Gene Expression Profiling de micróbios Contaminando utilizando uma plataforma digital de codificação em barra
13 de janeiro de 2016
Desenvolvemos um protocolo rápido, sensível e reprodutível para o perfil de expressão gênica de patógenos durante uma infecção.
O objetivo geral deste experimento é medir com precisão a expressão gênica de patógenos in vivo, a fim de esclarecer como um patógeno se adapta ao ambiente infeccioso e causa danos ao seu hospedeiro. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de doenças infecciosas explorarem a dinâmica da expressão gênica de patógenos durante uma infecção real em diversos tipos de tecidos e em múltiplos pontos temporais. A principal vantagem deste método é que ele é altamente sensível e extremamente reprodutível.
Este método torna viável quantificar a expressão gênica de patógenos a partir de pequenas quantidades de tecidos provenientes de uma infecção real. Para começar o preparo dos reagentes, adicione 2-mercaptoetanol ao tampão RLT e misture bem. Prepare uma mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico na proporção 25:24:1.
Rotule tubos de homogeneização do tipo M e resfrie em gelo. Rotule tubos com tampa de rosca de dois mililitros e adicione aproximadamente 300 microlitros de esferas de zircônia a cada tubo. Tenha os seguintes instrumentos prontos para uso, incluindo um dissociador de tecidos, um agitador de esferas, uma centrífuga de bancada com adaptadores para tubos de 50 mililitros e placas de 96 poços, e um fotômetro.
Retire os rins previamente congelados isolados de camundongos infectados com C.albicans de um congelador a -80 °C e coloque-os sobre gelo. Adicione 1,2 mL de tampão RLT a cada rim. Em seguida, transfira cuidadosamente cada rim com o tampão para um tubo de homogeneização do tipo M.
A quantidade de tampão RLT utilizada é determinada empiricamente. Um excesso de tampão RLT diluirá a concentração da amostra, enquanto uma quantidade insuficiente tornará o homogeneizado muito viscoso e extremamente difícil de manipular. Em seguida, utilizando um dissociador de tecidos no programa predefinido RNA 2.01, homogeneíze os rins.
Em seguida, centrifugue a 1000 x G durante um minuto. Transfira 600 microlitros de cada homogeneizado para um tubo com tampa de rosca contendo microesferas de zircônia e mantenha o homogeneizado restante em gelo. Adicione 600 microlitros de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico a cada tubo, feche bem as tampas e vortexe no agitador de microesferas por três minutos a quatro graus Celsius.
Centrifugue a 15.000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo microcêntrifuga de 1,5 mililitro, adicionando volume igual de etanol 70%. Em seguida, carregue na coluna de centrifugação e centrifugue a 8.000 × G. Lave cada coluna de centrifugação uma vez com 700 microlitros do tampão RW, seguido por duas lavagens com 500 microlitros do tampão RPE.
Transfira as colunas para tubos de coleta secos e centrifugue por mais um minuto para remover qualquer líquido remanescente. Por fim, use 50 microlitros de água para eluir o RNA. Em seguida, use um espectrofotômetro em OD 216 nanômetros para medir a concentração de RNA.
Para realizar o perfilamento da expressão gênica utilizando codificação digital por marcadores, comece descongelando o conjunto de códigos repórter e o conjunto de códigos de captura em gelo. Adicione 130 microlitros de tampão de hibridização ao conjunto de códigos repórter. Inverta para misturar e centrifugue para acumular no fundo.
Em seguida, adicione 20 microlitros da mistura a cada um dos 12 tubos de reação. Então, adicione 10 microgramas de RNA total do tecido a cada tubo e homogeneíze por pipetagem. Dependendo do modelo de infecção, do tamanho do inóculo e da linhagem do patógeno utilizada, a porcentagem de RNA do patógeno no RNA total varia de 0 a 2%. Portanto, a quantidade total de RNA que deve ser adicionada para cada amostra deve ser otimizada empiricamente.
