Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta
3 de abril de 2017
Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.
O objetivo geral deste protocolo é isolar células estromais mesenquimais de quatro fontes distintas de tecido perinatal, o revestimento do cordão umbilical, a geléia de Wharton, a junção cordão-placenta e a placenta fetal. Este método pode ajudar a avançar no campo da biologia de células-tronco, medicina alternativa, obtendo células-tronco mesenquimais de qualidade especial, de forma não invasiva. A principal vantagem dessa técnica é que ela produz produtivamente um grande número de populações de células homogêneas de alta qualidade a partir de fontes distintas de tecido perinatal.
As células estromais mesenquimais do cordão multipotente derivadas dessa técnica podem ser usadas para tratar várias doenças e distúrbios, uma vez que são mais primitivas do que as células-tronco mesenquimais isoladas de tecidos adultos. Este método pode fornecer informações sobre as características das células estromais mesenquimais de diferentes segmentos e nichos específicos do cordão umbilical e da placenta. Comece colocando a amostra em uma placa de Petri de 150 milímetros no gelo em um armário de biossegurança e use uma agulha e uma seringa para enxaguar o tecido várias vezes com PBS gelado.
Quando todos os coágulos sanguíneos tiverem sido removidos, examine cuidadosamente a amostra para identificar as diferentes regiões anatômicas. Em seguida, use uma pinça para agarrar a extremidade fetal do cordão umbilical e use uma tesoura para fazer cuidadosamente uma incisão na parte superior da junção cordão-placenta. Faça uma segunda incisão abaixo da junção para separar a junção cordão-placenta da placenta.
E dividir os tecidos separados em placas de Petri individuais. Em seguida, corte o cordão umbilical longitudinalmente para expor completamente os vasos sanguíneos e a geléia de Wharton circundante sem perturbar o epitélio. Use um bisturi para raspar a geléia de Wharton para longe dos vasos sanguíneos e do interepitélio do subâmnio.
Em seguida, remova os vasos sanguíneos, transferindo qualquer gelatina perivascular restante sob e ao redor dos vasos sanguíneos para a placa de gelatina de Wharton e coloque o tecido restante do revestimento do cordão umbilical em sua própria placa. Quando todos os tecidos tiverem sido dissecados, substitua o PBS em cada prato por três a cinco mililitros de tripsina e use uma tesoura para cortar cada amostra de tecido em pedaços de um a dois milímetros para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono. Use um microscópio de contraste de fase para observar a digestão parcial, visualizando a liberação de células do tecido.
No final do período de digestão parcial, neutralizar a tripsina com um volume igual de meio de cultura e transferir as amostras para tubos cónicos individuais de 50 mililitros. Deixe os pedaços de tecido assentarem por três minutos. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante e coloque 15 a 20 pedaços de tecido parcialmente digeridos por amostra em frascos individuais de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados.
Em seguida, adicione nove mililitros de meio de cultura para uma incubação de dois a três dias a 37 graus Celsius. Troque o meio de cultura após três dias e examine as xplantas por microscopia de contraste de fase para crescimento celular. Quando o crescimento celular atingir 70% de confluência, dissocie as células em um a dois mililitros de solução de tripsina por frasco, girando o frasco para um revestimento uniforme com a solução enzimática e incube as culturas por três minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, neutralize a reação com um a dois mililitros de meio de cultura. Coletar as células por centrifugação, ressuspendendo o pellet em meio de cultura para subcultura em uma densidade de semeadura de um vezes dez a quatro células por centímetro quadrado. As células do revestimento do cordão umbilical e as culturas de gelatina de Wharton exibem valores de eficiência de formação de colônias de 59 e 80 colônias, respectivamente.
O valor da eficiência de formação de colônias das células da junção cordão-placenta, no entanto, é semelhante ao observado para as células-tronco mesenquimais da medula óssea, sugerindo que as células derivadas da junção cordão-placenta têm maior capacidade proliferativa e de auto-renovação. Lado do fluxo: uma análise métrica das suspensões unicelulares isoladas desses tecidos perinatais indica que as porcentagens de células positivas para marcadores específicos de células-tronco mesenquimais de todas as quatro fontes de tecido são semelhantes às expressas por células mesenquimais derivadas da medula óssea padrão. As razões medianas de intensidade de fluorescência, no entanto, indicam que as células derivadas da gelatina de Wharton e da junção cordão-placenta são muito semelhantes ou mais altas do que o revestimento do cordão nas células derivadas da placenta fetal.
