Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

O objetivo geral deste método é identificar, caracterizar e isolar células de um esteroide multicelular com base em seu estado do ciclo celular e posição dentro do esteroide, em comparação com o cultivo celular em 2D. O modelo OID 3D recapitula a biologia do câncer in vivo, pois imita a arquitetura tumoral e seu microambiente, combinando esferoides com citometria de fluxo e técnicas de imagem. Este método pode responder perguntas fundamentais na área do câncer, como a forma pela qual o microambiente tumoral altera a sensibilidade a fármacos, a motilidade celular e a proliferação.

A principal vantagem deste método é que ele permite a visualização em tempo real do ciclo celular e possibilita a purificação de células vivas de uma região esteróide específica, demonstrando que o procedimento será realizado por A Sharp, uma assistente de pesquisa do nosso laboratório. Comece a preparar a formação de esteroides tridimensionais aquecendo no micro-ondas 1,5% de aros em 100 mililitros de solução salina balanceada de Hank ou HBSS por três a cinco minutos, agitando intermitentemente o frasco para garantir que o aros esteja completamente dissolvido. Em seguida, pipete imediatamente 100 microlitros da solução de aros em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano com 96 poços. Incube a placa à temperatura ambiente por uma hora para permitir que o aros solidifique.

Em seguida, retire um cultivo celular com 80% de confluência de células de melanoma expressando os construtos FCI do incubador de cultivo celular. Lave as células com 10 mililitros de HBSS. Adicione 1,5 mililitro de 0,05% em EDTA e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente dois minutos.

Uma vez que as células tenham se destacado, suspenda-as em 10 mililitros de meio de cultura celular. Conte manualmente as células utilizando um hemocitômetro e microscópio invertido e dilua-as para 25.000 células por mililitro em meio de cultura celular. Em seguida, pipete 200 microlitros da suspensão celular para recobrir cada poço da placa de 96 poços.

Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por aproximadamente três dias para formar esferoides celulares. Após a incubação, visualize os esferoides em um microscópio invertido utilizando uma objetiva Forex e um filtro de contraste de fase. Os esferoides devem aparecer como agregados celulares compactos e aproximadamente esféricos para preparar o esteroide celular para corte e imagem.

Use uma pipeta de um mililitro para transferi-los para um tubo cônico. Em seguida, deixe o esteroide sedimentar no fundo do tubo cônico. Depois, remova o meio por sucção e, então, fixe os esferoides incubando-os em formalina tamponada neutra a 10% por pelo menos duas horas à temperatura ambiente.

SP pode então ser armazenado em HBSS a quatro graus Celsius por vários dias após o corte e a aquisição da imagem da célula. Abra o software de análise de imagem e selecione a configuração somente de quantificação. Em seguida, crie uma nova biblioteca e importe o arquivo de imagem confocal do esferoide arrastando o arquivo de dados brutos para a biblioteca.

Em seguida, vá até a aba de medições para criar um protocolo de análise de imagem arrastando e soltando comandos na ordem correta na janela de protocolo. Para encontrar objetos no canal verde, arraste e solte o comando "encontrar objetos" da seção de detecção para a janela de protocolo e selecione o canal apropriado. Adicione um comando de abertura encontrado em processamento e, em seguida, adicione um comando separado de objetos em contato para separar as células.

Por fim, na seção de filtragem, adicione e exclua objetos por tamanho. Instrua a exclusão de objetos menores que 50 micrômetros para remover objetos não celulares pequenos. Em seguida, arraste e solte um novo comando de encontrar objetos na janela do protocolo.

Após seguir os mesmos passos, selecione o canal vermelho e aplique todos os comandos subsequentes. Uma vez que os objetos tenham sido identificados, utilize os comandos ocultar canal ou mostrar canal para verificar visualmente se os objetos vermelhos e verdes correspondem aos núcleos vermelhos e verdes. Se necessário, clique em medições e depois em opções de feedback para modificar a aparência das máscaras dos objetos.

