Isolamento e Cultura de Neonatais rato Cardiomyocytes

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar cardiomiócitos neonatais de camundongos para uso em ensaios subsequentes. Isso é feito primeiro dissecando os corações de camundongos neonatais e, em seguida, cortando manualmente o tecido cardíaco em pequenos fragmentos. Na segunda etapa, as células cardíacas são dissociadas por meio de uma série de digestões enzimáticas. Em seguida, as células isoladas são plaqueadas, para enriquecer os cardiomiócitos. Por fim, os cardiomiócitos cultivados podem ser observados, aderidos à placa e exibindo comportamento de batimento espontâneo. Em última análise, a localização subcelular de proteínas dentro de células musculares cardíacas transfectadas com construções de expressão eucariótica, pode ser observada por microscopia imunofluorescente.

- A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos é a robustez e reprodutibilidade no isolamento e cultura de cardiomiócitos de camundongos neonatais.

- Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da pesquisa cardiovascular e fornecer informações sobre a biologia celular molecular única das células do músculo cardíaco, como abordar como pequenas moléculas podem influenciar as vias de sinalização cardíaca ou como os estímulos biomecânicos podem afetar a localização, transcrição e expressão de proteínas.

- Devido à natureza versátil das células e culturas de cardiomiócitos resultantes, essa técnica permite muitas aplicações e ensaios a jusante adaptados às necessidades do experimento.

- Antes de iniciar o isolamento do tecido cardíaco, dispense 25 mililitros de PBS livre de cálcio e magnésio, recém-suplementado com 20 milimolares de BDM, em cada um dos dois pratos bacterianos estéreis colocados no gelo. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de isolamento a um tubo cônico estéril de 50 mililitros e coloque no gelo. Agora, esterilize rapidamente a pele de camundongos neonatais de um a três dias com etanol a 75%. Após o sacrifício, abra a cavidade torácica de cada animal, ao longo do esterno, e extraia cada coração com uma tesoura curva estéril. Transfira os corações imediatamente para uma das placas bacterianas contendo PBS, com 20 BDM milimolar. Em seguida, use um par de pinças para espremer suavemente o sangue dos corações e, em seguida, transfira os corações lavados do primeiro prato para o segundo. Em seguida, transfira os corações, mais uma vez, para uma gota de 250 microlitros de meio isolante em um terceiro prato bacteriano. Use uma tesoura curva para picar os corações em pedaços cúbicos de 0,5 a um milímetro e, em seguida, transfira os pedaços picados para um tubo cônico contendo 10 mililitros de meio de isolamento. Incube o tecido cardíaco com agitação suave a quatro graus Celsius durante a noite. Antes de digerir o tecido cardíaco, cubra as placas de cultura de células com solução de colágeno por no mínimo uma hora. Em seguida, remova a solução de colágeno e seque os pratos em uma capa de cultura de células de fluxo laminar estéril. Enquanto os pratos estão secando, confirme se os fragmentos de tecido estão agregados. Em seguida, deixe os fragmentos afundarem no fundo do tubo e remova todos, exceto o último mililitro do sobrenadante. Adicione cinco mililitros de meio de digestão recém-preparado e cinco mililitros de meio L-15, suplementado com 20 milimolares BDM, aos fragmentos de tecido e, em seguida, oxigene a suspensão por um minuto. Sele o tubo e, em seguida, transfira o tecido para um banho-maria a 37 graus Celsius. Após dois minutos, incubar os fragmentos cardíacos em um agitador de 37 graus Celsius, ajustado para não mais que 60 RPM, por 20 a 30 minutos. Em seguida, coloque um filtro de células estéreis em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Umedeça previamente o filtro com 5 mililitros de L-15, complementado com 20 milimolares BDM e, em seguida, use uma pipeta de cultura de células pré-umedecida de 10 mililitros para triturar suavemente os fragmentos de tecido cerca de 10 a 20 vezes. Deixe os fragmentos de tecido maiores sedimentarem e, em seguida, filtre o sobrenadante, contendo as células suspensas, para dentro do tubo. Ressuspenda os fragmentos de tecido não digeridos em cinco mililitros de meio de digestão e, em seguida, incube os fragmentos por mais cinco a 10 minutos, a 37 graus Celsius, com agitação suave. Depois que os fragmentos de tecido estiverem totalmente digeridos, triture suavemente a pasta celular de 10 a 20 vezes e coe a solução através do filtro, no tubo cônico contendo as células da primeira digestão. Enxágue o filtro de células com cinco mililitros do meio suplementado com L-15, com BDM 20 milimolares e, em seguida, gire os cardiomiócitos suspensos por cinco minutos, a 50 a 100 vezes G, em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio de revestimento. Em seguida, incube as células em uma placa de cultura de células de 10 centímetros, em uma incubadora de cultura de células, para remover quaisquer fibroblastos e células endoteliais. Após uma a três horas, ressuspenda os cardiomiócitos não aderentes, pipetando repetidamente o meio de plaqueamento sobre o prato e, em seguida, transfira as células ressuspensas para um novo tubo cônico. Depois de contar as células, coloque-as nas placas de cultura de células revestidas de colágeno com uma densidade de aproximadamente 1,5 vezes 10 elevado a cinco células por centímetro quadrado. Em seguida, incubar as placas, sem perturbação, por 12 a 18 horas, para a aderência e disseminação dos cardiomiócitos. Um dia após o plaqueamento, os cardiomiócitos devem aderir à placa de cultura de células e começar a se contrair espontaneamente. Depois de confirmar a aderência e a contração, pré-aqueça o meio de manutenção recém-preparado em banho-maria a 37 graus Celsius e, em seguida, substitua o meio de revestimento pelo meio de manutenção aquecido, para remover quaisquer células mortas da cultura. Por fim, cultive os cardiomiócitos por mais um a cinco dias, trocando o meio conforme necessário. Esta primeira imagem mostra cardiomiócitos de camundongos neonatais isolados no início da etapa de pré-plaqueamento. Após uma a três horas, os fibroblastos cardíacos e as células endoteliais começam a aderir à placa de cultura de células não revestida. Após a ressuspensão dos cardiomiócitos não aderentes, os fibroblastos cardíacos remanescentes e as células endoteliais podem ser cultivados posteriormente, se desejado. Nesta imagem, podem ser observados cardiomiócitos de camundongos neonatais isolados e purificados, plaqueados nas placas de cultura de células revestidas de colágeno. Conforme demonstrado após 18 horas em cultura, os cardiomiócitos aderem às placas revestidas. Aqui, é mostrada uma imagem imunofluorescente representativa de cardiomiócitos de camundongos neonatais, corados com anticorpos contra miomesina em vermelho e beta-catenina em verde. Finalmente, esta imagem imunofluorescente é de cardiomiócitos de camundongos neonatais transfectados, com a proteína marcada com GFP expressa em verde e alfa actinina em vermelho.

- Após este procedimento, outros métodos como transfecção de cardiomiócitos, tratamento com inibidores ou ativadores de pequenas moléculas ou análises biomecânicas imunofluorescentes podem ser realizados, a fim de obter informações sobre a biologia celular mollecular dos cardiomiócitos e suas propriedades biomecânicas.

- A adaptação deste procedimento de isolamento para cardiomiócitos de camundongos neonatais abriu caminho para pesquisadores que trabalharam com camundongos knock-in ou knock-out geneticamente modificados, para explorar o comportamento dessas células em um ambiente de cultura de células facilmente controlado, especialmente ao trabalhar com sistemas modelo que têm uma patologia cardíaca pós-natal.