Ambiente Microfluidic controlada de Investigação dinâmico de Agregação Glóbulo Vermelho

O objetivo geral deste procedimento é quantificar diretamente os agregados de glóbulos vermelhos na microcirculação, dinamicamente sob taxas de cisalhamento controladas e constantes. Isso é feito primeiro no treinamento, suspensões de glóbulos vermelhos e um microcanal duplo em y com uma solução salina tampão fosfato, criando uma alegria constante na camada de sangue. O segundo passo é visualizar e registrar o fluxo com uma câmera de alta velocidade.

Em seguida, use técnicas de processamento de imagem para processar a gravação e obter um tamanho agregado médio e a distribuição do tamanho agregado no microcanal. A etapa final é determinar a velocidade do sangue seguindo o deslocamento das partículas fluorescentes injetadas no microcanal entre dois quadros consecutivos. Em última análise, a taxa de cisalhamento no microcanal é calculada com base na velocidade do sangue e na espessura da camada de sangue para relacionar os tamanhos agregados com a taxa de cisalhamento local correspondente.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o método de transmissão de luz, é que os agregados de glóbulos vermelhos são analisados dinamicamente no fluxo de compartilhamento microscópico, em oposição a estatisticamente com outras técnicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo hemorradiológico, como entender as condições de formação de agregados de glóbulos vermelhos e encontrar o comportamento radiológico do sangue na microcirculação. Para começar a fabricar microcanais, 120 mícrons de largura, 60 mícrons de altura e sete milímetros de comprimento de acordo com métodos fotolitográficos padrão.

Em seguida, colete células sanguíneas de doadores voluntários saudáveis e prepare suspensões de glóbulos vermelhos com níveis de hematócrito de cinco, 10 e 15%, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, combine um mililitro de cada suspensão de glóbulos vermelhos com 60 microlitros de uma solução a 1% contendo partículas traçadoras fluorescentes. Agite suavemente o tubo para misturar a solução. Combine também o mesmo volume de partículas traçadoras a um mililitro de PBS a um pH de 7,4.

Coloque uma seringa de vidro de 25 microlitros com a solução traçadora contendo glóbulos vermelhos e uma seringa de vidro de 100 microlitros. Com a solução traçadora em PBS, certifique-se de que não haja bolhas presentes no sistema. Em seguida, coloque o microcanal em uma platina de microscópio invertida conectada a uma câmera de alta velocidade capaz de gravar 18 quadros por segundo ou mais e a um sistema de velocimetria de imagem de micropartículas.

Conecte cada seringa via tubo a uma das portas de entrada do canal microfluídico e, em seguida, carregue-as no suporte da mesma bomba de seringa. Programe a bomba de seringa para dispensar a seringa de 25 microlitros a uma taxa de dois microlitros por hora. Isso também dispensará a seringa de 100 microlitros a quatro vezes essa taxa devido à diferença de tamanho.

Altere a taxa de fluxo entre os experimentos para testar diferentes taxas de cisalhamento. Use um ridículo de calibração com a lente 20 x no lugar para calibrar a câmera de alta velocidade. Em seguida, inicie a bomba para começar a dispensar as duas soluções no microcanal.

Determine uma exposição ideal da câmera. Tempo para imagens nítidas dos agregados. É importante esperar que o fluxo atinja o estado estacionário antes de adquirir qualquer medição.

Se o estado estacionário agora é atingido dentro de três a cinco minutos. Reabasteça a seringa para educar a mistura e mantenha os glóbulos vermelhos em suspensão. Assim que o fluxo em estado estacionário for alcançado, comece a registrar o movimento dos glóbulos vermelhos.

Registre o fluxo por sete segundos. Usando um programa capaz de processamento de imagem, aprimore o contraste para cada imagem em escala de cinza tirada usando o método do equalizador de histograma. Em seguida, converta as imagens em escala de cinza em imagens binárias.

Defina cuidadosamente o valor limite testando vários valores e escolhendo o valor para o qual todos os agregados são detectados corretamente. Se necessário, preencha os orifícios correspondentes às lacunas dentro de um agregado. Em seguida, detecte as células determinando pixels brancos vizinhos na imagem binária para que as células adjacentes sejam contabilizadas como agregados.

