Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Este protocolo descreve a fabricação de redes neurais microengenheiradas em tecidos, ou micro-TENNs, que são estruturas tridimensionais em miniatura compostas por tratos axonais longos e alinhados que se estendem entre populações neuronais discretas no interior de um hidrogel tubular. Os micro-TENNs replicam a anatomia geral em nível de sistemas do conectoma cerebral, especificamente grupos funcionalmente semelhantes de neurônios conectados por tratos axonais longos. Por serem pré-cultivados para imitar a arquitetura celular das vias cerebrais, os micro-TENNs podem ser aplicados na reconstrução direcionada da circuitaria neural perdida devido a trauma ou doenças neurodegenerativas, bem como em modelos biofidedignos para estudos neurobiológicos.

Um dos aspectos mais desafiadores deste protocolo é trabalhar com o fator de forma em escala micrométrica, o que é essencial para permitir uma entrega minimamente invasiva no cérebro. Comece quebrando manualmente tubos capilares de vidro em fragmentos de 2 a 2,5 centímetros e insira uma agulha de acupuntura em cada fragmento. Transfira um mililitro de agarose a três por cento em DPBS para a superfície de uma placa de petri vazia.

Segurando o tubo capilar na agulha inserida, coloque uma extremidade do tubo em contato com a poça de agarose líquida para enchê-lo por ação capilar. Quando o líquido parar de subir, retire o tubo capilar da poça e coloque-o horizontalmente sobre a superfície de uma placa de Petri. Em seguida, posicione o polegar e o indicador em ambos os lados do tubo e aperte firmemente.

Use a outra mão para puxar rapidamente a agulha enquanto o polegar e o indicador impedem que a microcoluna em si deslize para fora do tubo. Em seguida, insira uma agulha de 30 gauge no tubo capilar para empurrar lentamente a microcoluna para um recipiente contendo DPBS. Transfira cuidadosamente uma microcoluna de DPBS para um recipiente vazio usando pinças finas.

Adicione 10 microlitros de DPBS no topo da micro-coluna com uma micropipeta para evitar secagem. Enquanto trabalha sob um microscópio estereoscópico, corte a micro-coluna com um escalpelo microcirúrgico para reduzi-la ao comprimento desejado. Em seguida, use pinças finas para transferir a micro-coluna cortada para uma placa de Petri diferente contendo DPBS.

Esterilize as microcolunas nas placas de Petri contendo DPBS sob luz ultravioleta por 30 minutos. Use uma broca para perfurar 16 orifícios dispostos em uma matriz 4 por 4 de 4 centímetros, com separação de 1 centímetro, na tampa de uma placa de Petri de 10 centímetros. Dentro de uma cabine de exaustão química, utilize a parte inferior de uma placa de Petri para pesar 27 gramas de PDMS e três gramas de agente de cura.

Agite com uma espátula micro para distribuir o agente uniformemente. Em seguida, cubra o agente de cura de PDMS com a tampa perfurada. Conecte uma extremidade de uma mangueira à saída de vácuo da cabine de exaustão e insira a outra extremidade no tubo de um funil de tamanho apropriado.

Coloque uma pipeta de 1 mililitro com ponteira de 1 mililitro na mangueira e puxe a mangueira para cima até que a pipeta vede a mangueira no interior do funil. Em seguida, posicione o funil sobre a tampa perfurada da placa e fixe a mangueira com um suporte resistente disponível. Abra a válvula de vácuo por cinco minutos para aspirar e trazer as bolhas de ar até a superfície.

Após cinco minutos, feche a válvula, remova o funil e bata levemente a placa de Petri contra a superfície da cabine de segurança algumas vezes para estourar quaisquer bolhas de ar remanescentes. Coloque um molde piramidal em 3D em cada poço de uma placa de cultura de 12 poços, com as pirâmides voltadas para cima. Em seguida, despeje o agente de cura de PDMS sobre os moldes até que cada poço da placa esteja completamente preenchido.

Transfira a placa tampada para uma estufa por uma hora a 60 graus Celsius para secagem. Após esterilizar os arranjos de PDMS em autoclave e trabalhando em uma cabine de segurança biológica, insira um arranjo de micropoços em cada poço de uma placa estéril de 12 poços. Para formar os agregados neuronais, utilize uma micropipeta para adicionar 12 microlitros de suspensão celular em cada micropoço do arranjo de PDMS.

