Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Olá, sou Tim Duso, da Agriculture and AgriFood Canada. Neste vídeo, demonstraremos um protocolo para determinar a presença e abundância de microrganismos específicos em uma amostra clínica ou ambiental complexa usando um instrumento bioplex. Este protocolo usa esferas de poliestireno fluorescente que são quimicamente acopladas a uma sonda de oligonucleotídeo específica da espécie.

Um amplicon é gerado a partir da amostra usando primers de PCR universais e o amplicon é hibridizado com os grânulos acoplados à sonda. Dois sinais são gerados com o instrumento bioplex. Um identifica o cordão e o outro quantifica o sinal de hibridização.

O objetivo geral do procedimento é determinar um perfil da microbiota de interesse de forma rápida e semiquantitativa. Aplicamos essa técnica para determinar perfis bacterianos em swabs vaginais e usamos os dados gerados para diagnosticar a vaginose bacteriana, uma condição clínica caracterizada por uma mudança na microbiota na qual os organismos lactobacilos se tornam menos prevalentes e outros organismos, como Gardnerella, vais e apoian vae, tornam-se detectáveis em swabs vaginais. É importante ter em mente, no entanto, que esta técnica pode ser aplicada a qualquer outra microbiota para a qual um ensaio multiplex rápido seja desejável.

Vamos começar descrevendo como o procedimento funciona. Um perfil microbiano é gerado pela amplificação de uma proteína e cobertura de gene chaperona em 60 de todos os organismos presentes em Um extrato de DNA do cotonete. Um dos primers de amplificação universal é modificado pela adição de biotina, bem como pela inclusão de bases modificadas fosfofatizadas.

Na extremidade cinco primos, o amplicon é feito de fita simples usando a nuclease do éxon T sete, que degrada apenas a fita anti-sentido. Uma vez que a fita sensorial é protegida por um primer de PCR modificado com fosfo, as sondas de oligonucleotídeos complementares à fita restante são acopladas covalentemente a esferas de poliestireno fluorescente. Com cada cor de grânulo exclusiva contendo uma sonda detectando um organismo diferente, até cem grânulos diferentes podem ser usados para uma única amostra.

O produto de PCR de fita simples do swab vaginal é hibridizado com uma mistura de esferas acopladas a sonda contendo sondas para todos os organismos de interesse. Uma etina fluorescente repórter FICO é adicionada que se liga às sondas biotiniladas por meio de um conjugado estreptococo din. Finalmente, a mistura de hibridização é analisada em um instrumento luminex ou bioplex, que examina cada cordão individualmente quanto ao sinal de identidade e hibridização.

Os resultados desta análise indicam a presença de microrganismos específicos e a intensidade do sinal de hibridização se correlaciona com a abundância desse organismo. Na amostra, a presença de organismos relacionados ao VB pode ser usada para diagnosticar o BV. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a grande coloração, é que são geradas informações sobre a presença de microrganismos específicos e sua abundância.

Demonstrando o procedimento estará Jennifer Town, assistente de pesquisa Em nosso laboratório, Re suspenda as microesferas por vórtice por aproximadamente 20 segundos. Transfira 400 microlitros de microesferas para uma centrífuga de tubo einor a 14.000 vezes G por um minuto, remova e descarte o snat Resus. Suspenda as microesferas em 50 microlitros de 0,1 molar MES pH 4,5.

Adicionar um ânimo de oligo de captura às microesferas e misturar por vórtice. Adicione 2,5 microlitros de solução EDC fresca às microesferas. Incube a reação em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro.

Rejeitar a solução de EDC preparada anteriormente e preparar uma nova amostra de 10 miligramas por mililitro de EDC em água. Como acima, adicione mais 2,5 microlitros de solução EDC fresca às microesferas e ao vórtice por cinco segundos. Incube novamente em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro.

Lave os grânulos adicionando um mililitro de 0,02% Tween 20 vórtice para ressuspender a centrífuga de grânulos a 14.000 vezes G. Por um minuto, remova e descarte o sobrenadante. Lave as contas novamente adicionando um mililitro de 0,1% SDS Resus. Suspenda as contas em 100 microlitros de tampão.

