Redes neuronais modificadas por micro-tecidos tridimensionais com inspiração anatômica para a reconstrução, modulação e modelagem do sistema nervoso

Este protocolo descreve a fabricação de redes neurais de engenharia de micro-tecidos ou micro-TENNs, que são construções tridimensionais em miniatura compostas por tratos axonais alinhados há muito tempo, abrangendo populações neuronais discretas dentro do lúmen de um hidrogel tubular. Os micro-TENNs replicam a anatomia geral do conectoma cerebral, especificamente, grupos de neurônios funcionalmente semelhantes conectados por longos tratos axonais. Por serem pré-cultivados para emular a citoarquitetura das vias cerebrais, os micro-TENNs podem ser aplicados para a reconstrução direcionada de circuitos neurais perdidos devido a trauma ou doença neurodegenerativa e como modelos biofidélicos para estudos neurobiológicos.

Um dos aspectos mais desafiadores deste protocolo é trabalhar com o fator de forma em escala de mícron, que é necessário para permitir uma entrega minimamente invasiva no cérebro. Comece quebrando manualmente os tubos capilares de vidro em fragmentos de 2 a 2,5 centímetros e insira uma agulha de acupuntura em cada fragmento. Transfira um mililitro de agarose a três por cento em DPBS para a superfície de uma placa de Petri vazia.

Segurando o tubo capilar na agulha introduzida, coloque uma extremidade do tubo em contato com a piscina de agarose líquida para preenchê-la por ação capilar. Quando o líquido parar de subir, remova o tubo capilar da piscina e coloque-o horizontalmente na superfície de uma placa de Petri. Em seguida, coloque o polegar e o indicador em ambos os lados do tubo e segure com força.

Use a outra mão para puxar rapidamente a agulha para fora enquanto o polegar e o indicador evitam que a própria microcoluna deslize para fora do tubo. Em seguida, insira uma agulha de calibre 30 no tubo capilar para empurrar lentamente a microcoluna para fora em um prato contendo DPBS. Transfira cuidadosamente uma microcoluna do DPBS para um prato vazio usando uma pinça fina.

Adicione 10 microlitros de DPBS ao topo da microcoluna com um micropipetado para evitar o ressecamento. Ao trabalhar sob um estereomicroscópio, desarme a microcoluna com um microbisturi para encurtá-la até o comprimento desejado. Em seguida, use uma pinça fina para transferir a microcoluna aparada para uma placa de Petri diferente contendo DBPS.

Esterilizar as microcolunas nas placas de Petri contendo DPBS sob luz ultravioleta durante 30 minutos. Use uma broca para perfurar 16 furos como uma matriz de 4 por 4 de 4 centímetros com uma separação de 1 centímetro na tampa de uma placa de Petri de 10 centímetros. Dentro de uma capela de exaustão química, use a parte inferior de uma placa de Petri para pesar 27 gramas de PDMS e três gramas de agente de cura.

Mexa com uma micro espátula para distribuir o agente uniformemente. Em seguida, cubra o agente de cura PDMS com a tampa perfurada. Conecte uma extremidade de uma mangueira à porta de vácuo da hotte e insira a outra extremidade na haste de um funil de tamanho adequado.

Coloque um bulbo de pipeta de 1 mililitro em uma ponta de 1 mililitro na mangueira e puxe a mangueira para cima até que o bulbo vede a mangueira na haste do funil. Em seguida, coloque o funil na tampa do prato furado e prenda a mangueira com um suporte resistente disponível. Abra a válvula de vácuo por cinco minutos para aspirar e trazer as bolhas de ar para a superfície.

Após cinco minutos, feche a válvula, remova o funil e bata a placa de Petri contra a superfície da hotte algumas vezes para estourar as bolhas de ar restantes. Coloque um molde impresso em 3D de poço piramidal em cada um dos poços em uma placa de cultura de 12 poços com as pirâmides apontando para cima. Em seguida, despeje o agente de cura PDMS em cima dos moldes até que cada poço da placa esteja cheio.

Transfira o prato coberto para um forno por uma hora a 60 graus Celsius para secar. Depois de esterilizar as matrizes PDMS por autoclavagem e trabalhar em um gabinete de biossegurança, insira uma matriz de micropoços em cada poço de uma placa estéril de 12 poços. Para formar os agregados neuronais, use um micropipetado para adicionar 12 microlitros de suspensão celular em cada micropoço da matriz PDMS.

