Name: Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a detectar moléculas únicas sem marcação usando ressonadores ópticos microtoroidais com tecnologia FLOWER. Este método avançado permite estudar dinâmica de proteínas e cinética de ligação em bioquímica.

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Esta pesquisa foi apoiada em parte por um Prêmio do Serviço Nacional de Pesquisa (T32GM07616) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais.

1. Setup Experimental e Preparação de Amostras <ol><li> Fabricar microtoroids usando a litografia, gravura, e procedimento de fusão como descrito anteriormente 6. Fabricar microtoroids no topo de uma pastilha de silício (chip) que tipicamente têm um diâmetro maior de 80-100 um, e um diâmetro menor de 2 um. </li><li> Descontraia-se cerca de um metro de fibra óptica monomodo (125 revestimento mm, 4,3 mm de diâmetro campo mode) a partir do seu carretel fibra. </li><li> No meio da porção de desenrolado de fibra óptica, retirar um pequeno segmento (2,5 cm) do revestimento do polímero em torno da fibra óptica usando descascadores de fios. Nota: Esta é a porção da fibra óptica que será usado para evanescently luz par no microtoroid. </li><li> Limpe a fibra descascada com álcool isopropílico e um fiapo livre wipe. </li><li> Mantenha essa porção da fibra no local usando um suporte feito de fibra de grampos magnéticos. </li><li> Diluir a fibra evaporadas para ~ 500 nm por Melting e puxando através de um maçarico de hidrogénio e dois motores passo a passo que se deslocam em direcções opostas a 60 uM / min. Posicionar a fibra óptica no interior da porção superior da chama, a qual deve ser ~ 10 mm de altura. Pare de puxar a fibra, quando a transmissão através da fibra pára flutuante, que pode ser monitorizada quer visualmente (observando a luz que é dispersa lateralmente a partir do piscar de fibras dentro e fora) ou conectando-se a fibra para um fotodiodo, que está ligada a um osciloscópio . </li><li> Cleave uma extremidade da fibra óptica e insira-o em um adaptador de fibra nua. Coloque esta extremidade da fibra para a entrada do fotorreceptor. </li><li> Fibra par a outra extremidade da bobina de fibra para o laser, utilizando um acoplador de fibra óptica. </li><li> Colocar o chip microtoroid no topo de um suporte de amostras (de aço inoxidável, 37,8 mm x 6.4 mm x 3,2 mm) usando um epoxi ou fita adesiva de dupla face. </li><li> Montar o suporte da amostra no topo de uma fase que compreende o posicionamento de um nano-posicionamento de 3 eixos (nanocube) estágio (veja lista de equipamentos) em cima de um micrômetro de 3 eixos. Executar todas as experiências em uma mesa óptica pneumaticamente isolada para minimizar as vibrações. </li><li> Posição grosseira o chip amostra usando o micrômetro de 3 eixos. </li><li> Alinhar o contendo microtoroid chip de paralelo para a fibra óptica utilizando o nano-posicionador. Nota: Alinhar o microtoroid dentro de uma distância de um comprimento de onda da luz de entrada (~ 633 nm). Para a visualização de usar este processo de duas colunas de imagem (tubo com a lente objectiva e da câmara, ver lista de equipamento), posicionado na parte superior e no lado do chip. </li><li> Optimizar a polarização da luz laser dirigida através da fibra óptica utilizando um controlador de polarização em-linha (ver lista de equipamentos) com um botão para ajustar a polarização. Nota: polarização óptima é conseguida quando o mergulho medido na transmissão da fibra óptica é exibido o mais estreito. Observe este mergulho em um osciloscópio (veja o passo 2.2 para mais detalhes). </li><li> Construiruma câmara de amostra por epoxying uma lamela de vidro sobre o estágio da amostra usando uma lâmina de vidro como um espaçador. Nota: Um gabinete de Plexiglas cobrindo toda a configuração pode ser útil para minimizar as correntes de ar. Uma pequena abertura deve ser deixada para permitir que a solução seja bombeada utilizando tubagem. </li><li> Equilibrar termicamente suspensões ou soluções aquosas de partículas de molécula única para ≥ 1 hora num banho de água a temperatura ambiente (~ 500 mL). Nota: As amostras são diluídas para a concentração