Ambiente Microfluidic controlada de Investigação dinâmico de Agregação Glóbulo Vermelho

O objetivo geral deste procedimento é quantificar diretamente agregados de hemácias na microcirculação, de forma dinâmica e sob taxas de cisalhamento controladas e constantes. Isso é realizado inicialmente com o treinamento de suspensões de hemácias e um microcanal em duplo Y com uma solução de tampão salino fosfato, criando um cisalhamento constante na camada sanguínea. O segundo passo é visualizar e registrar o fluxo com uma câmera de alta velocidade.

Em seguida, utilize técnicas de processamento de imagem para processar a gravação e obter um tamanho médio dos agregados e a distribuição do tamanho dos agregados no microcanal. O passo final é determinar a velocidade do sangue acompanhando o deslocamento de partículas fluorescentes injetadas no microcanal entre dois quadros consecutivos. Por fim, a taxa de cisalhamento no microcanal é calculada com base na velocidade do sangue e na espessura da camada sanguínea, a fim de relacionar os tamanhos dos agregados à taxa de cisalhamento local correspondente.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o método de transmissão de luz, é que os agregados de glóbulos vermelhos são analisados dinamicamente no fluxo microscópico ao invés de estatisticamente com outras técnicas. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da hemorreatologia, como compreender as condições de formação dos agregados de glóbulos vermelhos e determinar o comportamento reatológico do sangue na microcirculação. Para começar, fabrique microcanais com 120 µm de largura, 60 µm de altura e sete milímetros de comprimento, de acordo com métodos padrão de fotolitografia.

Em seguida, colete células sanguíneas de doadores voluntários saudáveis e prepare suspensões de hemácias com níveis de hematócrito de 5, 10 e 15%, conforme descrito no protocolo textual complementar. Combine um mililitro de cada suspensão de hemácias com 60 microlitros de uma solução a 1% contendo partículas traçadoras fluorescentes. Agite suavemente o tubo para misturar a solução. Também combine o mesmo volume de partículas traçadoras com um mililitro de PBS em pH 7,4.

Carregue uma seringa de vidro de 25 microlitros com a solução traçadora contendo hemácias e uma seringa de vidro de 100 microlitros. Com a solução traçadora em PBS, certifique-se de que não haja bolhas presentes no sistema. Em seguida, coloque o microcanal sobre a platina de um microscópio invertido conectado a uma câmera de alta velocidade capaz de gravar 18 quadros por segundo ou mais, e a um sistema de velocimetria por imagem de micropartículas.

Conecte cada seringa por meio de tubos a uma das portas de entrada do canal microfluídico e, em seguida, carregue-as no suporte da mesma bomba de seringa. Programe a bomba de seringa para dispensar a seringa de 25 microlitros a uma taxa de dois microlitros por hora. Isso também dispensará a seringa de 100 microlitros a quatro vezes essa taxa, devido à diferença de tamanho.

Altere a taxa de fluxo entre experimentos para testar diferentes taxas de cisalhamento. Utilize um padrão de calibração com a lente de 20 x posicionada para calibrar a câmera de alta velocidade. Em seguida, inicie a bomba para começar a dispensar as duas soluções no microcanal.

Determine uma exposição ideal da câmera. Tempo necessário para obter imagens nítidas dos agregados. É importante aguardar até que o fluxo atinja o estado estacionário antes de realizar qualquer medição.

Se o estado estacionário for atingido em três a cinco minutos. Reencha a seringa para homogeneizar a mistura e manter os glóbulos vermelhos em suspensão. Uma vez atingido o fluxo em estado estacionário, comece a registrar o movimento dos glóbulos vermelhos.

Registre o fluxo por sete segundos. Utilizando um programa capaz de processamento de imagens, realce o contraste de cada imagem em escala de cinza obtida pelo método de equalização de histograma. Em seguida, converta as imagens em escala de cinza em imagens binárias.

Defina cuidadosamente o valor de limiar testando vários valores e escolhendo aquele em que todos os agregados são adequadamente detectados. Se necessário, preencha os buracos correspondentes aos espaços dentro de um agregado. Em seguida, detecte as células determinando os pixels brancos vizinhos na imagem binária, de modo que células adjacentes sejam consideradas como agregados.