Agora, adicione cinco microlitros do conjunto de códigos de captura a cada tubo. Misture invertendo os tubos e centrifugue brevemente. Em seguida, incube as reações em um ciclador térmico a 65 graus Celsius com tampa aquecida por aproximadamente 18 horas.
Retire um cartucho de amostra de 20 graus celsius e deixe aquecer à temperatura ambiente. Retire duas placas de reagentes de quatro graus celsius e centrifugue em uma centrífuga de bancada a 670 x G por dois minutos. Em seguida, configure a estação de preparo seguindo as instruções passo a passo na tela, selecionando a opção de alta sensibilidade.
Em seguida, retire as reações do ciclador térmico e carregue-as imediatamente na estação de preparo. Após executar o programa de alta sensibilidade de três horas, remova a cartucho e use fita transparente para selar as pistas. Aplique óleo mineral na parte inferior do cartucho, se necessário.
Em seguida, carregue a cartela no analisador digital. Configure o analisador digital seguindo as instruções passo a passo na tela, selecionando a opção de varredura de alta resolução. Após executar o programa de digitalização, baixe os resultados ou escolha recebê-los por e-mail e importe os dados brutos para o software do fabricante.
Analise os dados de acordo com o protocolo descrito no texto. O protocolo demonstrado neste vídeo apresenta a vantagem única de utilizar tanto uma sonda de captura quanto uma sonda de detecção para aumentar a especificidade e reduzir o ruído proveniente do RNA do hospedeiro. Como mostrado aqui, as contagens brutas de fundo em uma amostra de tecido não infectado foram todas inferiores a 10, enquanto as contagens brutas em duas amostras de tecido infectado foram todas superiores a 10.
As contagens brutas de duas amostras biológicas apresentaram uma correlação muito boa, com um valor de R quadrado de 0,945. A plataforma também oferece uma faixa dinâmica suficiente para abranger os níveis naturais de expressão biológica. Utilizando um conjunto de sondas que especifica 248 genes de resposta ambiental, foram determinadas duas fases da expressão gênica do patógeno.
Uma resposta precoce de expressão gênica compreende genes cujos níveis de RNA diferem significativamente entre as amostras do inóculo e as amostras coletadas 12 horas após a infecção. Também foi identificada uma resposta tardia de expressão gênica, que inclui genes com níveis de RNA significativamente diferentes entre o ponto de 12 horas e as amostras coletadas 48 horas após a infecção. Esses resultados indicam que a expressão gênica de C.albicans é regulada dinamicamente durante a infecção invasiva em um hospedeiro mamífero.
Este método é fácil e rápido. Todo o procedimento, desde a coleta do tecido até a expressão dos dados, requer menos de 48 horas. O tempo de manipulação é de cerca de quatro horas para 12 amostras.
Embora este método tenha sido desenvolvido para capturar a expressão gênica de patógenos in vivo, ele também pode ser usado para analisar a expressão gênica do hospedeiro. Assim, os pesquisadores podem obter informações úteis de ambos os lados de uma infecção simultaneamente.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo rápido, sensível e reprodutível para análise da expressão gênica de patógenos durante infecções. O método permite aos pesquisadores quantificar a dinâmica da expressão gênica in vivo em diversos tipos de tecidos e pontos temporais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Doença Infecciosa
- Expressão Gênica de Patógenos
- Perfilagem de RNA
Contexto
- Compreender a adaptação de patógenos durante infecções é fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
- Os métodos atuais para medir a expressão gênica podem ser limitados pela sensibilidade e reprodutibilidade.
- Este protocolo tem como objetivo superar essas limitações.
- Ele foi desenvolvido para funcionar com pequenas amostras de tecido provenientes de hospedeiros infectados.
Objetivo do Estudo
- Medir com precisão a expressão gênica de patógenos in vivo.
- Explorar como os patógenos se adaptam ao ambiente do hospedeiro.
- Fornecer insights sobre a dinâmica da expressão gênica durante a infecção.
Métodos Utilizados
- Preparação de reagentes e amostras de tecido de camundongos infectados.
- Homogeneização e extração de RNA utilizando fenol-clorofórmio.
