Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

O objetivo geral deste protocolo é isolar células estromais mesenquimais de quatro fontes distintas de tecido perinatal, o revestimento do cordão umbilical, a geléia de Wharton, a junção cordão-placenta e a placenta fetal. Este método pode ajudar a avançar no campo da biologia de células-tronco, medicina alternativa, obtendo células-tronco mesenquimais de qualidade especial, de forma não invasiva. A principal vantagem dessa técnica é que ela produz produtivamente um grande número de populações de células homogêneas de alta qualidade a partir de fontes distintas de tecido perinatal.

As células estromais mesenquimais do cordão multipotente derivadas dessa técnica podem ser usadas para tratar várias doenças e distúrbios, uma vez que são mais primitivas do que as células-tronco mesenquimais isoladas de tecidos adultos. Este método pode fornecer informações sobre as características das células estromais mesenquimais de diferentes segmentos e nichos específicos do cordão umbilical e da placenta. Comece colocando a amostra em uma placa de Petri de 150 milímetros no gelo em um armário de biossegurança e use uma agulha e uma seringa para enxaguar o tecido várias vezes com PBS gelado.

Quando todos os coágulos sanguíneos tiverem sido removidos, examine cuidadosamente a amostra para identificar as diferentes regiões anatômicas. Em seguida, use uma pinça para agarrar a extremidade fetal do cordão umbilical e use uma tesoura para fazer cuidadosamente uma incisão na parte superior da junção cordão-placenta. Faça uma segunda incisão abaixo da junção para separar a junção cordão-placenta da placenta.

E dividir os tecidos separados em placas de Petri individuais. Em seguida, corte o cordão umbilical longitudinalmente para expor completamente os vasos sanguíneos e a geléia de Wharton circundante sem perturbar o epitélio. Use um bisturi para raspar a geléia de Wharton para longe dos vasos sanguíneos e do interepitélio do subâmnio.

Em seguida, remova os vasos sanguíneos, transferindo qualquer gelatina perivascular restante sob e ao redor dos vasos sanguíneos para a placa de gelatina de Wharton e coloque o tecido restante do revestimento do cordão umbilical em sua própria placa. Quando todos os tecidos tiverem sido dissecados, substitua o PBS em cada prato por três a cinco mililitros de tripsina e use uma tesoura para cortar cada amostra de tecido em pedaços de um a dois milímetros para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Use um microscópio de contraste de fase para observar a digestão parcial, visualizando a liberação de células do tecido.

No final do período de digestão parcial, neutralizar a tripsina com um volume igual de meio de cultura e transferir as amostras para tubos cónicos individuais de 50 mililitros. Deixe os pedaços de tecido assentarem por três minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e coloque 15 a 20 pedaços de tecido parcialmente digeridos por amostra em frascos individuais de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados.

Em seguida, adicione nove mililitros de meio de cultura para uma incubação de dois a três dias a 37 graus Celsius. Troque o meio de cultura após três dias e examine as xplantas por microscopia de contraste de fase para crescimento celular. Quando o crescimento celular atingir 70% de confluência, dissocie as células em um a dois mililitros de solução de tripsina por frasco, girando o frasco para um revestimento uniforme com a solução enzimática e incube as culturas por três minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, neutralize a reação com um a dois mililitros de meio de cultura. Coletar as células por centrifugação, ressuspendendo o pellet em meio de cultura para subcultura em uma densidade de semeadura de um vezes dez a quatro células por centímetro quadrado. As células do revestimento do cordão umbilical e as culturas de gelatina de Wharton exibem valores de eficiência de formação de colônias de 59 e 80 colônias, respectivamente.

O valor da eficiência de formação de colônias das células da junção cordão-placenta, no entanto, é semelhante ao observado para as células-tronco mesenquimais da medula óssea, sugerindo que as células derivadas da junção cordão-placenta têm maior capacidade proliferativa e de auto-renovação. Lado do fluxo: uma análise métrica das suspensões unicelulares isoladas desses tecidos perinatais indica que as porcentagens de células positivas para marcadores específicos de células-tronco mesenquimais de todas as quatro fontes de tecido são semelhantes às expressas por células mesenquimais derivadas da medula óssea padrão. As razões medianas de intensidade de fluorescência, no entanto, indicam que as células derivadas da gelatina de Wharton e da junção cordão-placenta são muito semelhantes ou mais altas do que o revestimento do cordão nas células derivadas da placenta fetal.

Curiosamente, apesar de seus valores variáveis de eficiência na formação de colônias, todas as células das diferentes fontes perinatais expressam níveis semelhantes de marcadores de pluripotência por análise quantitativa de RTPCR, exceto as células estromais mesenquimais derivadas da junção cordão-placenta, que expressaram os níveis mais altos de expressão para todos os marcadores de pluripotência testados. Além disso, as células estromais mesenquimais isoladas de todas as fontes perinatais se diferenciam prontamente em tipos de células adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas, bem como demonstraram diferenciação de trilinhagem. Embora o potencial de diferenciação varie de acordo com a fonte de células estromais mesenquimais.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas a três horas se for executada com eficiência. Ao tentar este procedimento, é importante praticar a técnica lateral e evitar a contaminação cruzada entre as fontes de tecido. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a natureza dos nichos de células-tronco nos tecidos perinatais.