Rotule os diferentes agregados de glóbulos vermelhos detectados e, em seguida, converta a imagem binária em uma imagem vermelha, verde e azul para melhor visualização. Por fim, sobreponha a imagem vermelha, verde e azul à imagem original. Para verificar a eficiência do processamento da imagem, calcule a área de cada agregado detectado no quadro com base no número de pixels detectados.

Processe todos os quadros da mesma maneira. Em seguida, calcule a média dos tamanhos agregados detectados em cada quadro e, em seguida, os resultados de todos os quadros. Para obter o tamanho agregado médio para cada registro dos motores de suspensões de glóbulos vermelhos, converta os resultados em micrômetros quadrados usando a imagem ridícula.

Em seguida, calcule a área de um glóbulo vermelho para determinar um representante. Número estimado de glóbulos vermelhos dentro de cada agregado detectado assim que os dados são adquiridos. Usando a câmera de alta velocidade, mude para a câmera de pulso duplo usada para o sistema de velocimetria de imagem de micropartículas.

Use um software de imagem como o mostrado aqui para aquisição de imagem do fluxo e o processamento de imagem para determinação do campo de velocidade. Certifique-se de colocar óculos de proteção e, em seguida, ligue o sistema de laser e a câmera. Coloque um micrômetro sob o microscópio e use a imagem resultante para calibrar o sistema.

Em seguida, inicie o fluxo de fluido e visualize as partículas em ambos os fluidos. Encontre o plano intermediário do microcanal concentrando-se nas partículas mais rápidas e brilhantes do fluxo. Em seguida, defina o intervalo de tempo entre os quadros para cerca de dois milissegundos para que as partículas mais rápidas se movam de cinco a 10 pixels entre as duas imagens e comecem a registrar o fluxo O.Configure o software para adquirir 100 pares de imagens para todas as diferentes suspensões de glóbulos vermelhos e para diferentes taxas de cisalhamento.

Após o pré-processamento da imagem. Escolha o tamanho e a forma da janela de correlação, bem como a porcentagem de imagens sobrepostas. Expresse os resultados como um campo de velocidade média calculado a partir dos 100 pares de imagens e da raiz do erro quadrático médio na velocidade.

Desligue a câmera a laser e o computador. Depois que todas as medições e processamento de imagem forem realizados, calcule a taxa absoluta detectando e estimando primeiro a espessura do sangue no microcanal com base na gravação da câmera de alta velocidade. Para isso, calcule a média de todos os quadros da gravação específica para obter uma imagem de fundo do vídeo.

Finalmente, delit a camada de sangue inspecionando visualmente a imagem média de todos os quadros e detecte manualmente a borda da camada de sangue. Em seguida, obtenha o valor da velocidade para a espessura da camada de sangue correspondente manualmente a partir do perfil de velocidade extraído e calcule a taxa de cisalhamento dividindo o valor da velocidade pela camada de sangue. A espessura mostrada aqui são os movimentos líquidos de quatro agregados de glóbulos vermelhos que foram detectados em três quadros consecutivos.

Os grandes agregados de mais de 30 células são mostrados em vermelho. Os agregados médios entre nove e 30 células são mostrados em verde, e pequenos agregados de menos de nove células são mostrados em azul. A velocidade de um agregado varia de acordo com sua posição no microcanal mostrado.

Aqui estão os perfis de velocidade dos glóbulos vermelhos suspensos em 5% de hematócrito, 10% de hematócrito e 15% de hematócrito a uma taxa de fluxo de 10 microlitros por hora. Você pode ver a velocidade em direção a zero em ambas as bordas, conforme esperado, e o ponto de inflexão entre as duas correntes de fluxo varia ligeiramente entre os níveis de hematócrito à medida que a taxa de cisalhamento geral aumenta o tamanho dos agregados em cada nível de hematócrito cai. Isso se deve à força absoluta no microcanal que excede a força de agregação, fazendo com que os glóbulos vermelhos se desagreguem.

Ao participar deste procedimento, é importante lembrar de garantir uma boa qualidade de imagem do fluxo no microcanal e garantir um contraste entre os glóbulos vermelhos que fluem e o fundo da imagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como analisar qualitativa e quantitativamente os agregados de glóbulos vermelhos sob condições de fluxo controladas.