Gene Expression Profiling de micróbios Contaminando utilizando uma plataforma digital de codificação em barra

O objetivo geral deste experimento é medir com precisão a expressão gênica do patógeno in vivo, a fim de esclarecer como um patógeno se adapta ao ambiente infeccioso e causa danos ao seu hospedeiro. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de doenças infecciosas explorarem a dinâmica da expressão gênica do patógeno durante uma infecção real em vários tipos de tecido e em vários pontos de tempo. A principal vantagem deste método é que ele é altamente sensível e extremamente reprodutível.

Este método torna viável quantificar a expressão gênica do patógeno a partir de uma pequena quantidade de tecidos de uma infecção da vida real. Para começar a preparar os reagentes, adicione 2-mercaptoetanol para tamponar o RLT e misture bem. Prepare uma mistura 25:24:1 de solução de fenol-clorofórmio álcool isoamílico.

Rotule os tubos de homogeneização tipo M e leve à geladeira. Rotule dois tubos com tampa de rosca de mililitro e adicione aproximadamente 300 microlitros de contas de zircônia a cada tubo. Tenha os seguintes instrumentos prontos para uso, incluindo um dissociador de tecidos, um batedor de esferas, uma centrífuga de mesa com adaptadores para tubos de 50 mililitros e placas de 96 poços e um fotômetro.

Remova os rins previamente congelados isolados de camundongos infectados com C. albicans de um freezer de 80 graus Celsius e coloque no gelo. Adicione 1,2 mililitros de tampão RLT a cada rim. Em seguida, transvase cada rim com tampão para um tubo de homogeneização tipo M.

A quantidade de buffer RLT usada é determinada empiricamente. Muito tampão RLT diluirá a concentração da amostra, enquanto muito pouco tornará o homogeneizado muito viscoso e extremamente difícil de manusear. Em seguida, usando um dissociador de tecido na configuração pré-carregada RNA 2.01, homogeneizar os rins.

Em seguida, centrifugue a 1000 x G durante um minuto. Transfira 600 microlitros de cada homogeneizado para um tubo com tampa de rosca contendo esferas de zircônia e guarde o homogeneizado restante no gelo. Adicione 600 microlitros de álcool isoamílico fenol-clorofórmio a cada tubo, feche bem as tampas e bata no batedor de esferas por três minutos a quatro graus Celsius.

Centrifugar a 15 000 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, adicionando um volume igual de 70% de etanol. Em seguida, carregue na coluna de centrifugação e gire a 8.000 x G. Com 700 microlitros de tampão RW, lave cada coluna de centrifugação uma vez, seguida de duas lavagens com 500 microlitros de tampão RPE.

Transfira as colunas para tubos de coleta secos e gire mais um minuto para remover o líquido restante. Por fim, use 50 microlitros de água para eluir o RNA. Em seguida, use um espectrofotômetro em OD 216 animetros para medir a concentração de RNA.

Para realizar o perfil de expressão gênica usando código de barras digital, comece descongelando o conjunto de códigos do repórter e o conjunto de códigos de captura no gelo. Adicione 130 microlitros de buffer de hibridização ao conjunto de códigos do repórter. Inverta para misturar e gire para baixo.

Em seguida, adicione 20 microlitros da mistura a cada um dos 12 tubos de reação. Em seguida, adicione 10 microgramas de RNA tecidual total a cada tubo e misture por pipetagem. Dependendo do modelo de infecção, do tamanho do inóculo e da cepa do patógeno usada, a porcentagem de RNA do patógeno dentro do RNA total varia de 0 a 2% Portanto, a quantidade total de RNA necessária para cada um deve ser otimizada empiricamente.

Agora adicione cinco microlitros de conjunto de códigos de captura a cada tubo. Misture virando os tubos e gire rapidamente para baixo. Em seguida, incube as reações em um termociclador a 65 graus Celsius com uma tampa aquecida por aproximadamente 18 horas.

Remova um cartucho de amostra de 20 graus Celsius e deixe-o aquecer até a temperatura ambiente. Remover duas placas de reagente de quatro graus Celsius e centrifugar numa centrífuga de mesa a 670 x G durante dois minutos. Em seguida, configure a estação de preparação seguindo as instruções passo a passo na tela, selecionando a opção de alta sensibilidade.

Em seguida, remova as reações do termociclador e carregue imediatamente na estação de preparação. Depois de executar o programa de alta sensibilidade de três horas, remova o cartucho e use fita adesiva transparente para selar as pistas. Aplique óleo mineral na parte inferior do cartucho, se necessário.

Em seguida, coloque o cartucho no analisador digital. Configure o analisador digital seguindo as instruções passo a passo na tela, selecionando a opção de varredura de alta resolução. Depois de executar o programa de digitalização, baixe os resultados ou opte por recebê-los por e-mail e importe os dados brutos para o software do fabricante.

Analise os dados de acordo com o protocolo de texto. O protocolo demonstrado neste vídeo tem a vantagem única de usar uma sonda de captura e uma sonda de relatório para aumentar a especificidade e reduzir o ruído do RNA do hospedeiro. Como mostrado aqui, as contagens brutas de fundo de uma amostra de tecido não infectado estavam todas abaixo de 10, enquanto as contagens brutas de duas amostras de tecido infectado estavam todas acima de 10.

As contagens brutas de duas amostras biológicas tiveram uma correlação muito boa com um valor de R ao quadrado de 0,945. A plataforma também fornece faixa dinâmica suficiente para abranger os níveis de expressão biológica natural. Usando um conjunto de sondas especificando 248 genes de resposta ambiental, duas fases da expressão gênica do patógeno foram determinadas.

Uma resposta inicial de expressão gênica compreende genes com níveis de RNA significativamente diferentes entre o inóculo e as amostras pós-infecção de 12 horas. Também foi descoberta uma resposta tardia de expressão gênica que compreende genes com níveis de RNA significativamente diferentes entre as amostras de 12 horas e 48 horas pós-infecção. Esses resultados indicam que a expressão gênica de C. albicans é regulada dinamicamente durante a infecção invasiva de um hospedeiro mamífero.

Este método é fácil e rápido. Todo o procedimento, desde a coleta do tecido até a extração dos dados, requer menos de 48 horas. O tempo prático é de cerca de quatro horas para 12 amostras.

Embora este método seja desenvolvido para capturar a expressão gênica do patógeno in vivo, o mesmo também pode ser usado para responder à expressão gênica do hospedeiro. Portanto, os pesquisadores podem obter informações úteis de ambos os lados de uma infecção simultaneamente.