Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes
24 de fevereiro de 2017
Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.
O objetivo geral deste procedimento é visualizar a atividade do ciclo celular em cardiomiócitos pós-natais e determinar sua nuclearidade. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de regeneração cardíaca, como por exemplo: um cardiomiócito realmente se divide ou simplesmente aumenta sua ploidia ou se torna multinucleado? As principais vantagens desta técnica são a possibilidade de visualizar a fase M do ciclo celular com alta resolução espaciotemporal e a identificação dos núcleos de cardiomiócitos por fluorescência.
Quem demonstrará o procedimento será Patricia Freitag, uma técnica do nosso laboratório. Se forem utilizados pares de cruzamento não homozigóticos, identifique primeiro os corações transgênicos por meio de microscopia fluorescente para verificar a expressão de EGFP analina e H2B-mCherry. Os sinais nucleares de EGFP analina podem ser detectados mais facilmente nas bordas das aurículas, focando através das camadas do tecido.
Para isolar os cardiomiócitos, coloque o número apropriado de corações em tubos de reação de 1,5 mililitro contendo um mililitro da mistura enzimática de um kit de dissociação de coração neonatal e corte os corações em pequenos pedaços com tesoura. Em seguida, transfira a solução para tubos de reação de 15 mililitros. Coloque o tubo em posição quase horizontal a 37 graus celsius por 15 minutos, misturando o tecido de cinco a dez vezes com uma pipeta de cinco mililitros ao final da incubação.
No final da terceira digestão, interrompa a reação com 7,5 mililitros do meio dois e filtre a suspensão celular através de uma peneira celular de 70 micrômetros. Enxágue a peneira celular com três mililitros do meio dois, reunindo a lavagem com as células coletadas, e recolha as células por centrifugação. Re-suspenda o pellet em 500 microlitros do meio um para contagem.
Em seguida, semeie um vezes dez à quarta potência células por poço em 120 microlitros de meio um em uma placa de 96 poços com fundo plano e centrifugue as células antes do cultivo noturno em uma incubadora de cultivo celular. No dia seguinte, a maioria dos cardiomiócitos deverá estar contraindo. Antes de iniciar a transfeção, limpe a bancada e todos os materiais de transfeção com solução de descontaminação de RNAse para remover qualquer RNAse.
Quando todos os materiais estiverem prontos, adicione 20 microlitros da mistura de siRNA recém-preparada a cada poço e retorne as células para a estufa por 48 horas. Após dois dias, substitua o sobrenadante de cada poço por 120 microlitros do meio um e retorne as células para a estufa por pelo menos mais 24 horas. Ao final do período de incubação, lave as células uma vez com PBS, seguido de fixação em solução de formaldeído 4% por 20 minutos.
Para analisar as células por microscopia confocal em vídeo, transfira a placa para a platina do microscópio confocal e inicie o software de aquisição de imagens. Abra as configurações do A1plus e marque as caixas dos canais um, dois, três e quatro. No menu suspenso, defina o canal um para DAPI, o canal dois para eGFP, o canal três para RFP e o canal quatro para Cy5.
Clique na tensão do canal e use as barras deslizantes para ajustar a tensão para 80 em cada canal. Use as barras deslizantes para ajustar o offset a zero e clique no botão de origem para posicionar o pinhole na posição inicial. Defina o tamanho de varredura como 1024 por 1024 pixels no menu suspenso.
Clique em "otimizar" para abrir a janela de configuração do tamanho XYZ e marque a caixa de voxel perfeito na etapa sugerida Z. Selecione a objetiva de 20x e ajuste as intensidades do laser até que a imagem não esteja nem subexposta nem superexposta. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, abra o menu de aquisição. Selecione "escanear imagem grande" e, em seguida, escolha "posição atual está no canto superior esquerdo" em área.
Em seguida, defina o número de campos em X e Y como três por três e clique em escanear. Para definir o número de núcleos de cardiomiócitos, clique em medir, medição manual e contagens. Selecione os núcleos com sinais de H2B-mCherry, marcando-os e contando-os.