- Barcodificação digital para perfilagem da expressão gênica.
- Análise da concentração de RNA e dados de expressão gênica.
Resultados Principais
- Foram identificadas duas fases de expressão gênica do patógeno durante a infecção.
- Diferenças significativas nos níveis de RNA foram observadas em diversos pontos temporais.
- O método demonstrou alta sensibilidade e reprodutibilidade.
- Os resultados indicam uma regulação dinâmica da expressão gênica em C. albicans durante a infecção.
Conclusões
- Este protocolo permite o estudo detalhado da expressão gênica de patógenos in vivo.
- Também pode ser adaptado para análise da expressão gênica do hospedeiro.
- A abordagem fornece informações valiosas sobre as interações entre hospedeiro e patógeno.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa da expressão gênica de patógenos em tecidos infectados é um gargalo crítico na descoberta de medicamentos para doenças infecciosas, especialmente quando o RNA do patógeno representa uma fração mínima do RNA total. Esta plataforma de codificação digital permite o perfilhamento altamente sensível e reprodutível da dinâmica da expressão gênica microbiana in vivo, apoiando a desvinculação mecanicista e a validação de alvos em modelos pré-clínicos. A abordagem aumenta a confiança preditiva para testes de hipóteses terapêuticas e orienta decisões de triagem de portfólio em pesquisa e desenvolvimento de agentes anti-infecciosos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta dos mecanismos de adaptação do patógeno durante a infecção do hospedeiro.
- Apoia a validação funcional de alvos ao quantificar alterações na expressão gênica em resposta à infecção e ao tratamento.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas ao revelar a regulação gênica dinâmica in vivo.
- Aprimora a confiança preditiva para o avanço de alvos anti-infecciosos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos posteriores, confirmando os perfis de expressão gênica do patógeno.
- Fornece leituras quantitativas padronizadas adequadas para o desenvolvimento e otimização de ensaios.
- Permite a medição reprodutível de genes de patógenos fracamente expressos, apoiando plataformas de ensaio robustas.
- Apoia a escalabilidade e a reutilização da plataforma em diferentes modelos de infecção e pontos temporais.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Alinha dados de expressão gênica de patógenos com modelos in vivo relevantes para a doença, garantindo continuidade translacional.
- Permite análise de séries temporais das respostas de expressão gênica a intervenções terapêuticas.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo leituras moleculares dinâmicas em estudos pré-clínicos.
- Facilita a descoberta de biomarcadores para a progressão da infecção e resposta ao tratamento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de codificação digital integra desde a fase inicial de descoberta até a validação pré-clínica, permitindo uma transição contínua entre a verificação de hipóteses, a identificação de compostos promissores e a pesquisa translacional.
- Biologia da Descoberta: Fornece dados de expressão gênica de alta sensibilidade para testes de hipóteses e esclarecimento de vias em modelos de infecção.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para prontidão de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Gera contagens digitais com ampla faixa dinâmica, permitindo comparação estatística de estados de infecção e efeitos de tratamentos.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a dinâmica da expressão gênica in vivo com a eficácia pré-clínica e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho padronizado e adaptável para patógenos diversos e tecidos hospedeiros.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em modelos de doenças infecciosas.
- Valor Operacional: Fornece perfis rápidos, reprodutíveis e escalonáveis de expressão gênica a partir de pequenas amostras de tecido.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital na pesquisa e desenvolvimento de agentes anti-infecciosos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos terapêuticos direcionados a vias de adaptação microbiana.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em extração de RNA, codificação digital por marcadores e fluxos de trabalho de análise de dados.
- Exige acesso a instrumentação especializada, incluindo homogeneizadores por esferas, cicladores térmicos e analisadores digitais.
- Exige padronização entre equipes para preparação de amostras e interpretação de dados.
- Adaptável a diversos modelos de infecção e tipos de tecidos mediante otimização empírica da quantidade de RNA.
- Limitado pela proporção de RNA do patógeno no RNA total do tecido, exigindo protocolos de alta sensibilidade.