Curiosamente, apesar de seus valores variáveis de eficiência na formação de colônias, todas as células das diferentes fontes perinatais expressam níveis semelhantes de marcadores de pluripotência por análise quantitativa de RTPCR, exceto as células estromais mesenquimais derivadas da junção cordão-placenta, que expressaram os níveis mais altos de expressão para todos os marcadores de pluripotência testados. Além disso, as células estromais mesenquimais isoladas de todas as fontes perinatais se diferenciam prontamente em tipos de células adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas, bem como demonstraram diferenciação de trilinhagem. Embora o potencial de diferenciação varie de acordo com a fonte de células estromais mesenquimais.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas a três horas se for executada com eficiência. Ao tentar este procedimento, é importante praticar a técnica lateral e evitar a contaminação cruzada entre as fontes de tecido. Essa técnica abriu caminho para os pesquisadores explorarem a natureza dos nichos de células-tronco nos tecidos perinatais.
Visão Geral
Este protocolo descreve a dissecação do cordão umbilical humano e da placenta fetal para isolar células estromais mesenquimais (MSCs) utilizando a técnica de cultura de explante. O método permite a caracterização de MSCs provenientes de diferentes fontes de tecidos perinatais, contribuindo para avanços na biologia das células-tronco.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Medicina Regenerativa
- Técnicas de Cultura Celular
Contexto
- As células estromais mesenquimais (MSCs) possuem potencial terapêutico devido à sua multipotência.
- Tecidos perinatais são fontes ricas de MSCs primitivas.
- Este protocolo tem como objetivo aumentar o rendimento de MSCs de alta qualidade a partir do cordão umbilical e da placenta.
- Compreender as características das MSCs provenientes de diferentes fontes teciduais pode orientar suas aplicações clínicas.
Objetivo do Estudo
- Isolar CMMs do revestimento do cordão umbilical, geléia de Wharton, junção cordão-placentária e placenta fetal.
- Avaliar a qualidade e as características das CMMs derivadas desses tecidos.
- Fornecer um método não invasivo para obtenção de CMMs para uso em pesquisa e terapêutica.
Métodos Utilizados
- Dissecação do cordão umbilical e da placenta em regiões anatômicas distintas.
- Uso de tripsina para digestão parcial de amostras de tecido.
- Cultivo de tecidos dissecados em condições específicas de meio de cultura.
- Avaliação do crescimento celular e caracterização utilizando microscopia e citometria de fluxo.
Resultados Principais
- Alta eficiência de formação de colônias observada em células do geléia de Wharton e da junção cordão-placenta.
- Todas as CMMs expressaram marcadores de pluripotência semelhantes, com variações nos níveis de expressão.
- As CMMs demonstraram a capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens.
- A técnica pode ser concluída eficientemente em duas a três horas.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para o isolamento de CMMs de alta qualidade a partir de tecidos perinatais.
- Compreender as propriedades das CMMs provenientes de diferentes fontes pode aprimorar suas aplicações terapêuticas.
- Recomenda-se a exploração adicional dos nichos de células-tronco em tecidos perinatais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o isolamento de células estromais mesenquimais (MSCs) a partir de diferentes fontes de tecidos perinatais, oferecendo uma alternativa não invasiva e eticamente favorável às MSCs derivadas da medula óssea. Ao comparar regiões anatômicas como a junção cordão-placenta (CPJ), geléia de Wharton (WJ), revestimento do cordão (CL) e placenta fetal (FP), o método apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas em pipelines de medicina regenerativa. A maior eficiência na formação de colônias e a expressão de marcadores de pluripotência observadas nas MSCs derivadas da CPJ fornecem confiança preditiva para aplicações em terapia celular, auxiliando na identificação de candidatas promissoras e na triagem de portfólios.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar MSCs de nichos perinatais discretos com diferentes capacidades de proliferação e autorrenovação.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da validação funcional da multipotência nas linhagens adipogênica, condrogênica e osteogênica.