desejada em tubos de microcentrífuga utilizando os tampões associados especificados pelo fabricante, por exemplo, PBS ou HEPES. Se não forem detectados eventos de ligação, aumenta a concentração de sal do tampão de. </li><li> Vortex partículas contendo soluções (1 ml) rapidamente para ~ 2 seg. </li><li> Injectar as soluções contendo partículas para dentro da câmara da amostra em 1 mL / min usando uma bomba de seringa de 1 ml. </li><li> Após a câmara de amostra preencheu, desligar a bomba de seringa. </li><li> Aguarde 30 segundos antes de gravar dados para minimizaros efeitos das vibrações mecânicas resultantes do fluxo de fluido que pode afectar a medição. </li></ol> Fecho 2. Freqüência <ol><li> Re-par do toro para a fibra óptica, movendo o suporte de amostra com o nanopositioner, porque o acoplamento será alterada devido à injecção de fluido. </li><li> Localize o comprimento de onda de ressonância do microtoroid digitalizando o laser de entrada controlado por computador através de uma variedade de comprimentos de onda. Executar este passo, enviando um sinal de tensão da forma de onda triangular com um elemento piezoeléctrico dentro do controlador laser que regula o comprimento de onda do laser. Realizar experimentos usando luz visível (635 nm ± 2,5 nm) como há baixa absorção da luz na água neste comprimento de onda. </li><li> Medir a transmissão de luz através da fibra óptica ligando a saída da fibra óptica para um fotorreceptor auto-equilibrado. Ligue a saída do fotorreceptor em um osciloscópio usando um cabo BNC. Observe on o osciloscópio que ao comprimento de onda de ressonância do microtoroid, a transmissão através da fibra óptica gotas. </li><li> Anexar a saída do fotorreceptor para o principal insumo da frequência de bloqueio controlador de feedback (ver lista de equipamentos) através de um cabo. </li><li> Execute o controlador de feedback frequência de bloqueio no modo de bloqueio automático usando pico top-of-bloqueio com uma frequência de 2 kHz dither e uma amplitude de comprimento de onda oscilação de 19 fm. Empiricamente definir as configurações proporcional-integral derivativos na janela do software usando as regras de ajuste de Ziegler-Nichols 14. Nota: Estes valores só precisa ser definido uma vez no início de todos os experimentos. </li><li> Auto-travar o comprimento de onda do laser no comprimento de onda de ressonância do microtoroid. Faça este passo após o enchimento da câmara de amostra. Nota: Se o deslocamento do comprimento de onda é muito grande, então o controlador de feedback vai perder bloqueio e mudar automaticamente para o modo de digitalização, a fim de localizar o local de comprimento de onda de ressonância. Este occurs para comprimento de onda se desloca maior do que aproximadamente uma largura de linha (pelo menos 600 fm para todos os sistemas estudados aqui). </li><li> Gravar a saída do controlador de realimentação a 20 kHz utilizando uma 24-bit placa de aquisição de dados. Exportar os dados como um arquivo de texto via software de aquisição de dados. </li></ol> 3. Processamento de Dados e Análise <ol><li> Transformada de Fourier os dados em MATLAB. </li><li> Low passar os dados usando um filtro &quot;-parede de tijolos&quot; com um ponto de corte em 1 kHz para remover a freqüência exaltação imposto de 2 kHz (ver Código Suplementar Arquivo Screenshot 1). </li><li> Computacionalmente notch filtrar os dados usando um tamanho de janela de 16 Hz. Nota: Isto é feito para remover fontes conhecidas de ruído, neste caso, 60 Hz ruído na linha eletrônica e suas harmônicas, assim 100 Hz (vindo do motorista laser) e suas harmônicas (ver Código Suplementar Arquivo Screenshot 1). </li><li> Transformada de Fourier inversa os dados de volta para o domínio do tempo. </li><li> Filtro Median os dados usando uma janelatamanho de 1.001 amostras (ver Código Suplementar Arquivo de tela 2). </li><li> Localize mudanças graduais no comprimento de onda de ressonância usando o algoritmo de encontrar passo de Kerssemakers et al. 15. </li><li> Gerar histogramas de a amplitude de cada passo de ligação. </li><li> Calcular o tamanho de partícula usando a Eq. (1) (ver Discussão). </li></ol>

