Name: Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprenda a visualizar atividade do ciclo celular em cardiomiócitos pós-natais usando linhagens transgênicas de camundongos. Este método permite distinguir divisão celular de variações de ploidia com alta resolução.

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Agradecemos a S. Grünberg (Bonn, Alemanha) e P. Freitag (Bonn, Alemanha) por sua assistência técnica.

<ol><li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Raulf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+systems+for+unequivocal+identification+of+cardiac+myocyte+nuclei+and+analysis+of+cardiomyocyte+cell+cycle+status%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res.Cardiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status.</a> Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).</li>
<li>Field, C. M., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anillin%2C+a+contractile+ring+protein+that+cycles+from+the+nucleus+to+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex.</a> J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).</li>
<li>Hesse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+cell+division+using+high-resolution+imaging+of+M-phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Commun%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle.</a> Nat.Commun. 3, 1076(2012).</li>
<li>Eulalio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+identifies+miRNAs+inducing+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration.</a> Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).</li>
<li>Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+induces+cardiomyocyte+re-entry+in+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle.</a> J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).</li>
<li>Hosoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonality+of+mouse+and+human+cardiomyogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%22%5BJournal%5D)">Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo.</a> Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cardiomyocyte+DNA+synthesis+in+normal+and+injured+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts.</a> Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am.J.Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16889791">Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation.</a> J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Há uma controvérsia sobre se os cardiomiócitos são capazes de reentrar no ciclo celular e dividir após a lesão e durante a homeostase do tecido. Os valores para o volume de base de cardiomiócitos foram dadas no intervalo entre 1% e 1 80% 7. Também após uma lesão cardíaca, a indução da actividade do ciclo celular e a geração de novos cardiomiócitos tem sido relatado na zona de fronteira, com valores entre 0,0083% 8 e 25 - 40% 7.</su...

A correta identificação dos núcleos dos cardiomiócitos e o estado do ciclo celular é de importância crucial para a determinação do volume de negócios do músculo cardíaco e regeneração. Isto é especialmente verdadeiro para a utilização de marcadores nucleares, tal como pHH3, Ki-67, ou análogos de timidina, para identificar actividade do ciclo celular. Como a capacidade proliferativa dos cardiomiócitos de mamíferos adultos é muito pequeno 1, uma falsa identificação de um núcleo positivo para um marcador de proliferação de um núcleo de cardiomiócitos pode fazer uma diferença fundamental no resultado de um ensaio de proliferação. Além disso, os cardiomiócitos são propensos a variações no ciclo celular, tais como a endo-reduplicação e mitose acytokinetic, o que resulta em células poliplóides e multinucleadas em vez de na divisão celular. Para este fim, a interpretação de coloração de anticorpos contra marcadores do ciclo celular comuns não são conclusivas em todos os casos. Aqui, apresentamos métodos para o straight-forwa<html> Rd reconhecimento de cardiomiócitos de rato e a sua nuclearidade em células isoladas nativas e secções de tecido de espessura em fases pós-natal e adulto por a identificação inequívoca dos seus núcleos. Para esse efeito, uma linha de ratinhos transgénicos com expressão específica de cardiomiócitos de uma proteína de fusão que consiste de histona H2B humana e mCherry sob o controlo do promotor Myh6 (Myh6-H2B-MCH) foi usada 2. Cruzamentos esta linha de rato com uma linha de ratinhos indicador de proliferação transgénico, em que a expressão de uma proteína de fusão EGFP-anillin está sob o controlo do promotor de frango actina ubíqua com um intensificador de CMV (CAG-eGFP-anillin), permite a determinação do estado do ciclo celular. A proteína anillin andaime é especificamente expresso em células do ciclo celular activas 3, e a sua localização subcelular diferencial durante o ciclo celular permite a progressão do ciclo celular, o rastreio ao vivo com uma alta resolução de fase MEF &quot;&gt; 4. Por conseguinte, os ratinhos transgénicos dupla pode ser utilizado para discriminar entre proliferantes cardiomiócitos e aqueles que sofrem variações do ciclo celular. Isto prova especialmente úteis no rastreio de substâncias indutoras de proliferação in vitro.

