Visualização de compactação do DNA em cianobactérias por tomografia computadorizada de alta tensão Cryo-elétron

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como como a estrutura do DNA muda durante o ciclo celular das bactérias. A principal vantagem desta técnica é que é possível visualizar a ultraestrutura de células bacterianas inteiras próximas ao estado de vida em pontos de tempo apropriados sem nenhum tratamento adicional. Demonstrando o procedimento estarão Chihong Song, um pós-doutorado do meu laboratório, e Mako Hayashi, um estudante de pós-graduação do laboratório do Dr. Kaneko.

Comece com o cultivo de cianobactérias em placas BG-11 esterilizadas de nove centímetros contendo 1,5% de ágar e 0,3% de tiossulfato de sódio. Incube as placas a 23 graus Celsius sob um ciclo de luz de 12 a 12 com 50 micro-E de luz por metro quadrado por segundo. Para manter as células, transfira-as para placas de ágar BG-11 frescas semanalmente.

Dentro de uma semana, as culturas aparecem como faixas verdes. Transfira os aglomerados verdes de células usando um laço esterilizado por chama e coloque-os na nova placa. Para observar a compactação do DNA, colete as células cultivadas por seis dias no final do período de luz.

Para liberar as células da placa, adicione um mililitro de sacarose 0,2 molar. Em seguida, colete a suspensão celular e repita a adição e remoção de sacarose até que a solução fique verde. A mudança de cor indica que a maioria das células foi liberada.

Agora, transfira 500 microlitros de solução de células suspensas para um tubo Microfuge e adicione a coloração de Hoechst para uma concentração final de um micrograma por mililitro. Em seguida, deixe as células incubarem no escuro por 10 minutos. Em seguida, gire as células, descarte o sobrenadante e ressuspenda-as em 10 microlitros de sacarose 0,2 molar.

Em seguida, transfira um microlitro da suspensão para uma lâmina de vidro, coloque uma lamínula e observe as células sob um microscópio de fluorescência equipado com um filtro UV. Usando uma objetiva de imersão em óleo 100 vezes, procure evidências de compactação de DNA, que deve ser observável na maioria das células. Primeiro, prepare o dispositivo de congelamento por imersão.

Em seguida, configure o recipiente de nitrogênio líquido inserindo o recipiente de etano e o acessório da haste de resfriamento. Em seguida, encha o recipiente com nitrogênio líquido e resfrie-o até a temperatura de nitrogênio líquido. Depois disso, carregue o gás etano no recipiente.

Certifique-se de usar óculos de segurança, pois o etano líquido é explosivo. Por fim, remova o acessório da haste de resfriamento e cubra o recipiente com uma tampa de plástico para evitar o congelamento. Para continuar, descarregue o lado de carbono de uma grade EM revestida de carbono por 30 segundos a 50 miliamperes usando uma barreira de íons de plasma.

Em seguida, prepare o Vitrobot de acordo com o protocolo de teste. Use uma pinça para definir a grade EM pré-tratada para a câmara. Trate a grade EM com um microlitro e um marcador de ouro BSA de 15 nanômetros para servir como marcador fiducial antes de aplicar a amostra.

Agora, alíquota de 2,5 microlitros de suspensão de células na grade. Seque qualquer excesso de solução usando papel de filtro e congele imediatamente a grade em etano líquido. Mantenha a grade congelada armazenada em nitrogênio líquido até que possam ser examinadas.

Em seguida, inicie o HVEM e configure-o para uma alta tensão de um megavolt. Em seguida, resfrie o suporte da grade da amostra a menos 150 graus Celsius usando nitrogênio líquido. Depois de resfriado, monte a grade congelada no suporte de amostra criogênica resfriado e carregue-a no HVEM.

Tome cuidado para evitar contaminar a configuração com gelo. Agora, selecione uma área de imagem com uma ampliação baixa de 1.000 vezes. Em seguida, ajuste a altura do eixo z eucêntrico e incline o estágio da amostra para 60 graus negativos.

Em seguida, remova a folga da rotação de inclinação. Agora, foque perto do local de destino com uma ampliação de 10.000 vezes. Defina um foco insuficiente de seis a 10 mícrons por desvio da imagem focada.