<ol><li>Lu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+nanoparticle+detection+using+optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).</li>
<li>Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+nanoparticles+and+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators.</a> Light: Science and Applications. , (2016).</li>
<li>Knight, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnight%2C+A+%22Single+molecule+biology%22">Single molecule biology</a>. , Elsevier/Academic. (2009).</li>
<li>Jonsson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+biospecific+interaction+analysis+using+surface+plasmon+resonance+and+a+sensor+chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology.</a> BioTechniques. 11, 620-627 (1991).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whispering-gallery-mode+biosensing%3A+label-free+detection+down+to+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules.</a> Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).</li>
<li>Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-Q+toroid+microcavity+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip.</a> Nature. 421, 925-928 (2003).</li>
<li>Vahala, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+microcavities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical microcavities.</a> Nature. 424, 839-846 (2003).</li>
<li>Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+of+whispering-gallery+modes+in+microspheres+by+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption.</a> Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).</li>
<li>Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+virus+detection+from+the+reactive+shift+of+a+whispering-gallery+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).</li>
<li>He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+single+viruses+and+nanoparticles+using+whispering+gallery+microlasers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nano%22%5BJournal%5D)">Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers.</a> Nat Nano. 6, 428-432 (2011).</li>
<li>Dantham, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+single+protein+using+a+nanoplasmonic-photonic+hybrid+microcavity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity.</a> Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).</li>
<li>Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+nucleic+acid+interactions+monitored+on+a+label-free+microcavity+biosensor+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform.</a> Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).</li>
<li>Su, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Single+Exosome+Detection+Using+Frequency-Locked+Microtoroid+Optical+Resonators%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photonics%22%5BJournal%5D)">Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators.</a> ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).</li>
<li>Åström, K. J., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3a%C3%85str%C3%B6m%2C+KJ+%22Feedback+systems+%3A+an+introduction+for+scientists+and+engineers%22">Feedback systems : an introduction for scientists and engineers</a>. , Princeton University Press. (2008).</li>
<li>Kerssemakers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+dynamics+of+microtubules+at+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution.</a> Nature. 442, 709-712 (2006).</li>
<li>Su, T. -T. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Label-free+detection+of+single+biological+molecules+using+microtoroid+optical+resonators%22">Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators</a>. , California Institute of Technology. (2014).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Como uma partícula se liga, o comprimento de onda de ressonância (λ) do toro aumenta. Se uma partícula unbinds, o comprimento de onda de ressonância correspondentemente diminui (um evento passo-baixo). O diâmetro das partículas (d) pode ser determinada através de histogramas da amplitude de cada passo de comprimento de onda. A altura de cada degrau varia de comprimento de onda, devido às variações de tamanho de partícula do ligado e devido à localização na microtoroid onde se liga a partícula. A altera...

