Adesão e agregação plaquetária sob fluxo usando células de fluxo microfluídicos

O sistema de biofluxo é um instrumento automatizado e um dispositivo microfluídico para executar ensaios de células vivas sob fluxo puro controlado. Este sistema usa tecnologia microfluídica de placa de poço para integrar dispositivos de célula de fluxo em escala de mícron em placas de poço padrão SBS. O BioFlex pode ser usado para realizar estudos de adesão e agregação plaquetária com alto rendimento e volumes sanguíneos reduzidos.

O sangue total marcado com corante fluorescente é adicionado aos poços e depois flui pelos canais. Sob fluxo puro controlado, são produzidos dados de microscopia de alta resolução, que quantificam a adesão e agregação plaquetária na presença de compostos de drogas e outros parâmetros variados. Olá, sou Mike Schwartz, do laboratório de RD da Flexion Biosciences.

Hoje mostraremos um procedimento para o uso de células de fluxo microfluídico em ensaios de adesão plaquetária. Usamos este protocolo em nosso laboratório para uma variedade de ensaios de biologia vascular. Então vamos começar.

Carne bovina, antes de executar o experimento de célula de fluxo, os canais microfluídicos da placa de biofluxo devem ser preparados com um revestimento de proteína de interesse colágeno que será usado neste experimento. Cada um dos 24 canais experimentais da placa de biofluxo se conecta a um poço de entrada e a um poço de saída para esta placa. O poço de entrada é o poço esquerdo que alimenta o canal e o poço de saída está à direita, dilua o estoque de colágeno até uma concentração de 200 microgramas por mililitro.

Em ácido acético molar 0,02, serão necessários 20 microlitros para cada canal usado. Como esse experimento requer 11 canais, faça 200 microlitros de revestimento de colágeno. Um canal permanece sem revestimento misturado por iteração suave com uma micro ponta de pipeta.

Adicione 20 microlitros de revestimento a cada canal respectivo usando uma micropipeta para dispensar o líquido no punção interno do poço. Alimentando o canal microfluídico de interesse, como mostrado aqui, com o corante amarelo, inclua um canal sem colágeno como controle negativo para adesão e agregação plaquetária. Depois que o revestimento de colágeno for adicionado a todos os respectivos canais, conecte a interface à placa.

Se você estiver usando a interface bio flux 1000, poderá prender as duas travas no palco. Se você estiver usando o primeiro dedo da interface Bio flux 200, aperte os quatro parafusos. E então, quando tudo estiver pronto, use o driver de torque para apertar completamente.

O driver de torque clicará quando atingir o máximo. Usando o modo manual no software de biofluxo, aplique perfusão nos canais de interesse a 2D por centímetro quadrado da saída. Bem, use uma objetiva de baixa potência em um microscópio para encontrar bem a entrada e observe o punção interno oposto sendo preenchido com líquido.

Você deve primeiro ver um minúsculo líquido Incube a placa em temperatura ambiente por uma hora. Durante este período de incubação, você pode começar a preparar o sangue total no final da incubação de uma hora.

Uma vez que o sangue tenha sido preparado, remova a interface e adicione um mililitro de PBS mais íons de cálcio e magnésio à saída. Bem, comece a profusão do poço de saída a dois jantares por centímetro quadrado e continue a profusão por 10 minutos. Após 10 minutos, pare a profusão Depois de remover a interface, remova o excesso de PBS dos poços de entrada e saída.

Nunca remova o líquido que preenche o punção interno. Para bloquear os canais, adicione um mililitro de solução de bloqueio a cada tomada. Bem para ser usado perfundir a partir da saída bem a dois jantar por centímetro quadrado e continuar a perfusão por 10 minutos.

Pare a profusão após 10 minutos e remova a interface. Os canais agora estão prontos e podem ser usados durante todo o dia enquanto a placa está sendo revestida com colágeno. Durante uma incubação de uma hora, o sangue humano fresco de um indivíduo em jejum deve ser preparado para imagens e escorrer para a placa.

O sangue deve ser coletado em citrato de sódio, anticoagulante e usado dentro de três horas após a coleta. Primeiro, adicione um estoque de quatro milimolares de cálcio M em DMSO ao sangue em uma diluição de um a 1000 volume por volume. Para obter quatro micromolares de cálcio sou misturado por inversão suave.