Para imagens, defina a dose para dois elétrons por angstrom quadrado por segundo ou menos. Fique de olho na dose de elétrons, que é refletida pela densidade da corrente, e tire uma imagem por câmera digital ou em um filme de elétrons. Em seguida, colete imagens de inclinação de 60 a 60 graus positivos em incrementos de dois a quatro graus.

Use os recursos automatizados do microscópio, se possível. Abra o pacote de software comercial e carregue as imagens de inclinação para a reconstrução tomográfica. Em seguida, crie um arquivo de pilha de imagens a partir das imagens individuais usando o comando tif2mrc ou newstack.

Em seguida, inicie o software eTomo GUI e insira os parâmetros da imagem para tamanho de pixel, diâmetro fiducial, rotação da imagem e assim por diante. Assim, crie o script de edição. Agora, use o software sugerido para criar uma série de inclinação, alinhada usando marcadores fiduciais, com um erro residual médio inferior a 0,5.

Finalmente, reconstrua um tomograma 3D usando o algoritmo SIRT. Agora, extraia uma região de interesse do tomograma e aplique um filtro de redução de ruído, como um filtro de difusão anisotrópica, um filtro bilateral ou um filtro de morfologia matemática. Execute a filtragem usando parâmetros que aprimoram o contraste da imagem.

Em seguida, segmente um recurso de interesse. Use o recurso de fatiamento para abrir o tomograma. Em seguida, vá para a janela Editor de segmentação e selecione um novo campo de rótulo para criar um arquivo de segmentação.

Em seguida, trace manualmente a borda do recurso de interesse na primeira fatia e, em seguida, em cada uma das outras fatias. Recurso adicional de interesse pode ser adicionado usando as mesmas operações. Agora, para gerar uma renderização de superfície usando opções no menu SurfaceGen para visualizar o volume segmentado, selecione o menu SurfaceView.

Para mover, girar e ampliar o volume 3D, use as ferramentas na janela Visualizador 3D. A segmentação automática pode ser feita usando a ferramenta Varinha Mágica. Clique em um objeto e ajuste os controles deslizantes em Exibir e mascarar para que os recursos do objeto sejam totalmente selecionados.

Em uma cultura síncrona precisa, o DNA marcado com Hoechst mostra uma distribuição uniforme normal na condição escura e, em seguida, compacta progressivamente dentro da célula durante o período de luz, assumindo uma estrutura ondulada semelhante a um bastonete no final do período de luz. Finalmente, a haste se divide no centro e suas duas partes são distribuídas nas células-filhas. Após a divisão celular, o DNA compactado desaparece imediatamente e o DNA retorna a uma distribuição uniforme normal.

Quando as células no estágio final da compactação do DNA foram congeladas e observadas usando microscopia eletrônica de alta voltagem, muitas mostraram compactação de DNA distinta que foi facilmente distinguida das células normais. Alguns exibiram uma constrição no centro das células, como esperado antes da divisão celular. A partir dos tomogramas 3D, o DNA compacto é visivelmente separado no citoplasma e é cercado por um material de baixa densidade.

As camadas da membrana tilacóide são distorcidas ao longo da haste ondulada de DNA compactado. Curiosamente, muitos pequenos corpos de fosfato aderem ao DNA compactado e geralmente aparecem em pares. Esses corpos de polifosfato podem ser os fornecedores de fosfato para a síntese de DNA.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar a ultraestrutura de células bacterianas inteiras próximas ao estado vivo no momento apropriado por microscopia eletrônica crio-alta voltagem sem nenhum tratamento adicional, como coloração. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o estado de compactação do DNA muda a cada minuto no final do ciclo de luz. Certifique-se de não perder o melhor momento para congelar a amostra.

Após este procedimento, outros métodos como o CLEM podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a localização de proteínas ou nucleotídeos específicos no DNA compactado. Após seu desenvolvimento, essa técnica deve abrir caminho para pesquisadores da área de microbiologia explorarem a divisão celular, a segregação de DNA e a infecção viral em bactérias ou em pequenos eucariotos.