Agora, para encontrar objetos amarelos que correspondam a células em fase S inicial, utilize o comando de interseção encontrado na seção de combinação e selecione interseccionar objetos vermelhos com objetos verdes. Novamente, exclua objetos com tamanho inferior a 50 micrômetros. Para identificar células em fase G1, utilize o comando de subtração encontrado na seção de combinação e escolha subtrair objetos amarelos dos objetos vermelhos para encontrar exclusivamente os objetos vermelhos.

Da mesma forma, subtraia os objetos amarelos dos objetos verdes para identificar exclusivamente os objetos verdes que se correlacionam às células nas fases SG dois e MPH, tanto para os objetos exclusivamente vermelhos quanto para os exclusivamente verdes. Remova objetos não celulares conforme necessário, aplicando um comando de população de filtro na seção de filtragem com um fator de forma maior que 0,25. Em seguida, localize o contorno do esferoide S.

Utilizando um comando de encontrar objetos na seção de detecção, tanto no canal verde quanto no vermelho. Utilize um comando de fechamento na seção de processamento para unir as células individuais em um único objeto. Em seguida, adicione um comando de preenchimento de buracos em objetos para preencher as lacunas na esfera.

Em seguida, utilize um filtro fino para remover o ruído do objeto Sphero. Conclua a identificação do contorno do esferoide escolhendo excluir objetos por tamanho, para remover objetos menores que 30.000 micrômetros. Após todos os objetos terem sido definidos, adicione a medição de distâncias na seção correspondente para determinar a distância de cada OID até a borda do contorno do esferoide S.

Realize isso em cada uma das populações amarela, vermelha exclusiva e verde exclusiva. Para visualizar as distâncias mínimas da célula até a borda mais próxima do esferoide S, abra a guia de medições e selecione opções de feedback seguidas por relações. Em seguida, escolha mostrar distâncias.

Por fim, salve o protocolo para armazenar os dados criados pelo protocolo. Escolha o item fazer medição na seção de medição. Em seguida, para interpretar os dados, selecione o item de medição, vá até a aba análise na seção de medição e escolha Analisar no menu de análise para contar as células encontradas a uma determinada distância da borda do esteroide.

Crie um filtro selecionando filtro na guia de análise. Por exemplo, mostre apenas dados em que a distância da borda da esfera seja menor que 100 microns. Para exportar os dados brutos, selecione exportar na guia arquivo e então salve os dados como texto separado por vírgulas ou por tabulações.

Esses dados podem ser abertos em um programa de planilha para análise adicional. Esferóides celulares gerados a partir do C81161. Células de melanoma humano que foram transduzidas com o sistema Fuji foram fixadas e seccionadas.

Realizou-se a imagem confocal para o verde AZA, que marca as células na fase M do ciclo celular e para o laranja Berra, que marca as células na fase G1. Quando essas imagens são sobrepostas, características importantes, como um núcleo necrótico, podem ser observadas, conforme esperado. As células vermelhas na fase G1 predominam mais próximas ao núcleo necrótico, enquanto as células vermelhas e verdes em proliferação aumentam de maneira gradiente em direção à borda externa, onde o acesso a oxigênio e nutrientes é maior.

Após a análise de imagem semi-automatizada, as máscaras das células fucci e o contorno do esferoide S podem ser definidos. Um software de imagem foi utilizado para quantificar as células vermelhas e verdes na região interna ou externa do esferoide S. Essa análise mostrou que as células arrestadas na fase G1 estão enriquecidas na região interna, enquanto as células em proliferação predominam mais próximas à borda do esteroide.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma a duas semanas, um período que inclui o cultivo do esteroide, a aquisição de imagens e a análise. Após esse procedimento, os rads podem ser implantados em uma matriz de colágeno e então visualizados por meio de microscopia de lapso de tempo. Em seguida, podem ser submetidos à análise de proteínas ou RNA, o que pode nos ajudar a responder perguntas como se a posição no esteroide e o acesso a oxigênio e nutrientes podem alterar os fenótipos das células cancerígenas.