Em seguida, selecione as células positivas para alfa-actinina para determinar o número de cardiomiócitos. Para quantificar os cardiomiócitos em fase G1, S e G2 com sinais nucleares de EGFP-analina, selecione medição, medição manual e contagens. Marque os núcleos que expressam EGFP-analina e H2B-mCherry com cliques e conte manualmente os cardiomiócitos com sinais específicos de mitose de EGFP-analina, tais como anéis contráteis e corpos medianos.
Em seguida, clique em medir, medição manual e contagens, e clique nos cardiomiócitos com sinais de EGFP analina específicos da mitose, sinais citoplasmáticos, anéis contráteis e corpúsculos médios. Em comparação com os controles negativos, os cardiomiócitos transfectados com miRNA e siRNA demonstram uma indução da atividade do ciclo celular. Os cardiomiócitos que realizam endoreduplicação exibem expressão exclusivamente nuclear de EGFP analina, enquanto os cardiomiócitos que passam pela divisão celular mostram expressão de EGFP analina em localizações típicas da fase M.
Após a digestão enzimática do tecido cardíaco no aparelho de Langendorff, os átrios e ventrículos podem ser separados mecanicamente e analisados independentemente, permitindo a visualização de cardiomiócitos ventriculares transgênicos H2B-mCherry com um alto número de cardiomiócitos bi-nucleados positivos para H2B-mCherry. Em contraste, a maioria dos cardiomiócitos atriais é mono-nucleada. A digestão enzimática não resulta em uma população de 100% de células isoladas, revelando um padrão de estriação transversal pela coloração de alfa-actinina, facilitando ainda mais a discriminação entre cardiomiócitos bi-nucleados, que apresentam um padrão contínuo de estriação transversal, e dupletas celulares.
Para analisar o índice de binucleação de cardiomiócitos em fatias espessas, é necessário percorrer manualmente a pilha, pois os núcleos nem sempre estão localizados em um único plano Z, sendo que a coloração com aglutinina de trigo permite a detecção das bordas celulares. Reconstruções tridimensionais de fatias fixadas de corações de camundongos transgênicos adultos permitem a detecção e contagem automatizada de ganchos, núcleos corados e positivos para H2B-mCherry, a fim de determinar a proporção de núcleos de cardiomiócitos em condições fisiológicas dentro do tecido. Após dominado, o procedimento de dissociação cardíaca pode ser concluído em duas a três horas, se realizado corretamente.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar continuamente para manter a viabilidade das células durante todo o experimento. Após seguir este procedimento, é possível testar microRNAs ou outras substâncias pequenas quanto aos seus efeitos indutores de proliferação em cardiomiócitos pós-natais.
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Visão Geral
Este artigo apresenta protocolos para distinguir a divisão celular de variações no ciclo celular de cardiomiócitos utilizando linhagens de camundongos transgênicos. Os métodos permitem a visualização de alta resolução dos núcleos de cardiomiócitos e da atividade na fase M.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia cardiovascular
- Biologia celular
- Medicina regenerativa
Antecedentes
- Compreender o comportamento dos cardiomiócitos é essencial para a regeneração cardíaca.
- Os cardiomiócitos podem aumentar a ploidia ou tornar-se multinucleados sem se dividir.
- Modelos de camundongos transgênicos fornecem ferramentas para estudar esses processos.
- A microscopia fluorescente auxilia na identificação de atividades celulares específicas.
Objetivo do Estudo
- Visualizar a atividade do ciclo celular em cardiomiócitos pós-natais.
- Determinar a nuclearidade dos cardiomiócitos.
- Esclarecer se os cardiomiócitos se dividem ou sofrem alterações na ploidia.
Métodos Utilizados
- Uso de camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh e CAG-eGFP-anillin.
- Microscopia fluorescente para identificar núcleos de cardiomiócitos.
- Obtenção de imagens com alta resolução espaciotemporal da fase M do ciclo celular.
- Identificação de corações transgênicos antes da análise.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de núcleos de cardiomiócitos utilizando fluorescência.
- Distinção clara entre divisão celular e variações do ciclo celular.