Centrifugue a placa a 200 vezes g por cinco minutos para forçar a agregação de células no fundo dos micropoços. Em seguida, adicione cuidadosamente aproximadamente dois mililitros de meio de cultura ao topo de cada matriz PDMS para cobrir todos os micropoços semeados. Incube a placa por 12 a 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

Para iniciar a fabricação do núcleo CEM, misture colágeno tipo 1, laminina e meio de cultura em um tubo de microcentrífuga e ajuste o pH para 7,2 a 7,4. Em seguida, coloque o tubo contendo CEM no gelo. Use uma pinça estéril para transferir as microcolunas para placas de Petri vazias de 35 ou 60 milímetros.

Em seguida, enquanto trabalha sob um estereomicroscópio, use uma ponta de 10 microlitros presa a uma ponta de 1000 microlitros para extrair DPBS residual e bolhas de ar do lúmen. Extraia rapidamente quatro a cinco microlitros de CEM em um micropipetado, depois coloque a ponta do micropipetado em uma extremidade de uma microcoluna e descarregue CEM suficiente para preencher o lúmen. Para evitar a desidratação, adicione dois microlitros de CEM ao redor de cada microcoluna.

Incube as micro-colunas de hidrogel CEM em placas de Petri a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 15 minutos. Prossiga para a semeadura de células imediatamente após a incubação. Transfira aproximadamente 10 a 20 microlitros de meio de cultura para duas áreas livres nas placas de Petri que contêm as microcolunas.

Use um micropipetado para coletar os agregados neuronais individualmente e transferi-los para a placa de Petri que contém as construções. Mova os agregados com uma pinça para um dos pequenos pools de meio de cultura para preservar a saúde das células. Enquanto observa sob um estereomicroscópio, use uma pinça para inserir um agregado em uma extremidade das micro-colunas para micro-TENNs unidirecionais, ou em cada extremidade para arquitetura bidirecional.

Em seguida, mova a microcoluna semeada para o outro pequeno conjunto de meio de cultura para evitar a desidratação e preservar a saúde dos agregados. Quando todas as microcolunas estiverem carregadas, incubar a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por 45 minutos para permitir que os agregados adiram ao CEM. Após a incubação, verificar se os agregados permanecem nas extremidades das micro-colunas usando o estereomicroscópio.

Por último, inundar cuidadosamente as placas de Petri que contêm os micro-TENNs com meio de cultura com uma pipeta. Coloque os pratos em uma incubadora a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono para cultura de longo prazo. Essas imagens de contraste de fase mostram micro-TENNs unidirecionais de 2 mililitros de comprimento por até oito dias in vitro.

Nessas imagens, observe os agregados neuronais nos extremos da microcoluna enquanto os tratos axonais alinhados se projetam através do lúmen. Como visto aqui, os tratos axonais se estendem por quase todo o comprimento da microcoluna em cinco dias in vitro. Para micro-TENNs bidirecionais de 5 milímetros, os tratos axonais preenchem o comprimento da microcoluna em 5 dias in vitro, e essa arquitetura é mantida pelo menos até 10 dias in vitro.

As duas imagens a seguir podem ajudar a solucionar problemas com o procedimento. Esta imagem mostra uma microcoluna de hidrogel seco completamente desidratado como resultado da remoção completa e/ou evaporação de DPBS, CEM ou meio de cultura durante a fabricação. Esta imagem mostra uma micro-coluna com o lúmen revestindo a parede externa devido à falta de alinhamento concêntrico da agulha de acupuntura com o tubo capilar.

Finalmente, esta imagem confocal mostra um micro-TENN bidirecional em 28 dias in vitro, corado para núcleos celulares com Hoechst em azul e com axônios marcados com tudge um em vermelho e botões pré-sinápticos marcados com sinapsina 1 em verde. A migração celular dos agregados ao longo dos tratos axonais é observada na presença de terminais pré-sinápticos, conforme sugerido. Micro-TENNs são construções independentes e anatomicamente inspiradas que emulam aspectos-chave da citoarquitetura do conectoma; portanto, os micro-TENNs podem fornecer um meio de substituir as vias neurais perdidas após a implantação no cérebro.

Componentes cruciais deste método incluem o esquema de invólucro de biomaterial tubular, que permite o crescimento axonal longitudinal, e o método agregado, que garante a obtenção da citoarquitetura adequada de corpos celulares restritos às extremidades dos tratos axonais ao longo do interior. Após o domínio desses métodos, os princípios dessa técnica podem ser aplicados para construir micro-TENNs com outros fenótipos celulares e componentes de biomateriais, de acordo com a aplicação específica.