Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a atividade do ciclo celular em cardiomiócitos pós-natais e determinar sua nuclearidade. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da regeneração cardíaca, como um cardiomiócito realmente se divide ou apenas aumenta sua ploidia ou se torna multinucleado? As principais vantagens desta técnica são que a fase M do ciclo celular pode ser visualizada em alta resolução espaço-temporal e que os núcleos dos cardiomiócitos podem ser identificados por fluorescência.

Demonstrando o procedimento estará Patricia Freitag, técnica do nosso laboratório. Se estiver usando pares reprodutores não homozigotos, primeiro identifique os corações transgênicos por meio de microscopia fluorescente para verificar sua expressão de EGFP analina e H2B-mCherry. A análise de EGFP em sinais nucleares pode ser mais facilmente detectada nas bordas dos átrios, concentrando-se através de suas camadas de tecido.

Para isolar os cardiomiócitos, coloque o número apropriado de corações em tubos de reação de 1,5 mililitro contendo um mililitro de mistura de enzimas de um kit de dissociação cardíaca neonatal e corte os corações em pequenos pedaços com uma tesoura. Em seguida, transfira a solução para tubos de reação de 15 mililitros. Coloque o tubo em uma posição quase horizontal a 37 graus Celsius por 15 minutos, misturando o tecido cinco a 10 vezes com uma pipeta de cinco mililitros no final da incubação.

No final da terceira digestão, pare a reação com 7,5 mililitros de meio dois e filtre a suspensão celular através de um filtro de células de 70 mícrons. Enxágue o filtro de células com três mililitros de meio dois, agrupando a lavagem com as células coletadas e colete as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de meio para contagem.

Em seguida, semeie uma vezes dez elevado ao quarto células por poço em 120 microlitros de meio em uma placa de fundo plano de 96 poços e centrifugue as células antes de sua cultura noturna em uma incubadora de cultura de células. No dia seguinte, a maioria dos cardiomiócitos deve estar batendo. Antes de iniciar a transfecção, limpe a bancada e todos os materiais de transfecção com solução de descontaminação de RNAse para remover qualquer RNAse.

Quando todos os materiais estiverem prontos, adicione 20 microlitros de mistura de siRNA recém-preparada a cada poço e retorne as células à incubadora por 48 horas. Após dois dias, substitua o sobrenadante em cada poço por 120 microlitros de meio e retorne as células à incubadora por pelo menos mais 24 horas. Ao final da incubação, lave as células uma vez com PBS, seguida de fixação em solução de formaldeído a 4% por 20 minutos.

Para analisar as células por microscopia de vídeo confocal, transfira a placa para o estágio do microscópio confocal e inicie o software de imagem. Abra as configurações do A1plus e marque as caixas do canal um, dois, três e quatro. No menu suspenso, defina o canal um como DAPI, o canal dois como eGFP, o canal três como RFP e o canal quatro como Cy5.

Clique na tensão do canal e use as barras deslizantes para definir a tensão como 80 para cada canal. Use as barras deslizantes para definir o deslocamento como zero e clique no botão home para definir o orifício para a posição inicial. Defina o tamanho da digitalização para 1024 por 1024 pixels no menu suspenso.

Clique em otimizar para abrir a janela de configuração do tamanho XYZ e marque a caixa de voxel perfeita na etapa sugerida Z.Selecione a objetiva de 20x e ajuste as intensidades do laser até que a imagem não fique sub nem superexposta. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, abra o menu Adquirir. Selecione digitalizar imagem grande e escolha a posição atual no canto superior esquerdo da área.

Em seguida, defina o número de campos em X e Y para três por três e clique em digitalizar. Para definir o número de núcleos de cardiomiócitos, clique em medir, medição manual e contagens. Selecione os núcleos com sinais H2B-mCherry, marcando-os e contando-os.

Em seguida, selecione as células positivas para alfa-actinina para determinar o número de cardiomiócitos. Para contar os cardiomiócitos das fases G1, S, G2 com sinais nucleares de analina EGFP, selecione a medida, a medição manual e as contagens. Marque os núcleos que expressam EGFP analina e H2B-mCherry com cliques e conte manualmente os cardiomiócitos com os sinais de analina EGFP específicos da mitose, como anéis contráteis e corpos médios.

Em seguida, clique em medir, medir manualmente e contar e clique nos cardiomiócitos com sinais de analina EGFP específicos da mitose, sinais citoplasmáticos, anéis contráteis e meio do corpo. Em comparação com os controles negativos, os cardiomiócitos transfectados com miRNA e siRNA demonstram uma indução da atividade do ciclo celular. Os cardiomiócitos que realizam endoreduplicação exibem uma expressão exclusivamente nuclear de EGFP analina, enquanto os cardiomiócitos submetidos à divisão celular exibem expressão de EGFP analina em localizações típicas da fase M.

Após a digestão enzimática do tecido cardíaco no aparelho de Langendorff, os átrios e ventrículos podem ser separados mecanicamente e analisados de forma independente, permitindo a visualização de cardiomiócitos ventriculares transgênicos H2B-mCherry com um alto número de cardiomiócitos binucleados H2B-mCherry positivos. Por outro lado, a maioria dos cardiomiócitos atriais é mononucleada. A digestão enzimática não resulta em uma população de 100% de células únicas, revelando um padrão de estrias cruzadas por coloração com alfa-actinina, facilitando ainda mais a discriminação entre cardiomiócitos binucleados como um padrão contínuo de estrias cruzadas e dublês de células.

Para analisar o índice de binucleação de cardiomiócitos em fatias grossas, é necessário percorrer manualmente a pilha, pois os núcleos não estão necessariamente dentro de um plano Z, com a coloração com aglutinina de gérmen de trigo permitindo a detecção da célula borders. 3D reconstruções de fatias fixas de corações de camundongos transgênicos adultos permitem a detecção e contagem automatizada de ganchos, corados e H2B-mCherry positivos para determinar a proporção de núcleos de cardiomiócitos em condições fisiológicas dentro do tecido. Uma vez dominada, a dissociação do coração pode ser concluída em duas a três horas se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar continuamente para manter a viabilidade das células durante todo o experimento. Após este procedimento, é possível rastrear microRNAs ou outras pequenas substâncias quanto aos seus efeitos indutores de proliferação em cardiomiócitos pós-natais.