Experiências individuais de detecção de moléculas são úteis para reduzir a quantidade de analito usada em biossensores, para a detecção precoce da doença, e para examinar as propriedades fundamentais de moléculas 3. Tais experiências são tipicamente realizada utilizando etiquetas, no entanto, etiquetas nem sempre são possíveis de obter, para uma proteína em particular, aumentar o custo, pode perturbar os eventos a ser estudada, e pode ser inconveniente, particularmente para tempo real no local de experiências ou ponto-de- diagnóstico cuidado. O padrão de ouro para biosensoriamento corrente livre de marcador é ressonância de plasma de superfície 4, no entanto os sistemas de ressonância de plasmon de superfície comercial tipicamente tem um limite inferior de detecção típico da ordem de nM. Recentemente, ressonadores ópticos emergiram como uma tecnologia promissora para livre-label única molécula biodetection 5. Ressonadores trabalho óptico baseado nas de longo prazo (ns) confinamento da luz 6,7. A luz é evanescentlyacoplado a estes dispositivos, normalmente através de uma fibra óptica. Quando o comprimento de onda da luz que passa através da fibra corresponde ao comprimento de onda de ressonância do ressonador, luz de forma eficiente acopla ao ressonador. Isto reflecte a luz acoplada totalmente internamente dentro da cavidade do ressonador gerando um campo evanescente na vizinhança da circunferência do ressonador. Medida que as partículas entram no campo evanescente e ligam-se ao ressoador, o comprimento de onda de ressonância do ressonador as alterações na proporção do volume da partícula 8. Em termos de capacidade de detecção, ressoadores de microsferas têm sido anteriormente utilizados para detectar a gripe A única partículas de vírus (100 nm) 9,10. Recentemente, plasmonically-reforçada de microsferas ressonadores ópticas têm sido utilizadas para detectar soro bovino único moléculas de albumina e 11 oligonucleótidos 8-meros 12, no entanto, esta abordagem limita a área de captura da partícula de 0,3 um por de 2vício. Biossensores maiores da área de captura são ideais para maximizar a chance de detecção de partículas. Biosensoriamento tecnologias atuais baseados na solução livre de rótulo com grandes áreas de captura (&gt; 100 mm 2) limitaram-se a detecção de partículas de poliestireno ≥ 25 nm. Nós desenvolvemos um sistema biosensoriamento livre de marcador com base na tecnologia ressonador óptico conhecido como a frequência de travamento óptica Sussurrar Evanescentes ressonador (FLOR) 13 (Figura 1) que é capaz de detecção resolvida no tempo de moléculas individuais em solução. FLOR usa o tempo de vida do fóton longo dos ressonadores óticos microtoroid combinados com frequência de bloqueio de controle de feedback, detecção equilibrada, e filtragem computacional para detectar as pequenas partículas para baixo para moléculas de proteínas individuais. A utilização de frequência de bloqueio permite que o sistema sempre controlar o deslocamento de ressonância do microtoroid como partículas ligar, sem a necessidade de varrer ou digitalizar o comprimento de onda do laser sobregrandes intervalos. Os princípios da FLOR pode ser usado para melhorar as capacidades de detecção de outras técnicas, incluindo aprimoramento plasmonic. No que se segue, os procedimentos para a realização de FLOR são descritos.

<table><tbody><tr><td>Laser de diodo ajustável</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de feedback de bloqueio de frequência</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Fotorreceptor auto-balanceado</td><td>Newport</td><td>Modelo 2007</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de polarização em linha</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquisição de dados de 24 bits</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-2 humana recombinante</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>grânulos de poliestireno de 20 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Mesa óptica</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva para coluna de imagem</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de imagem (tubo adaptador)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD de alta resolução para coluna de imagem</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

Único detecção de moléculas livre-label usando microtoroid ópticos resonators

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecção de pequenas concentrações de moléculas até o único limite molécula tem impacto sobre áreas como a detecção precoce da doença, e estudos fundamentais sobre o comportamento das moléculas. Técnicas de detecção de moléculas individuais comumente utilizam rótulos como marcadores fluorescentes ou pontos quânticos, no entanto, os rótulos não são sempre disponível, aumentar o custo ea complexidade, e pode perturbar os eventos que estão sendo estudados. Ressoadores ópticos têm emergido como um meio promissor para detectar moléculas individuais, sem o uso de etiquetas. Atualmente, a menor partícula detectada por um sistema ressonador não plasmonically-reforçada nua óptica em solução é uma esfera de poliestireno de 25 nm 1. Nós desenvolvemos uma técnica conhecida como Bloqueio de frequência óptica Whispering Evanescent ressonador (FLOR), que pode ultrapassar esse limite e conseguir única molécula de detecção livre-label em solução aquosa a 2. Como a força do sinal escalas com o volume de partículas, o nosso trabalho representa um&gt; 100x improvement na relação sinal-ruído (SNR) em relação ao estado actual da técnica. Aqui, os procedimentos por trás FLOR são apresentados em um esforço para aumentar o seu uso no campo.