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 10 cm</td><td>Sarstedt</td><td>821472</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; filtro de células m</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Monóxido de 2,3-butanodiona (BDM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>G20x1 &frac12; cânula de injeção, Sterican</td><td>Braun, Melsungen</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>agulha de calibre 20</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>301300</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Becton Dickinson GmbH/Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>2-Metil-butano</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído a 37%</td><td>AppliChem GmbH&nbsp;</td><td>A0936,1000</td><td></td></tr><tr><td>torneira de 3 vias</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>Seringa 16494C</td><td></td></tr> de <tr><td>50 mL</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>8728810F</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Otto Fischar GmbH</td><td>27669</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário conjugado com Alexa-Fluor</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-605-205</td><td></td></tr><tr><td>Alfa-Aktinina EA-53, IgG de camundongo</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de cultura de células, 96 poços, Half Area</td><td>Greiner bio-one</td><td>675986</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Roche</td><td>11088815001</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryostat CM 3050S</td><td>Soro de burro Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno Research, Suffolk, GB</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal para bezerros</td><td>PromoCell,</td> solução de formaldeído Heidelberg <td></td><td></td></tr><tr><td>(4%)</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3697</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína, Tipo A</td><td>Sigma-Aldrich, lamínulas de vidro Steinheim</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>de extensão Glucose Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberger</td><td>IMPROMEDIFORM GmbH</td><td>MF 1833</td><td></td></tr><tr><td>Heparina-Natrium</td><td>Ratiopharm</td><td>5394.02.00</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Lâminas de microscópio Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond</td><td>Marienfeld</td><td>0810000</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (1&nbsp; mg/mL)</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>Becton Dickinson GmbH</td><td>300334</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s ModificadoDulbecco' s Medium (IMDM)</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>21980-032</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Corning</td><td>354221</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG Cy5 (burro)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>tubo de microcentrífuga</td><td>Sarstedt</td><td>72690</td><td></td></tr><tr><td>Mini shaker</td><td>VWR</td><td>12620-940</td><td></td></tr><tr><td>miRNA mirVana mimic, has-miR199a-3p</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>4464066</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Mold</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>M-slide 8-well ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck Millipore</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>negativo controle(RNA embaralhado)</td><td>Ambion/Thermo Fischer Scientific</td><td>AM4611</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Dissociação Cardíaca Neonatal</td><td>Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach</td><td>130-098-373</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit</td><td>Nikoninstruments, D&uuml; sseldorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais, NEAA</td><td>Gibco / Life Technologies, Darmstad</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM, Soro Reduzido Meio</td><td>Gibco</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>P21-siRNA</td><td>Ambion / Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>P27-siRNA</td><td>Ambion / Thermo Fischer Scientific</td><td>4390771</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Gibco/Life Technologies, Darmstadt</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem de álcool polivinílico com DABCO&reg;, antidesvanecimento</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10981</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>1007885</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>recipientes de amostra</td><td>Vitlab</td><td>80731</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>software NIS Elements</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Composto</td><td>Sakura Finetek/ VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>ToPro3 iodeto (642/661)</td><td>Molecular sondas/ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fluka</td><td>93418</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Aglutinina de gérmen de trigo (WGA) Fluoresceína marcada</td><td>Vector Laboratories</td><td>VEC-FL-1021-5</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo &alfa;-actinina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de variações do ciclo celular e determinação de nucleação no pós-natais cardiomyocytes