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo ao identificar o CPJ como uma fonte potente de MSCs com eficiência superior na formação de colônias e expressão de marcadores de pluripotência.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Operacional: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho downstream, obtendo populações homogêneas de MSCs aderentes com perfis definidos de marcadores de superfície (CD29, CD44, CD73, CD90, CD105).
- Valor Científico: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio de técnicas consistentes de cultura de explantes e saídas quantitativas, como eficiência de formação de colônias e métricas de citometria de fluxo.
- Valor Operacional: Destaca prontidão para triagem e escalabilidade, com o protocolo concluído em duas a três horas, permitindo avaliação confiável de compostos em cascatas de triagem pré-clínica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças e o alinhamento de biomarcadores translacionais ao demonstrar a capacidade de diferenciação trilinagem, um desfecho funcional essencial para a validação pré-clínica.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, fornecendo MSCs que mantêm morfologia aderente e fibroblastoide, bem como expressão de marcadores de superfície comparável àquela de MSCs derivadas da medula óssea.
- Valor Científico: Enfoca o valor preditivo de redução de riscos ao mostrar que as MSCs derivadas de CPJ se diferenciam com maior eficiência do que aquelas de outras fontes, apoiando decisões de avanço ajustadas ao risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e trabalhos Pré-clínicos, apoiando a verificação de hipóteses, a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos por meio do isolamento de MSC com resolução anatômica.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses e a elucidação de vias ao permitir a comparação das propriedades das MSCs entre o revestimento do cordão umbilical, geléia de Wharton, junção cordão-placenta e placenta fetal.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio, reprodutibilidade e saídas quantitativas, como eficiência de formação de colônias (59 para CL, 80 para WJ, semelhante à medula óssea para CPJ) e análise da expressão de marcadores baseada em citometria de fluxo.
- Análises: Destaca medições como eficiência de formação de colônias, razões de intensidade de fluorescência e RT-PCR quantitativo para marcadores de pluripotência, que ajudam as equipes a comparar condições e avaliar valor preditivo.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica ao demonstrar a diferenciação das MSCs em linhagens adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas, apoiando o alinhamento de biomarcadores e a validação funcional.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável, e não como uma técnica de uso único, permitindo a padronização entre fontes de tecidos perinatais para um fornecimento consistente de MSCs em programas de medicina regenerativa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução de ambiguidade mecanicista por meio do isolamento anatomicamente resolvido de CMM e caracterização funcional.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de cultura por explante, parâmetros definidos de digestão e densidade de semeadura consistente (1×10⁴ células/cm²).
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre avançar ou não, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados ao identificar fontes de CMM de alta potência, como a CPJ, já nos estágios iniciais da descoberta.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base na proliferação diferencial, auto-renovação e eficiência de diferenciação entre fontes de CMM perinatais.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em dissecação de tecidos, cultura celular estéril e citometria de fluxo para análise de marcadores.
- Os requisitos de instrumentação e infraestrutura analítica incluem microscopia de contraste de fase, centrífugas, incubadoras (37°C, 5% CO₂) e citômetros de fluxo para avaliação de marcadores CD e intensidade de fluorescência.
- Os requisitos de padronização entre equipes envolvem protocolos consistentes de dissecação de tecidos, neutralização de tripsina e densidades de semeadura para garantir a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Considerações de adaptação entre sistemas modelo incluem o ajuste do tamanho do explante e do tempo de digestão com base na fonte do tecido, já que o tempo de crescimento varia (3–4 dias para CPJ, 7–10 dias para CL/WJ, 11–14 dias para FP).
- Limitações práticas apoiadas pelo material de origem incluem a necessidade de evitar contaminação cruzada entre fontes de tecidos durante a dissecação e a variabilidade na eficiência de formação de colônias e no tempo de crescimento entre regiões anatômicas.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
1:09
Human Umbilical Cord (UC), Cord-Placenta Junction (CPJ), and Fetal Placenta (FP) Processing and Cell Isolation
6:21
Conclusion
4:29
Results: Colony-Forming Efficiency and Mesenchmyal Stromal Cell (MSC) Marker Expression of Perinatal Tissue-Isolated Cells