Eventos de ligação de partícula são claramente vistas como modificações tipo degrau no comprimento de onda de ressonância do microtoroid ao longo do tempo (Figura 2A). As alturas destas etapas são mostradas como um histograma na Figura 2B. As Figuras 2-4 mostram traços representativos da ligação de exossomos (nanovesulas), esferas de sílica 5 nm e individuais humanos interleucina-2 moléculas, respectivamente. O facto de que os eventos da etapa-escala co...

Desenvolvemos um sistema de biossensoriamento sem rótulo baseado na tecnologia de ressonador óptico conhecido como Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER), que é capaz de detectar moléculas únicas em solução. Aqui são descritos e apresentados os procedimentos por trás deste trabalho.

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar moléculas individuais e nanopartículas ultra pequenas sem o uso de marcadores, empregando uma técnica baseada em tecnologia de ressonador óptico e travamento de frequência. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais em áreas bioquímicas, como dobramento de proteínas e cinética de ligação. A principal vantagem desta técnica é que a molécula-alvo não precisa ser marcada para ser detectada.O preparo para esta técnica envolve acoplar um chip micro OID a uma fibra óptica. Primeiro, obtenha um chip micro OID. Este é um chip de silício com aproximadamente 6,5 milímetros por 5,5 milímetros, com um micro OID fabricado sobre ele.Como nesta imagem, o micro OID possui um diâmetro maior de 80 a 100 micrômetros e um diâmetro menor de dois micrômetros. Por enquanto, coloque o chip de lado e prepare a fibra para acoplar o chip. Trabalhe com fibra monomodo em um carretel e desenrole cerca de um metro da fibra.Obtenha um stripper de fios e posicione-o aproximadamente no meio da fibra desenrolada. Use-o para remover um segmento de 2,5 centímetros do revestimento polimérico da fibra. Essa região descascada é a região de acoplamento da fibra.Após descascar a fibra, utilize um lenço livre de fiapos e álcool isopropanólico para limpar a região descascada. Em seguida, use um suporte para fibra com grampos magnéticos para manter a parte limpa no lugar. Para o próximo passo, posicione motores de passo de forma a puxar a fibra em direções opostas.Posicione o suporte da fibra para permitir a fixação dos motores de passo na fibra em ambos os lados da região descascada. Além disso, conecte um laser a uma das extremidades da fibra para servir como fonte de luz. Inicie os motores de passo em direções opostas para esticar a fibra e utilize uma tocha de hidrogênio para fundir a parte descascada da fibra.Monitore constantemente a luz dispersada lateralmente pela fibra. Cintilação indica que a transmissão de luz pela fibra está flutuando e que mais afinamento é necessário. Quando a cintilação cessar, pare de aquecer e puxar a fibra, que terá sido afinada para cerca de 500 nanômetros.Após a fibra ter sido afinada, desconecte a fonte de luz e remova a fibra juntamente com seu suporte de grampo magnético dos motores difíceis. Em seguida, transfira a fibra para uma bancada isolada pneumaticamente, equipada com uma plataforma de posicionamento. Coloque a fibra em seu suporte de grampo magnético sobre um bloco de apoio em frente ao chip da amostra.A plataforma de posicionamento é uma plataforma nano de posicionamento de três eixos sobre uma micrométrica de três eixos. Além da plataforma de posicionamento nano, há colunas de imagem com vista superior e lateral para auxiliar no alinhamento. Continue trabalhando com a fibra garantindo que a parte descascada esteja próxima à plataforma de posicionamento.Prepare-se para introduzir a extremidade livre da fibra no sistema de medição. Após clivar a extremidade livre, insira-a em um adaptador de fibra nua. Utilize o adaptador para conectar a fibra à entrada de um receptor fotônico balanceado automático conectado a um osciloscópio.Agora, foque na outra extremidade da fibra. Primeiro, conecte essa extremidade a um acoplador óptico. Em seguida, acople a fibra à saída de um polarizador em linha, que recebe entrada de um divisor de feixe 50 50 e de um laser de diodo sintonizável ATT.Aqui está um esquema das conexões feitas até este ponto. Observe que a segunda saída do divisor de feixe passa por um polarizador em linha e é usada como referência para o receptor fotobalanceado automático. O próximo passo é preparar-se