Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco neurais da região paraventricular da medula espinhal de rato adulto ou humana. Isso é realizado primeiramente por meio da coleta da medula espinhal por laminectomia. O segundo passo consiste em cortar a medula espinhal transversalmente em segmentos de um centímetro e dissecar a região paraventricular de cada segmento da medula espinhal.

Em seguida, o tecido picado é cortado em pedaços de um milímetro e então dissociado enzimaticamente. O passo final é separar células intactas por centrifugação através de um gradiente de densidade descontínuo e semear a suspensão celular. Por fim, a formação de neuroesferas e o crescimento de células-tronco neurais podem ser avaliados por microscopia de imunofluorescência.

Hoje vou demonstrar como isolar células-tronco neurais da região paraventricular da medula espinhal de rato adulto. Essas células podem então ser usadas para ajudar a responder perguntas fundamentais no campo das células-tronco neurais, como quais fatores exógenos promovem a restrição de linhagem ou como essas células respondem a diversos estímulos ou estresses. Para começar, prepare o cultivo, os meios e os tampones de dissecação conforme descrito no protocolo textual complementar.

Em seguida, após uma overdose de anestésico, esterilize a pele da rata e use tesouras grandes de dissecação para remover a superfície dorsal, expondo a coluna vertebral. Mantenha as tesouras de dissecação perpendiculares à superfície dorsal e realize um corte transversal. Corte a coluna vertebral acima dos membros posteriores.

Em seguida, utilize tesouras menores para cortar longitudinalmente o músculo dorsal que recobre a coluna vertebral em direção rostral, expondo as apófises espinhosas a partir da extremidade do coccix exposta. Insira um pequeno instrumento rombo de corte ósseo extraoralmente no aspecto lateral do canal espinhal, no espaço entre a medula espinhal e a coluna vertebral. Posicione a lâmina superficialmente e paralelamente à medula.

Em seguida, faça pequenos cortes na lâmina e retire cuidadosamente a lâmina para expor a medula espinhal. Esse ângulo evita danos à medula espinhal subjacente. Continue removendo a lâmina na direção rostral.

Para expor a medula espinhal torácica e cervical usando pinças de dissecação rombas, levante suavemente a medula espinhal da coluna vertebral e corte as raízes com tesoura microcirúrgica. Para liberar a medula, coloque a medula espinhal ressecada em uma placa de Petri contendo tampão de dissecação para rato estéril e gelado. Lave o tecido com o tampão de dissecação gelado e use tesoura para cortar transversalmente a medula espinhal em segmentos de um centímetro. Para cada segmento de tecido, use pinças finas para segurar o tecido com uma mão e, com a outra mão, use tesoura microcirúrgica para remover cuidadosamente a substância branca junto com a maior parte da substância cinzenta, deixando somente a região periventricular da medula espinhal.

Puxe o tecido periventricular dissecado para uma placa de Petri estéril de 10 centímetros contendo tampão de dissecção para rato gelado. Para iniciar o isolamento de células-tronco neurais de rato, use tesoura microcirúrgica para picar o tecido periventricular dissecado em pedaços de um milímetro cúbico. Em seguida, prepare o tampão de dissociação enzimática adicionando primeiro cinco mililitros de solução salina equilibrada de Earl a um frasco de papaína de um kit de dissociação com papaína.

Coloque o frasco a 37 graus Celsius durante 10 minutos para que a papaína se dissolva completamente e a solução fique transparente. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução salina balanceada de Earl ao frasco contendo o DNA do kit de dissociação. Após misturar suavemente, adicione 250 microlitros da solução de DNA ao frasco contendo papaína e misture suavemente.

Em seguida, adicione o tecido picado, aproximadamente 0,2 gramas, ao frasco e coloque o frasco em uma plataforma agitadora a 37 graus Celsius por 45 minutos a uma hora. Após a incubação, pipete a mistura com uma pipeta de 10 mililitros para dissociar quaisquer fragmentos de tecido remanescentes, obtendo uma suspensão celular turva. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e centrifugue a 300 Gs por cinco minutos.

À temperatura ambiente durante a centrifugação, prepare a solução de OVO moid misturando 2,7 mililitros de solução salina balanceada de Earl com 300 microlitros da solução reconstituída de inibidor de albumina OVO MOID. Em um tubo cônico de 15 mililitros, adicione 150 microlitros da solução de DNA previamente preparada à solução de oval moid e misture invertendo o tubo, descarte o sobrenadante das células em pellet e ressuspenda imediatamente o pellet celular na mistura diluída de inibidor de DNA e albumina. Em seguida, prepare um gradiente de densidade descontínuo adicionando cinco mililitros de solução de inibidor de albumina a um tubo de 15 mililitros e, usando uma pipeta de cinco mililitros, sobreponha suave e lentamente a suspensão celular à solução de inibidor de albumina.

Centrifugue a amostra a 70 ×g durante seis minutos à temperatura ambiente. Após a conclusão, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio EFH pré-aquecido para ratos, preparado conforme descrito no protocolo textual complementar. Conte a densidade de células viáveis com um hemocitômetro e plaque as células em um frasco de cultura T25 numa densidade de 10 células por microlitro em EFH.

Incube os frascos a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e deixe os cultivos crescerem sem perturbação por uma semana para evitar a agregação de esferoides. É mostrada aqui uma seção transversal da medula espinhal de rato que foi corada com azul de luxol rápido, bem como hematina e eosina para evidenciar os limites entre a substância branca e a cinzenta. O contorno pontilhado indica o tecido periventricular remanescente dissecado que foi isolado neste protocolo a partir desta região.

Neuroesferas como as mostradas aqui crescerão em suspensão, livres, em cultura com alta magnificação. Microspículas podem ser vistas protrudindo das neuroesferas, que proliferam conforme demonstrado pela coloração positiva para KI 67, na qual as neuroesferas foram dissociadas e semeadas em poços revestidos com Matrigel. Além disso, elas expressarão principalmente nestina, que é um marcador para células precursoras neurais.

Após este procedimento, fatores exógenos podem ser adicionados às células cultivadas para promover a diferenciação. As células-tronco neurais adultas ou sua progênie também podem ser transplantadas em diversos modelos animais para avaliar sua capacidade de reparo regenerativo. Espero que este vídeo seja útil e desejo boa sorte em seus experimentos.