Enumere as esferas em um hemocitômetro Para determinar a concentração de estoque. Prepare uma mistura mestre de microesferas diluindo cada grânulo até uma concentração final de 100 grânulos por microlitro no buffer pool os grânulos acoplados de acordo com o plexo desejado do ensaio Armazene a mistura mestre de microesferas a quatro graus no escuro. Esta mistura pode ser armazenada por meses se mantida nessas condições, gerar produto de PCR para cada amostra.

Inclua o conjunto de cinco primers de fosfato e biotina modificados imediatamente após a conclusão da PCR. Adicione dois microlitros de exonuclease T sete a cada tubo de PCR e incube em temperatura ambiente por 40 minutos. No final desta incubação, adicione 12,5 microlitros de 0,5 molar E-D-T-A-P-H 8,0 na mistura.

Isso dá um total de cerca de 64,5 microlitros de produto de PCR de fita simples. Resus Bend Microsphere master mix com uma pipeta. Dispense uma quantidade apropriada em um tubo einor.

Tampe o tubo e sonice em banho-maria sonica por dois minutos. Dispense 17 microlitros de produto de PCR de fita simples nos poços apropriados de um perfil baixo 96. A placa de poço adiciona 33 microlitros de mistura de grânulos Sonicados ressuspensos a cada um.

Cubra bem a placa com uma tampa de silicone e toque. Coloque suavemente a placa no termociclador com um programa de 95 graus por cinco minutos, 60 graus por 10 minutos, 60 graus segure ou pause 60 graus por cinco minutos. Final, inicie o programa.

Faça uma solução fresca de estreptococos Aden FICO Ethin. Você precisará de 25 microlitros por poço. Faça estreptococos e etina FICO diluindo o caule a um miligrama por mililitro.

Um em 50 a 20 microgramas por mililitro com tampão tmac uma vez. Quando o termociclador chegar ao passo de espera de 60 graus, abra a tampa, remova a tampa de silicone e adicione a solução de etina FICO estreptocócica diretamente a cada um. Bem, recoloque a tampa do termociclador de silicone, feche a tampa e retome o programa.

Quando o programa estiver concluído, retire a placa e transfira-a rapidamente para a máquina bioplex para leitura. A placa deve ser lida em 10 minutos. Leia a placa a 60 graus.

Certifique-se de que o bioplex foi pré-aquecido a esta temperatura. Isso mostra os resultados das colorações de Gram correspondentes e perfis de luminex de amostras longitudinais de um único indivíduo no tempo zero. A coloração de Gram é consistente com um diagnóstico clínico de BV, e isso é corroborado por um ensaio Fiveplex Luminex que mostra sinais positivos de hibridização para organismos associados à VB, incluindo Gardner Relic, Vis e Apoian Vae.

Lactobacillus Iners também é detectado em níveis baixos com o passar do tempo. Este indivíduo faz a transição de uma microbiota BV para uma microbiota normal, conforme mostrado pelas colorações de Gram. A análise Luminex dessas mesmas amostras mostra que a abundância de Gardnerella Vaginalis atinge o pico e diminui, enquanto os lactobacilos aumentam para se tornar o organismo dominante no momento final.

Usando este método para traçar o perfil da microbiota, são geradas informações sobre a presença de organismos específicos, bem como sua abundância. Como o método é baseado em sequência, o projeto da sonda pode ser informado por análise de sequenciamento profundo e os microrganismos identificados pelos métodos de sequenciamento de próxima geração podem ser rastreados em amostras de maneira rápida e de custo relativamente baixo. Assistir a este vídeo deve ter lhe dado uma boa compreensão de como gerar um perfil microbiano a partir de uma amostra usando o instrumento Luminex ou Bio Plex.

Mostramos como acoplar sondas de oligonucleotídeos às esferas fluorescentes, gerar alicon de fita simples a partir de uma amostra clínica ou ambiental, realizar hibridização e determinar os resultados no instrumento Luminex ou Bio Plex. Boa sorte com seus experimentos.