para montar o chip micro OID usando um suporte de amostra de aço inoxidável.Utilize fita adesiva dupla face para fixar o chip no porta-amostras. Em seguida, coloque o microchip sobre o porta-amostras. Agora, monte o porta-amostras com o chip sobre a plataforma de posicionamento nano.Aqui, o suporte e o chip estão posicionados no estágio com o micrômetro de três eixos. Posicione grosseiramente o chip da amostra em relação à fibra. Aqui estão o chip e a fibra após a conclusão do posicionamento grosseiro.Em seguida, ajuste ainda mais o posicionador e utilize as colunas de imagem para alinhar o chip paralelamente à fibra óptica. Com um micro OID e um comprimento de onda a laser da fibra, esta imagem mostra uma fibra e um micro. Após a etapa de posicionamento fino, o adesivo circular próximo ao centro do campo de visão é uma ajuda para posicionamento. Agora, prossiga para buscar o comprimento de onda de ressonância do micro.Gere um sinal de tensão com forma de onda triangular para regular o comprimento de onda do laser em aproximadamente 635 nanômetros mais ou menos 2,5 nanômetros. Agora, varra os comprimentos de onda para buscar ressonância. Observe a transmissão através da fibra no osciloscópio.Observe que, no comprimento de onda de ressonância, a transmissão diminui. Nesse ponto, ajuste a polarização da luz do laser. Ajuste os controladores de polarização embutidos para otimizar a polarização da luz do laser na fibra óptica.Visualize a saída do receptor fotônico no osciloscópio e ajuste a polarização até que o mínimo de transmissão medido pareça o mais estreito possível. Após otimizar a polarização, construa uma câmara de amostra. Sobre o estágio da amostra.A câmara consiste em uma lamínula de vidro fixada com epóxi a um lâmina de microscópio. A lâmina atua como espaçador, permitindo que a lamínula sobreponha o chip e a fibra. Organize uma bomba de seringa de um mililitro e tubos para introduzir as amostras do experimento na câmara a uma taxa de um mililitro por minuto.Em seguida, obtenha uma amostra de um mililitro equilibrada à temperatura ambiente para carregar na bomba. Neste caso, trata-se de uma solução com esferas de sílica de cinco nanômetros. Após o carregamento, observe a câmara de amostra e injete a amostra, parando quando a câmara estiver cheia. A injeção da amostra foi interrompida nesta câmara, que está preenchida com uma solução contendo esferas de sílica de cinco nanômetros.Após aguardar 30 segundos para minimizar o efeito de vibração, busque o comprimento de onda de ressonância do micro. Novamente, observe o dip e a transmissão através da fibra na ressonância utilizando o osciloscópio. Este é um esquema da montagem experimental neste momento, incluindo o controlador proporcional integral derivativo ou PID.O integrador e o dither. Execute o controlador no modo de travamento automático com travamento no pico máximo. Defina a frequência do dither em dois quilohertz e ajuste a amplitude de oscilação do comprimento de onda para 19 femtômetros.Após determinar empiricamente os parâmetros PID, o comprimento de onda do laser é automaticamente fixado no comprimento de onda de ressonância do microoid. Colete os dados registrando a saída do controlador de realimentação. Abaixo estão traçados representativos da variação da ressonância em femtômetros versus tempo em segundos, obtidos com um protocolo utilizando três partículas de ligação diferentes, em ordem de tamanho.As partículas são exossomos ou vesículas nano. Esferas de sílica de cinco nanômetros e moléculas humanas de interleucina dois. Observe as diferentes escalas dos eixos verticais e horizontais em cada conjunto de dados.Observar diferentes escalas nos dados para tamanhos diferentes de partículas é um indicativo de que a técnica foi realizada corretamente. Quando uma partícula se liga ao OID, o comprimento de onda de ressonância do OID aumenta, causando um degrau ascendente no traçado. Quando uma partícula se dissocia, o comprimento de onda de ressonância diminui, resultando em um degrau descendente.A altura de cada passo de comprimento de onda é determinada pelo tamanho da partícula e por sua posição no micro-óide. As escalas de tempo são determinadas pela dinâmica do óide da partícula. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de três horas, se for feita corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter tudo o mais limpo e livre de poeira possível.