Em seguida, dispense um mililitro do sangue marcado com cálcio em dez microtubos de um vírgula cinco mililitros. Adicionar o anticorpo inibidor de GP dois B três a a cada tubo na diluição desejada. Certifique-se de incluir um controle negativo de anticorpos sem anticorpos e um controle positivo de anticorpos não relacionados misturados por inversão suave.

Incube os tubos à temperatura ambiente por uma hora misturando por inversão suave a cada 10 minutos antes de executar o experimento da célula de fluxo. Um protocolo automatizado deve ser configurado no módulo de controle de biofluxo para colágeno. Um. Estabeleça um protocolo para fazer o sangue correr a dez e nove centímetros quadrados por 10 minutos a partir da saída.

Bem, deve-se configurar os parâmetros de aquisição de dados da estação de trabalho BioFlex 1000, que incluem a aquisição de posições de estágio desejadas no comprimento de onda fitz e na configuração de lapso de tempo. Um plano típico de aquisição de imagem para este protocolo compreenderia um campo de visão por canal a ser capturado usando uma objetiva de 10 x a cada 30 segundos durante uma duração total de 10 minutos. Campos de visão adicionais e configurações alternativas de TimeLapse também são possíveis.

Uma vez que o protocolo automatizado e os parâmetros de aquisição de dados tenham sido configurados, retorne à placa BioFlex e remova o líquido em ambos os lados do canal, exceto os punções internos. Tomando cuidado para trabalhar rapidamente, coloque 500 microlitros de sangue de cada condição nos poços de saída de cada canal. Observe que os poços de saída estão sendo usados para fornecer o sangue porque é o caminho mais curto para a zona de visualização e fornecerá uma reação mais imediata do sangue ao revestimento de colágeno.

Além disso, coloque o sangue de controle sem anticorpos em um canal revestido com colágeno e outro que está apenas bloqueado. Coloque a placa no microscópio da estação de trabalho BioFlex 1000 e prenda a interface. Execute a calibração da lista de estágios localizando o primeiro ponto de calibração definido como origem.

Em seguida, localize e marque o segundo ponto de calibração. Aplique esta calibração à lista de estágios apropriada. Isso garante que todos os locais de visualização na placa possam ser encontrados automaticamente.

Mova a platina para um dos canais contendo ajuste de sangue e parâmetros de captura de imagem, como tempo de exposição e ganho no software de montagem BioFlex. Inicie o fluxo de trabalho apropriado clicando no botão desejado. Isso iniciará o protocolo de fluxo e a aquisição de imagem simultaneamente.

Ao final do experimento, retire a placa da estação de trabalho BIOFLU 1000 e descarte-a de acordo com as diretrizes institucionais. Usando canais microfluídicos revestidos de colágeno do sistema de biofluxo. A formação agressiva de trombos é observada ao longo do tempo com a amostra de sangue controle não tratada.

Em contraste, nenhuma formação de trombo é observada com o canal não revestido. Em um experimento realizado recentemente, o tamanho médio dos agregados sob condições de controle foi de 2000 micrômetros quadrados. GP dois B três A é um potente mediador das interações plaquetárias e estabilização da agregação quando ativado pela adesão ao colágeno, como mostrado aqui após a incubação com anti GB dois B três um anticorpo por uma hora antes da exposição pura, uma diminuição no tamanho dos trombos, bem como uma diminuição na frequência de formação de trombos é observada.

Uma resposta dependente da dose pode ser observada tipicamente em dez e nove centímetros quadrados e o valor IC 50 para este inibidor em particular foi de 17 nanomolares. A inibição máxima para este doador em comparação com o controle sem anticorpos foi de 11% a 10 centímetros quadrados de dia. Uma placa de cisalhamento de 48 poços de altura também está disponível para a execução de experimentos de sangue total de até 200 D por centímetro quadrado ou 5.000 segundos inversos.

Acabamos de mostrar como usar canais de fluxo microfluídico para conduzir experimentos de biologia vascular fisiologicamente relevantes. Ao fazer este protocolo, é importante lembrar de diluir o colágeno no tampão correto. Sempre use a técnica de pipetagem correta para evitar a introdução de bolhas de ar e sempre siga os regulamentos de biossegurança do seu laboratório.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.