Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

O objetivo geral deste procedimento é isolar células-tronco neurais da região paraventricular do rato adulto ou da medula espinhal humana. Isso é feito primeiro colhendo a medula espinhal por meio de laminectomia. O segundo passo é cortar a medula espinhal transversalmente em segmentos de um centímetro e dissecar a região paraventricular de cada segmento da medula espinhal.

Em seguida, o tecido picado é cortado em pedaços de um milímetro e, em seguida, dissociado enzimaticamente. A etapa final é separar as células intactas por centrifugação através de um gradiente de densidade descontínuo e colocar a suspensão da célula. Em última análise, a formação de neuroesferas e o crescimento de células-tronco neuro podem ser avaliados usando microscopia de imunofluorescência.

Hoje vou demonstrar como isolar células-tronco neurais da região paraventricular da medula espinhal de ratos adultos. Essas células podem então ser usadas para ajudar a responder a perguntas-chave no campo das células-tronco neurais, como quais fatores exógenos promovem a restrição da linhagem ou como essas células respondem a vários estímulos ou estresse. Para começar, prepare os buffers de cultura, mídia e dissecação conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Em seguida, após uma overdose de anestésico, esterilize a pele do rato e use uma grande tesoura de dissecção para remover a superfície dorsal, expondo a coluna vertebral. Segure a tesoura de dissecção perpendicular à superfície dorsal e transversalmente. Corte a coluna vertebral acima dos membros posteriores.

Em seguida, use uma tesoura menor para cortar longitudinalmente o músculo dorsal que cobre a coluna vertebral em uma direção rostral para expor os processos espinhosos começando na extremidade exposta do mimo. Insira um pequeno instrumento de corte ósseo rombudo extraoralmente no aspecto lateral do canal espinhal no espaço entre a medula espinhal e a coluna vertebral. Coloque a lâmina rasa e paralela ao cabo.

Em seguida, faça pequenos cortes na lâmina e retire cuidadosamente a lâmina para expor a medula espinhal. Este ângulo evita danos à medula espinhal subjacente. Continue a remover a lâmina na direção rostral.

Para expor a medula espinhal torácica e cervical usando uma pinça de tecido rombudo, levante suavemente a medula espinhal da coluna vertebral e corte as raízes com uma microtesoura Para liberar o cordão, coloque a medula espinhal excisada em uma placa de Petri contendo tampão de dissecção de rato estéril e gelado. Enxágue o tecido com o tampão de dissecação gelado e use uma tesoura para cortar a medula espinhal transversalmente em segmentos de um centímetro. Para cada segmento de tecido, use uma pinça fina para segurar o tecido com uma mão e, com a outra mão, use uma microtesoura para remover cuidadosamente a substância branca junto com a maior parte da substância cinzenta, deixando apenas a região periventricular da medula espinhal.

Puxe o tecido periventricular dissecado para uma placa de Petri estéril de 10 centímetros contendo tampão de dissecação de rato gelado. Para iniciar o isolamento de células-tronco neurais de ratos, use uma microtesoura para picar o tecido ventricular dissecado em pedaços de um milímetro cúbico. Em seguida, prepare o tampão de dissociação enzimática adicionando primeiro cinco mililitros da solução salina balanceada de Earl a um frasco de papaína de um kit de dissociação de papaína.

Colocar o frasco para injetáveis a 37 graus Celsius durante 10 minutos para que a papaína esteja completamente dissolvida e a solução pareça límpida. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução salina balanceada de Earl ao frasco de DNAs do kit de dissociação. E misture delicadamente, adicione 250 microlitros da solução de DNA ao frasco contendo papaína e misture delicadamente.

Em seguida, adicione o tecido picado aproximadamente 0,2 gramas no frasco e coloque o frasco em uma plataforma basculante a 37 graus Celsius por 45 minutos a uma hora. Após a incubação, triture a mistura com uma pipeta de 10 mililitros para dissociar quaisquer pedaços de tecido restantes para obter uma suspensão de células turvas. Transferir a suspensão celular para um tubo cónico estéril de 15 mililitros e centrifugar a 300 Gs durante cinco minutos.

À temperatura ambiente durante a centrifugação, prepare a solução OVO móide misturando 2,7 mililitros de solução salina de equilíbrio Earl's com 300 microlitros da solução inibidora de albumina OVO MOID reconstituída. Em um tubo cônico de 15 mililitros, adicione 150 microlitros da solução de DNA previamente preparada à solução de móide oval e misture invertendo o tubo, descarte o sobrenadante das células peletizadas e imediatamente suspenda imediatamente o pellet celular na mistura diluída de inibidores de albumina de DNA. Em seguida, prepare um gradiente de densidade descontínuo adicionando cinco mililitros de solução inibidora de albumina a um tubo de 15 mililitros e usando uma pipeta de cinco mililitros em camadas suaves e lentas da suspensão celular sobre a solução inibidora de albumina.

Centrifugar a amostra a 70 gs durante seis minutos à temperatura ambiente. Uma vez terminado, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio EFH de rato pré-aquecido que é preparado conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Contar a densidade de células vivas com um hemocitômetro e colocar as células em um frasco de cultura T 25 com uma densidade de 10 células por microlitro em EFH.

Incubar os frascos a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e deixar as culturas crescerem sem perturbações durante uma semana para evitar a agregação de esferas. Aqui é mostrada uma seção transversal da medula espinhal de rato que foi corada com azul rápido luxal, bem como hematin e eoin para mostrar os limites da substância branca e cinzenta. O contorno pontilhado designa o tecido periventricular remanescente dissecado que foi isolado neste protocolo desta região.

Neuroesferas como as mostradas aqui crescerão flutuando livremente em cultura de suspensão em alta ampliação. Micro picos podem ser vistos projetando-se das neuroesferas neuroesferas proliferam, como mostrado pela coloração positiva KI 67, onde as neuroesferas foram dissociadas e plaqueadas em poços revestidos de matrigel. Além disso, eles expressarão principalmente o ninho, no qual é um marcador para células precursoras neurais.

Após este procedimento, fatores exógenos podem ser adicionados às células cultivadas para promover a diferenciação. As células-tronco neurais adultas ou sua progênie também podem ser transplantadas para vários modelos animais para avaliar sua capacidade de reparo regenerativo. Espero que você ache este vídeo útil e boa sorte com seus experimentos.