Protocolos para obtenção de embriões somáticos e Zygotic para estudar a regulação do desenvolvimento embrionário precoce no Modelo de leguminosas Medicago truncatula

O objetivo é ilustrar que a leguminosa modelo Medicago truncatula pode ser prontamente utilizada para investigar a regulação da embriogênese inicial da planta para complementar o modelo Arabidopsis não leguminoso. A morfologia do vagem está ligada aos estágios de embriogênese zigótica e um protocolo para coletar embriões usando cultura de tecidos também é fornecido.

O objetivo geral dos procedimentos a seguir é demonstrar quantos embriões de tula de carga podem ser obtidos em diferentes estágios de desenvolvimento para investigar a regulação genética da embriogênese em plantas, isso pode ser feito ligando a morfologia do vagem com os diferentes estágios de desenvolvimento do embrião zigótico e cultivando o explanamento foliar para obter embriões somáticos nos diferentes estágios. Em última análise, a PCR quantitativa e a beta glucuronidase podem ser usadas para avaliar a expressão de genes durante a embriogênese nos estágios específicos de desenvolvimento de interesse. As vantagens dessas técnicas são que a marcação de flores individuais não é necessária para os experimentos in vivo e são otimizadas em procedimentos in vitro, fornecendo abordagens experimentais complementares.

A demonstração visual do procedimento de cultura é importante porque permite que os detalhes das manipulações sejam acompanhados mais de perto. Demonstrando o procedimento in vivo estará Wang, enquanto Kim Nolan demonstrará o procedimento in vitro. Para facilitar o desenvolvimento do embrião zigótico, perfure a superfície dos tegumentos das sementes de uma planta trinocular Monte cargo e mergulhe as sementes durante a noite, totalmente cobertas de água.

No dia seguinte, semeie três sementes em cada um dos 10 vasos de 15 centímetros de diâmetro na mistura de envasamento e transfira os vasos para uma casa de vidro. Cultive as plantas em um período fotográfico de 14 horas com uma temperatura diurna noturna de 23 a 19 graus Celsius, retendo as mudas mais saudáveis após a germinação para que haja uma planta por vaso e cercando as mudas por treliça para que os caules das plantas subam quando as vagens aparecerem. Colete nos estágios apropriados descritos na tabela um e na figura um para obter o estágio inicial de desenvolvimento embrionário desejado.

Em seguida, use uma pinça para isolar os les das vagens. Alternativamente, para microscopia mais refinada, totalmente clara na solução de Hoyer, os estágios embrionários podem ser confirmados por imagens dos embriões sob um microscópio composto padrão. Em seguida, colete o número de UL necessário para o experimento da região central do pod e armazene-os na temperatura apropriada para análise a jusante para o desenvolvimento de embriões somáticos.

Folhetos de colheita in vitro da última folha de tato quase totalmente expandida de um caule alongado de uma cultivar tran atula que é capaz de formar embriões prontamente em cultura. Mantenha as folhas de tate em papel toalha úmido em um vaso de cultura para evitar a desidratação. Em seguida, trabalhando em um armário de biossegurança esterilizado por UV, coloquei as folhas na bola de malha de um infusor de chá de primavera em autoclave.

Um infusor imerso em 70% de etanol em uma tampa de rosca de 250 mililitros em autoclave. Vaso de cultura de policarbonato após 30 segundos, drene o tecido foliar e mergulhe o infusor em uma solução diluída de alvejante de um a oito por 10 minutos. Com um giro suave ocasional, gire suavemente a panela e escorra o excesso de água.

Em seguida, enxágue o infusor. Mais uma vez em água fresca deionizada em um novo pote. Agora use uma pinça estéril para transferir as folhas do infusor de chá para uma cultura fresca, pote de água destilada destilada deionizada estéril aparafuse na tampa estéril.

Em seguida, enxágue as folhas por inversão e agitação. Em seguida, deixe os folhetos flutuarem na água estéril para revestir os implantes. Apare as bordas dos folhetos esterilizados individuais usando a técnica estéril.

Em seguida, corte o retângulo restante em dois ou três, oito a 10 por três a cinco milímetros retangulares com a veia média no centro de cada placa de explicação X. Seis x explantes por meio de cultura solidificado em ágar em nove centímetros de diâmetro. Placas de Petri com o lado de vedação ABA voltado para baixo para manter a orientação usual da folha.

Em seguida, sele as placas de Petri com perfil e incube as placas no escuro a 28 graus Celsius em uma sala de temperatura controlada. Após três semanas, use uma espátula estéril de aço inoxidável e uma pinça para subcultivar os explantes de orifício diferenciado em meio fresco. Os primeiros embriões devem ser observados em cerca de quatro semanas, à medida que ocorre o calo e o calo excede o tamanho do maior explane mostrado aqui.

Transfira apenas 50% do calo individual quando subcultivado para meio fresco. Finalmente, use um microscópio estéreo para coletar os diferentes estágios embrionários durante um período de incubação de quatro a oito semanas, processando os explantes de acordo com os objetivos experimentais. Após a colheita de embriões zigóticos, como acabamos de demonstrar a jusante em C, duas hibridações ou outras estratégias apropriadas podem ser empregadas de particular interesse, conforme demonstrado nessas imagens, a distinção do SSIS e Spencer pode ser observada seguindo os planos X revestidos.

Através das semanas quatro a oito embriões somáticos em estágios discretos podem ser localizados e escolhidos para análise imediata. Por exemplo, esses dados ilustram como os embriões no estágio inicial de oleína exibem a expressão de um tipo de gene Tula eoin medicago, mas não de outro. Uma vantagem particular do sistema embrionário somático é que a transformação do calo pode ser realizada sem regenerar uma planta inteira.

De fato, como demonstrado aqui. A beta glucuronidase pode ser usada para visualizar a expressão gênica nos diferentes estágios da embriogênese. Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como selecionar e dissacar o pod para obter Andres.

Você também deve ter uma boa compreensão de como preparar e planplanar estéril para embriogênese somática Após seu desenvolvimento. Essas técnicas permitiram a investigação da regulação da transcrição dos estágios iniciais da embriogênese em relação ao crescimento embrionário, desenvolvimento e armazenamento de nutrientes.