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Os cardiomiócitos são propensos a variações do ciclo celular, como endoreduplicação (rodadas contínuas de síntese de DNA sem cariocinese e citocinese) e mitose acitocinética (cariocinese, mas sem citocinese). Tais variações atípicas do ciclo celular resultam em células poliplóides e multinucleadas, em vez de divisão celular. Portanto, para determinar a renovação e regeneração cardíaca, é de crucial importância identificar corretamente os núcleos dos cardiomiócitos, o número de núcleos por célula e seu estado no ciclo celular. Isso é especialmente verdadeiro para o uso de marcadores nucleares para identificar a atividade do ciclo celular, como análogos da timidina Ki-67, PCNA ou pHH3. Aqui, apresentamos métodos para reconhecer cardiomiócitos e sua nuclearidade e para determinar sua atividade do ciclo celular. Usamos dois sistemas transgênicos publicados: a linha de camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e a linha de camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular. Combinados, esses dois sistemas facilitam o estudo da regeneração cardíaca e da plasticidade.

De modo a analisar os efeitos dos siRNAs / miARNs sobre a actividade do ciclo celular de cardiomiócitos pós-natal in vitro, os cardiomiócitos de ratos Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin duplo-transgénicos foram isolados no dia pós-natal 3 (P3) e transfectadas com actividade indutora de miR199 5, p27 siRNA, e siRNA Fzr1 ciclo celular. Em comparação com o controlo negativo (Figura 1A), as imagens de miR199- (Figura 1B) e p27- ...

Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a atividade do ciclo celular em cardiomiócitos pós-natais e determinar sua nuclearidade. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de regeneração cardíaca, como por exemplo: um cardiomiócito realmente se divide ou simplesmente aumenta sua ploidia ou se torna multinucleado? As principais vantagens desta técnica são a possibilidade de visualizar a fase M do ciclo celular com alta resolução espaciotemporal e a identificação dos núcleos de cardiomiócitos por fluorescência.Quem demonstrará o procedimento será Patricia Freitag, uma técnica do nosso laboratório. Se forem utilizados pares de cruzamento não homozigóticos, identifique primeiro os corações transgênicos por meio de microscopia fluorescente para verificar a expressão de EGFP analina e H2B-mCherry. Os sinais nucleares de EGFP analina podem ser detectados mais facilmente nas bordas das aurículas, focando através das camadas do tecido.Para isolar os cardiomiócitos, coloque o número apropriado de corações em tubos de reação de 1,5 mililitro contendo um mililitro da mistura enzimática de um kit de dissociação de coração neonatal e corte os corações em pequenos pedaços com tesoura. Em seguida, transfira a solução para tubos de reação de 15 mililitros. Coloque o tubo em posição quase horizontal a 37 graus celsius por 15 minutos, misturando o tecido de cinco a dez vezes com uma pipeta de cinco mililitros ao final da incubação.No final da terceira digestão, interrompa a reação com 7,5 mililitros do meio dois e filtre a suspensão celular através de uma peneira celular de 70 micrômetros. Enxágue a peneira celular com três mililitros do meio dois, reunindo a lavagem com as células coletadas, e recolha as células por centrifugação. Re-suspenda o pellet em 500 microlitros do meio um para contagem.Em seguida, semeie um vezes dez à quarta potência células por poço em 120 microlitros de meio um em uma placa de 96 poços com fundo plano e centrifugue as células antes do cultivo noturno em uma incubadora de cultivo celular. No dia seguinte, a maioria dos cardiomiócitos deverá estar contraindo. Antes de iniciar a transfeção, limpe a bancada e todos os materiais de transfeção com solução de descontaminação de RNAse para remover qualquer RNAse.Quando todos os materiais estiverem prontos, adicione 20 microlitros da mistura de siRNA recém-preparada a cada poço e retorne as células para a estufa por 48 horas. Após dois dias, substitua o sobrenadante de cada poço por 120 microlitros do meio um e retorne as células para a estufa por pelo menos mais 24 horas. Ao final do período de incubação, lave as células uma vez com PBS, seguido de fixação em solução de formaldeído 4% por 20 minutos.Para analisar as células por microscopia confocal em vídeo, transfira a placa para a platina do microscópio confocal e inicie o software de aquisição de imagens. Abra as configurações do A1plus e marque as caixas dos canais um, dois, três e quatro. No menu suspenso, defina o canal um para DAPI, o canal dois para eGFP, o canal três para RFP e o canal quatro para Cy5.Clique na tensão do canal e use as barras deslizantes para ajustar a tensão para 80 em cada canal. Use as barras deslizantes para ajustar o offset a zero e clique no botão de origem para posicionar o pinhole na posição inicial. Defina o tamanho de varredura como 1024 por 1024 pixels no menu suspenso.Clique em "otimizar" para abrir a janela de configuração do tamanho XYZ e marque a caixa de voxel perfeito na etapa sugerida Z. Selecione a objetiva de 20x e ajuste as intensidades do laser até que a imagem não esteja nem subexposta nem superexposta. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, abra o menu de aquisição. Selecione "escanear imagem grande" e, em seguida, escolha "posição atual está no canto superior esquerdo" em área.Em seguida, defina o número de campos em X e Y como três por três e clique em escanear. Para definir o número de núcleos de cardiomiócitos, clique em medir, medição manual e contagens. Selecione os núcleos com sinais de H2B-mCherry, marcando-os e contando-os.Em seguida, selecione as células positivas para alfa-actinina para determinar o número de cardiomiócitos. Para quantificar os cardiomiócitos em fase G1, S e G2 com sinais nucleares de EGFP-analina, selecione medição, medição manual e contagens. Marque os núcleos que expressam EGFP-analina e H2B-mCherry com cliques e conte manualmente os cardiomiócitos com sinais específicos de mitose de EGFP-analina, tais como anéis contráteis e corpos medianos.Em seguida, clique em medir, medição manual e contagens, e clique nos cardiomiócitos com sinais de EGFP analina específicos da mitose, sinais citoplasmáticos, anéis contráteis e corpúsculos médios. Em comparação com os controles negativos, os cardiomiócitos transfectados com miRNA e siRNA demonstram uma indução da atividade do ciclo celular. Os cardiomiócitos que realizam endoreduplicação exibem expressão exclusivamente nuclear de EGFP analina, enquanto os cardiomiócitos que passam pela divisão celular mostram expressão de EGFP analina em localizações típicas da fase M.Após a digestão enzimática do tecido cardíaco no aparelho de Langendorff, os átrios e ventrículos podem ser separados mecanicamente e analisados independentemente, permitindo a visualização de cardiomiócitos ventriculares transgênicos H2B-mCherry com um alto número de cardiomiócitos bi-nucleados positivos para H2B-mCherry. Em contraste, a maioria dos cardiomiócitos atriais é mono-nucleada. A digestão enzimática não resulta em uma população de 100% de células isoladas, revelando um padrão de estriação transversal pela coloração de alfa-actinina, facilitando ainda mais a discriminação entre cardiomiócitos bi-nucleados, que apresentam um padrão contínuo de estriação transversal, e dupletas celulares.Para analisar o índice de binucleação de cardiomiócitos em fatias espessas, é necessário percorrer manualmente a pilha, pois os núcleos nem sempre estão localizados em um único plano Z, sendo que a coloração com aglutinina de trigo permite a detecção das bordas celulares. Reconstruções tridimensionais de fatias fixadas de corações de camundongos transgênicos adultos permitem a detecção e contagem automatizada de ganchos, núcleos corados e positivos para H2B-mCherry, a fim de determinar a proporção de núcleos de cardiomiócitos em condições fisiológicas dentro do tecido. Após dominado, o procedimento de dissociação cardíaca pode ser concluído em duas a três horas, se realizado corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar continuamente para manter a viabilidade das células durante todo o experimento. Após seguir este procedimento, é possível testar microRNAs ou outras substâncias pequenas quanto aos seus efeitos indutores de proliferação em cardiomiócitos pós-natais.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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