Centrifugue a placa a 200 vezes g durante cinco minutos para forçar a agregação das células no fundo das microcavidades. Em seguida, adicione cuidadosamente cerca de dois mililitros de meio de cultura no topo de cada arranjo de PDMS para cobrir todas as microcavidades semeadas. Incube a placa por 12 a 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Para iniciar a fabricação do núcleo de MEC, misture colágeno do tipo 1, laminina e meio de cultura em um tubo de microcentrífuga e ajuste o pH para 7,2 a 7,4. Em seguida, coloque o tubo contendo o MEC no gelo. Use pinças estéreis para transferir as microcolunas para placas de Petri vazias de 35 ou 60 milímetros.

Em seguida, trabalhando sob um estereomicroscópio, utilize uma ponteira de 10 microlitros acoplada a uma pipeta de 1000 microlitros para remover o DPBS residual e bolhas de ar da luz. Rapidamente, aspire quatro a cinco microlitros de CEM em uma micropipeta, coloque a ponteira da micropipeta em uma das extremidades de uma micro-coluna e libere uma quantidade suficiente de CEM para preencher a luz. Para prevenir a desidratação, adicione dois microlitros de CEM ao redor de cada micro-coluna.

Incube as microcolunas de hidrogel CEM em placas de Petri a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Prossiga imediatamente para a semeadura celular após a incubação. Transfira aproximadamente de 10 a 20 microlitros de meio de cultura para duas áreas livres nas placas de Petri que contêm as microcolunas.

Use uma micropipeta para coletar individualmente os agregados neuronais e transfira-os para a placa de Petri contendo os construtos. Mova os agregados com pinças para uma das pequenas poças de meio de cultura para preservar a saúde celular. Enquanto observa sob um microscópio estereoscópico, use pinças para inserir um agregado em uma das extremidades das microcolunas para micro-TENNs unidirecionais, ou em cada extremidade para arquitetura bidirecional.

Em seguida, mova a micro-coluna semeadas para outra pequena poça de meio de cultura para evitar desidratação e preservar a saúde dos agregados. Quando todas as micro-colunas tiverem sido carregadas, incube a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 45 minutos para permitir que os agregados adiram à MEC. Após a incubação, verifique se os agregados permanecem nas extremidades das micro-colunas utilizando o microscópio estereoscópico.

Por fim, adicione cuidadosamente meio de cultura aos recipientes de Petri contendo os micro-TENNs utilizando uma pipeta. Coloque os recipientes em uma incubadora a 37 graus Celsius em atmosfera com 5% de dióxido de carbono para cultivo de longo prazo. Essas imagens de contraste de fase mostram micro-TENNs com 2 mililitros de comprimento unidirecional por até oito dias in vitro.

Nestas imagens, observe os agregados neuronais nas extremidades da micro-coluna, enquanto os tratos axonais alinhados se projetam através da luz. Como visto aqui, os tratos axonais se estendem quase por todo o comprimento da micro-coluna após cinco dias in vitro. Para micro-TENNs bidirecionais de 5 milímetros, os tratos axonais ocupam todo o comprimento da micro-coluna no quinto dia in vitro, e essa arquitetura é mantida por pelo menos até o décimo dia in vitro.

As duas imagens a seguir podem auxiliar na resolução de problemas com o procedimento. Esta imagem mostra uma microcoluna de hidrogel seco completamente desidratada, como resultado da remoção total e/ou evaporação de DPBS, CEM ou meio de cultura durante a fabricação. Esta imagem mostra uma microcoluna com o lúmen alinhado à parede externa, devido à falta de alinhamento concêntrico da agulha de acupuntura com o tubo capilar.

Por fim, esta imagem confocal mostra um micro-TENN bidirecional após 28 dias in vitro, corado para os núcleos celulares com Hoechst em azul, com axônios marcados com tudge one em vermelho e botões pré-sinápticos marcados com sinapsina 1 em verde. A migração celular a partir dos agregados ao longo dos tratos axonais é observada na presença de terminais pré-sinápticos, conforme sugerido. Os micro-TENNs são construtos anatomicamente inspirados e autossuficientes que imitam aspectos-chave da citarquitetura do conectoma; portanto, os micro-TENNs podem fornecer um meio para substituir vias neurais perdidas após implante no cérebro.

Componentes cruciais deste método incluem o esquema de encapsulamento do biomaterial tubular, que permite o crescimento axonal longitudinal, e o método agregado, que garante a obtenção da citarquitetura adequada dos corpos celulares restritos às extremidades dos tratos axonais ao longo do interior. Após dominar esses métodos, os princípios desta técnica podem ser aplicados para construir micro-TENNs com outros fenótipos celulares e componentes de biomateriais, de acordo com a aplicação específica.