionais que refletem os princípios de comunicação de circuitos in vivo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável de padronização de redes neuronais em substratos (lamínulas, MEAs) para apoiar campanhas repetidas de triagem e estudos de validação de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neuronais ao fornecer um sistema controlável para estudar como a topologia estrutural influencia a conectividade funcional.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de etapas de revestimento de PDL assistido a vácuo e esterilização por UV, que garantem uma preparação de superfície consistente entre experimentos.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avanço ou interrupção ao permitir testes de resposta à dose de compostos sobre a sincronia da rede, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados no desenvolvimento de fármacos para o SNC.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao quantificar limiares de sincronização dependentes de conexão, que orientam a redução de riscos mecanicistas em alvos neuronais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na fabricação de estênceis microfluídicos, no cultivo de células neuronais e nas técnicas de gravação eletrofisiológica/óptica.
- Depende do acesso a equipamentos de centrifugação, câmaras de vácuo, esterilizadores de luz ultravioleta, matrizes de eletrodos múltiplos e sistemas de imagem de cálcio.
- Necessita padronização entre equipes no design dos estênceis, nos protocolos de revestimento proteico e nas densidades de semeadura para garantir reprodutibilidade entre laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes subtipos neuronais ou proporções de co-cultivo com células gliais, a fim de manter a estabilidade da rede e prevenir crescimento excessivo.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de alinhamento preciso dos estênceis com os eletrodos da MEA e a dependência do tamanho das estruturas de PDMS para definir as dimensões do circuito (por exemplo, módulos quadrados de 300 mícrons).