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Biossensores interface com ambientes complexos e biológicas e realizar a detecção de alvo, combinando sensores altamente sensíveis com sondas altamente específicos ligados ao sensor através de modificação da superfície. Aqui, nós demonstrar a funcionalização da superfície de sensores ópticos de sílica com biotina, utilizando agentes de acoplamento de silano para colmatar o sensor eo ambiente biológico.

Colocar Sondas Biológicas para Biossensores ópticos de sílica usando agentes de acoplamento de silano

Nós descrevemos a utilização de uma técnica de carbono refluxo dióxido de laser para fabricar cavidades de sílica ressonantes, incluindo autónoma microesferas e no chip microtoroids. O método de refluxo remove imperfeições superficiais, permitindo longos tempos de vida de fotões dentro ambos os dispositivos. Os dispositivos resultantes têm ultra-fatores de alta qualidade, permitindo aplicações que vão das telecomunicações à biodetection.

Fabricação de Sílica Ultra microresonators alto fator de qualidade

Este vídeo demonstra imagens de ressonância plasmônica de superfície localizada para detectar secreções de proteínas de uma única célula. Usando uma configuração microfluídica e um chip de nanoestrutura plasmônica ligado a peptídeos, as mudanças na intensidade da luz refletida no ângulo de ressonância revelam interações com proteínas secretadas de uma única célula.

Ressonância plasmônica de superfície localizada para detectar secreções de proteínas de uma única célula

Os sensores fluorescentes de núcleo microcavidade empregar um alto índice de revestimento quantum dot-no canal de sílica microcapilares. As mudanças no índice de refracção dos fluidos bombeados para a causa do canal capilar se desloca no espectro de fluorescência microcavidade que pode ser utilizado para analisar o meio do canal.

Síntese e Operação de Fluorescente-core microcavidades de Sensoriamento refractométricos

Uma técnica interferômetro de referência, que é projetado para remover indesejável ruído jitter laser para nanodetection, é utilizado para sondar um fator microcavidade ultra-alta qualidade. Instruções de montagem, instalação e aquisição de dados são fornecidos, juntamente com o processo de medição para especificar o fator de qualidade da cavidade.

Implementação de um interferômetro de Referência para Nanodetection

Excitações optomecânicas paramétricas foram recentemente demonstradas experimentalmente em ressonadores optomecânicos microfluídicos por meio de pressão de radiação óptica e espalhamento de Brillouin estimulado. Este artigo descreve a fabricação desses ressonadores microfluídicos juntamente com metodologias para gerar e verificar oscilações optomecânicas.

Fabricação e Teste de microfluídicos optomechanical osciladores

A escalabilidade e a resolução das técnicas convencionais de manipulação óptica são limitadas pela difração. Contornamos o limite de difração e descrevemos um método de transporte óptico de nanopartículas através de um chip usando uma superfície de ouro padronizada com um caminho de ressonadores plasmônicos em forma de C espaçados.

Fabricação e operação de uma Correia Transportadora Nano-óptica

A detecção de fluorescência multicolorida em microfluídica de gotículas normalmente envolve sistemas de detecção baseados em microscópio de epifluorescência volumosos e complexos. Aqui descrevemos um esquema de detecção multicolorido compacto e modular que utiliza uma matriz de fibras ópticas para codificar temporariamente dados multicoloridos coletados por um único fotodetector.

Multicolor detecção de fluorescência para Gota microfluídica Utilizando Fibras Ópticas

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Este artigo traça o ciclo de vida de um ressonador de membrana de nitreto de silício, desde o projeto até a fabricação e a caracterização.

Fabricação e caracterização de ressonadores de membrana de nitreto de silício High-Q

Aprenda a detectar moléculas únicas sem marcação usando ressonadores ópticos microtoroidais com tecnologia FLOWER. Este método avançado permite estudar dinâmica de proteínas e cinética de ligação em bioquímica.

Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

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