Rotule os diferentes agregados de glóbulos vermelhos detectados e, em seguida, converta a imagem binária em uma imagem em cores vermelho, verde e azul para melhor visualização. Por fim, sobreponha a imagem em vermelho, verde e azul à imagem original. Para verificar a eficiência do processamento de imagem, calcule a área de cada agregado detectado no quadro com base no número de pixels detectados.

Processe todos os quadros da mesma maneira. Em seguida, calcule o tamanho médio dos agregados detectados em cada quadro e, depois, os resultados de todos os quadros. Para obter o tamanho médio dos agregados para cada gravação das suspensões de hemácias, converta os resultados em micrômetros quadrados utilizando a imagem de referência.

Em seguida, calcule a área de um glóbulo vermelho para determinar um valor representativo. Número estimado de glóbulos vermelhos dentro de cada agregado detectado, uma vez que os dados forem adquiridos. Usando a câmera de alta velocidade, mude para a câmera com duplo pulso utilizada no sistema de velocimetria por imagem de micropartículas.

Utilize um software de imagem como o mostrado aqui para a aquisição de imagens do fluxo e o processamento de imagens para a determinação do campo de velocidade. Certifique-se de usar proteção ocular e, em seguida, ligue o sistema a laser e a câmera. Coloque um micrômetro sob o microscópio e use a imagem resultante para calibrar o sistema.

Em seguida, inicie o fluxo do fluido e visualize as partículas em ambos os fluidos. Encontre o plano médio do microcanal focalizando nas partículas mais rápidas e mais brilhantes do fluxo. A seguir, ajuste o intervalo de tempo entre quadros em cerca de dois milissegundos, de modo que as partículas mais rápidas se desloquem de cinco a dez pixels entre as duas imagens, e comece a gravar o fluxo O. Configure o software para adquirir 100 pares de imagens para todas as diferentes suspensões de hemácias e para diferentes taxas de cisalhamento.

Após o pré-processamento da imagem. Escolha o tamanho e a forma da janela de correlação, bem como a porcentagem de sobreposição das imagens. Expresse os resultados como um campo de velocidade média calculado a partir dos 100 pares de imagens e o erro quadrático médio na velocidade.

Desligue a câmera a laser e o computador. Após todas as medições e o processamento de imagem terem sido realizados, calcule então a taxa de cisalhamento detectando e estimando primeiro a espessura do sangue no microcanal com base na gravação da câmera de alta velocidade. Para esse fim, faça a média de todos os quadros da gravação específica para obter uma imagem de fundo do vídeo.

Por fim, delimite a camada de sangue inspecionando visualmente a imagem média de todos os quadros e detecte manualmente a borda da camada de sangue. Em seguida, obtenha o valor de velocidade correspondente à espessura da camada de sangue a partir do perfil de velocidade extraído e calcule a taxa de cisalhamento dividindo o valor de velocidade pela espessura da camada de sangue. As espessuras mostradas aqui correspondem aos movimentos líquidos de quatro agregados de hemácias detectados em três quadros consecutivos.

Os grandes agregados com mais de 30 células são mostrados em vermelho. Os agregados médios, entre nove e 30 células, são mostrados em verde, e os agregados pequenos, com menos de nove células, são mostrados em azul. A velocidade de um agregado varia conforme sua posição no microcanal mostrado.

Aqui estão os perfis de velocidade das hemácias suspensas em 5% de hematócrito, 10% de hematócrito e 15% de hematócrito, com uma vazão de 10 microlitros por hora. Pode-se observar que a velocidade tende a zero nas duas bordas, como esperado, e o ponto de inflexão entre os dois fluxos varia ligeiramente entre os níveis de hematócrito, à medida que a taxa de cisalhamento global aumenta, o tamanho dos agregados em cada nível de hematócrito diminui. Isso ocorre porque a força de cisalhamento no microcanal excede a força de agregação, fazendo com que as hemácias se desagreguem.

Ao acompanhar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir uma boa qualidade de imagem do fluxo no microcanal e assegurar um contraste entre as hemácias em movimento e o fundo da imagem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar qualitativa e quantitativamente agregados de hemácias sob condições controladas de fluxo.