2.5: Cultura Explante para Estudos de Desenvolvimento

A cultura de explante é uma técnica na qual tecidos e órgãos inteiros são removidos, ou "explantados", de um feto ou embrião e são cultivados fora do corpo, ou "ex vivo". Esses métodos fornecem uma janela única para nos ajudar a entender o processo de desenvolvimento, permitindo observações diretas do crescimento de órgãos e tecidos - um processo chamado organogênese.

Este vídeo examinará os princípios básicos da cultura de explante, delineará as principais etapas do procedimento, discutirá manipulações típicas e fornecerá aplicações específicas dessa técnica em estudos de desenvolvimento.

Antes de descrever como cultivar explantes, vamos revisar alguns dos princípios por trás dessa técnica.

A cultura de explante é aplicável a uma variedade de tecidos embrionários de uma ampla gama de organismos. Essa técnica é ideal para o estudo do desenvolvimento de órgãos, pois as mudanças estruturais, conhecidas como morfogênese, podem ser observadas diretamente em função do tempo. Além disso, os tecidos podem ser tratados com moléculas experimentais para determinar seu impacto no desenvolvimento. Além disso, quando a cultura de explante é combinada com ferramentas moleculares para alterar a expressão gênica e a microscopia de fluorescência, ela se torna uma ferramenta poderosa para abordar questões de diferenciação celular e tecidual.

A seguir, vamos revisar um protocolo para cultura de explante de tecidos de mamíferos.

Para iniciar o procedimento, os embriões são removidos de uma roedor grávida sacrificada. Após a remoção das membranas circundantes, o embrião é isolado. Os tecidos ou órgãos de interesse são então isolados do embrião extraído e transferidos para placas para crescimento. Meios contendo antibióticos são adicionados e as placas são cultivadas em uma incubadora ajustada para 37 ° C. Os explantes de tecido estão agora prontos para manipulação.

Uma vez estabelecidas as culturas de explante, vários tipos de manipulações podem ser realizados.

Por exemplo, o tecido explantado pode ser geneticamente manipulado para testar o papel de um gene de interesse em um processo de desenvolvimento específico. Isso pode ser alcançado introduzindo material genético no tecido usando técnicas como eletroporação, na qual um campo elétrico é usado para conduzir o DNA injetado nas células próximas.

Os explantes também são frequentemente usados para testar os papéis que as moléculas sinalizadoras, como os fatores de crescimento, desempenham na organogênese. O tecido cultivado in vitro é especialmente útil para esses tipos de estudos porque o tratamento com o composto é tão simples quanto adicioná-lo ao meio de cultura. No entanto, pequenas esferas embebidas em compostos experimentais também podem ser implantadas no tecido para uma abordagem mais controlada do tratamento químico.

Independentemente da abordagem, uma grande vantagem da técnica de explante é que os efeitos das manipulações experimentais podem ser facilmente visualizados em tempo real, usando microscopia de luz ou fluorescente.

Agora, vejamos algumas aplicações específicas da cultura ex vivo.

Primeiro, os explantes representam um sistema modelo no qual o desenvolvimento do tecido pode ser visualizado diretamente. Por exemplo, esses pesquisadores removeram o pâncreas em desenvolvimento de camundongos embrionários e o cultivaram em placas com fundo de vidro para melhorar a imagem.

O desenvolvimento do tecido pode ser observado por microscopia de luz, mas o uso de tecido transgênico expressando marcadores fluorescentes fornece uma visão ainda mais detalhada dos processos de desenvolvimento, como o brotamento dos túbulos. O tecido explantado também pode ser submetido a imunocoloração, o que permite aos pesquisadores monitorar o desenvolvimento de tipos específicos de células, como as células produtoras de insulina mostradas aqui em azul e verde.

Outra aplicação das culturas de explantes é ajudar a decifrar o papel de moléculas específicas, como fatores de crescimento, na organogênese.

Aqui, explantes pulmonares fetais dissecados de embriões de camundongos E12.5 foram cultivados na presença ou ausência de um fator de crescimento por até 48 horas. Os resultados indicam que esse fator de crescimento inibe a formação de vias aéreas no pulmão fetal.

Finalmente, explantes de embriões precoces podem ser usados para determinar os mecanismos que controlam a expressão gênica durante os primeiros estágios da embriogênese.

Esses pesquisadores plantaram dois tipos diferentes de células do estágio de 16 células de embriões de rã: aquelas que são destinadas a formar estruturas dorsais e aquelas que contribuirão para estruturas ventrais. Os explantes foram desenvolvidos por cerca de um dia antes da coloração para caracterizar o padrão de expressão de um gene específico do tecido dorsal.

Como a expressão desse gene foi observada apenas em explantes da região dorsal, concluiu-se que os programas de expressão gênica foram codificados nessas células embrionárias, em vez de serem direcionados por interações célula-célula que ocorrem mais tarde no desenvolvimento.

Agora vimos sistemas de cultura de explante e observamos como ele pode ser usado em estudos de desenvolvimento. Esta técnica é uma ferramenta poderosa que facilita nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento animal. Obrigado por assistir!