- Identificação de sinais nucleares de anilina EGFP em tecido atrial.
- Compreensão aprimorada do comportamento dos cardiomiócitos na regeneração.
Conclusões
- Os protocolos fornecem um método confiável para estudar a divisão de cardiomiócitos.
- Os marcadores fluorescentes são eficazes na identificação de processos celulares.
- Esta pesquisa contribui para a área de regeneração cardíaca.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação precisa da proliferação de cardiomiócitos em comparação com a poliploidização é fundamental para analisar estratégias de regeneração cardíaca em modelos pré-clínicos. A interpretação incorreta de marcadores nucleares pode levar à superestimação da atividade mitótica real, afetando os esforços de validação de alvos e identificação de compostos promissores. Este método oferece uma abordagem mecanicista de redução de riscos, distinguindo a divisão celular autêntica da endoreduplicação ou da mitose acinética, melhorando assim a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relativas à proliferação de cardiomiócitos, distinguindo verdadeira mitose de síntese de DNA sem citocinese.
- Valor Operacional: Utiliza marcadores nucleares e mitóticos fluorescentes para reduzir ambiguidade na avaliação do estado do ciclo celular.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos em alvos terapêuticos, esclarecendo se um composto induz hiperplasia ou crescimento hipertrófico por meio do aumento da ploidia.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do ensaio: Gera sinais nucleares e mitóticos quantificáveis compatíveis com imagem de alto conteúdo para triagem de compostos.
- Reprodutibilidade: Sistemas repórter transgênicos padronizados permitem detecção consistente de núcleos de cardiomiócitos e eventos da fase M entre experimentos.
- Escalabilidade: Compatível com formatos de placas de 96 poços e protocolos de dissociação enzimática para triagem de média escala de miRNAs ou moléculas pequenas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplicável diretamente a modelos de cardiomiócitos pós-natais utilizados na validação de alvos em medicina regenerativa.
- Continuidade Tradutiva: Conecta achados in vitro à análise em nível tecidual por meio de reconstrução 3D e contagem automatizada de núcleos em fatias espessas.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Permite diferenciar efeitos pró-proliferativos de efeitos poliploidizantes, orientando critérios de avanço ou interrupção no desenvolvimento pré-clínico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta que vai da validação do alvo à identificação de compostos líderes e à avaliação pré-clínica, especialmente para compostos que modulam a dinâmica do ciclo celular de cardiomiócitos.
- Biologia do Descobrimento: Apoia a verificação de hipóteses por meio da visualização da atividade em fase M e da nuclearidade para esclarecer mecanismos de ação.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de repórteres fluorescentes, facilitando a avaliação confiável de compostos em placas de microtitulação.
- Análises: Fornece leituras quantitativas, como contagem de núcleos por célula, índice mitótico e taxa de binucleação, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta observações celulares à arquitetura tecidual por meio de empilhamento z confocal e detecção de bordas utilizando aglutinina de trigo germinado.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação do potencial regenerativo cardíaco em diversas classes de compostos e modelos genéticos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir sinais falsos positivos de proliferação decorrentes da endorreduplicação ou mitose acinética.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade por meio de marcadores transgênicos padronizados e parâmetros de imagem definidos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a identificação precoce de compostos com atividade hiperplásica genuína.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao distinguir classes mecanicistas de resposta de cardiomiócitos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia confocal, manuseio de animais transgênicos e técnicas de isolamento de cardiomiócitos.
- Depende do acesso às linhagens de camundongos Myh6-H2B-mCh e CAG-eGFP-anillin ou sistemas duplos repórter equivalentes.
- Necessita procedimentos padronizados de digestão enzimática e semeadura para manter a viabilidade celular e a fidelidade da coloração.
- Envolve etapas de medição manual de núcleos e contagem de eventos mitóticos, o que pode exigir treinamento interoperador para garantir consistência.
- Limitado pela acessibilidade do tecido e pela penetração do sinal em fatias espessas, exigindo clareamento óptico ou seccionamento para análise de tecidos profundos.
