Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

O objetivo geral deste método é identificar, caracterizar e isolar células de um esteróide multicelular em relação ao seu status de ciclo celular e posição dentro do esteróide em comparação com a cultura de células 2D. O modelo 3D OID recapitula a biologia do câncer in vivo, pois imita a arquitetura do tumor e seu microambiente, emparelhando esferas com citometria de fluxo e técnicas de imagem. Este método pode responder a questões-chave no campo do câncer, como como o microambiente tumoral altera a sensibilidade aos medicamentos, a motilidade celular e a proliferação.

A principal vantagem deste método é que ele permite a visualização em tempo real do ciclo celular e permite a purificação de células vivas de uma região específica de esteróides, demonstrando que o procedimento será feito A sharp, um assistente de pesquisa de nosso laboratório Comece a se preparar para a formação de esteróides 3D por micro-ondas 1,5% aros em 100 mililitros de solução salina de equilíbrio de Hank ou HBSS ou três a cinco minutos agite intermitentemente o frasco para garantir que o aros está totalmente dissolvido. Em seguida, pipete imediatamente 100 microlitros da solução de aros em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços. Incube a placa em temperatura ambiente por uma hora para permitir que o aros solidifique.

Em seguida, remova uma cultura de células de melanoma de confluência de 80% que expressam as construções de FCI da incubadora de cultura de células. Lave as células com 10 mililitros de HBSS. Adicione 1,5 mililitros de 0,05% em EDTA e incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente dois minutos.

Uma vez que as células tenham se destacado, suspenda-as em 10 mililitros de cultura de células. Média. Conte manualmente as células usando um hemo, citômetro e microscópio invertido e dilua-as para 25.000 células por mililitro em meio de cultura de células. Em seguida, pipete 200 microlitros da suspensão celular para revestir cada poço da placa aros de 96 poços.

Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por aproximadamente três dias para formar esferóides celulares. Após a incubação, imagine os esferóides em um microscópio invertido usando uma objetiva Forex e um filtro de contraste de fase. Os esferóides devem aparecer como agregados celulares compactos e aproximadamente esféricos para preparar o esteróide celular para seccionamento e imagem.

Use uma pipeta de um mililitro para movê-los para um tubo de falcão. Em seguida, permita que o esteróide se acomode na parte inferior do cônico. Em seguida, remova a sucção bi média e, em seguida, fixe os esferóides incubando-os em forma tamponada a 10% neutra por pelo menos duas horas em temperatura ambiente.

O SP pode então ser armazenado em HBSS a quatro graus Celsius por vários dias após o corte e a imagem da célula. Abra o software de análise de imagem e escolha a configuração somente de quantificação. Em seguida, crie uma nova biblioteca e importe o arquivo de imagem confocal esferóide arrastando o arquivo de dados brutos para a biblioteca.

Em seguida, vá para a guia de medidas para criar um protocolo de análise de imagem arrastando e soltando comandos na ordem correta na janela do protocolo. Para localizar objetos no canal verde, arraste e solte o comando localizar objetos da seção de localização para a janela de protocolo e selecione o canal apropriado. Adicione um comando de abertura encontrado em processamento e, em seguida, adicione um comando de objetos de toque separados para separar as células.

Por fim, na seção de filtragem, adicione e exclua objetos por tamanho. Comando para objetos com menos de 50 micrômetros para excluir pequenos objetos não celulares. Em seguida, arraste e solte um novo comando localizar objetos na janela do protocolo.

Seguindo as mesmas etapas, selecione o canal vermelho e aplique todos os comandos subsequentes. Depois que os objetos forem encontrados, use os comandos hide channel ou show channel para garantir visualmente que os objetos vermelhos e verdes correspondam aos núcleos vermelho e verde. Se necessário, clique nas medidas e, em seguida, nas opções de feedback para modificar a aparência das máscaras de objeto.

Agora, para encontrar objetos amarelos que correspondem às células iniciais da fase S, use o comando de interseção encontrado na seção de combinação e escolha interseccionar objetos vermelhos com objetos verdes. Novamente, exclua objetos por tamanho inferior a 50 micrômetros. Para identificar células G de uma fase, use o comando subtrair encontrado na seção de combinação e escolha subtrair objeto amarelo de objetos vermelhos para encontrar exclusivamente objetos vermelhos.

Da mesma forma, subtraia objetos amarelos de objetos verdes para identificar objetos exclusivamente verdes que se correlacionam com células de fase SG dois e MPH para os objetos exclusivamente vermelhos e exclusivamente verdes. Remova objetos não celulares conforme necessário, aplicando um comando filter population da seção de filtragem com um fator de forma maior que 0,25. Em seguida, encontre o contorno do esferóide S.

Usando um comando de localização de objetos da seção de localização no canal verde ou vermelho. Use um comando fechado da seção de processamento para unir as células individuais em um objeto. Em seguida, adicione um comando preencher buracos em objetos para preencher buracos no sphe.

Em seguida, use um filtro fino para remover o ruído do objeto Sphero. Termine de encontrar o contorno do esferóide escolhendo excluir objetos por tamanho para remover objetos menores que 30.000 micrômetros. Depois que todos os objetos tiverem sido definidos, adicione distâncias de medida da seção relacionada para determinar a distância de cada OID até a borda do contorno do esferóide S.

Faça isso em cada uma das populações amarelas, exclusivamente vermelhas e exclusivamente verdes. Para visualizar as distâncias mínimas da célula até a borda do esferóide S mais próxima, abra a guia de medições e selecione as opções de feedback seguidas de relacionamentos. Em seguida, escolha mostrar distâncias.

Por fim, salve o protocolo para salvar os dados criados pelo protocolo. Escolha o item de medição de marca na seção de medição. Em seguida, para interpretar os dados, selecione o item de medição, vá para a guia de análise na seção de medição e escolha Analisar no menu de análise para contar as células encontradas a uma certa distância da borda do esteróide.

Crie um filtro selecionando filtro na guia de análise. Por exemplo, mostre apenas os dados em que a distância da borda da esfera é inferior a 100 mícrons. Para exportar os dados brutos, selecione exportar na guia arquivo e salve os dados como texto separado por vírgulas ou limitado por tabulação.

Esses dados podem ser abertos em um programa de planilha para análise posterior. Célula gerada a partir de C 8 1 16 1. As células de melanoma humano que foram transduzidas com o sistema Fuji foram fixadas e seccionadas.

Foi realizada imagem confocal para AZA verde, que marca as células na fase SG dois M do ciclo celular e Berra laranja, que marca as células na fase G um. Quando essas imagens estão sobrepostas, características-chave, como um núcleo necrótico, podem ser observadas conforme o esperado. As células vermelhas G one presas predominam mais perto desse núcleo necrótico, enquanto as células vermelhas e verdes em proliferação aumentam de maneira gradiente em direção à borda externa do esteróide ou o acesso a oxigênio e nutrientes é maior.

Após a análise de imagem semiautomatizada, as máscaras de células fucci e o contorno do esferóide S podem ser definidos. Um software de imagem foi usado para quantificar as células vermelhas e verdes na região interna ou externa do esferóide S. Esta análise mostrou que as células presas de uma fase G são enriquecidas na região interna, enquanto as células em proliferação predominam mais perto do esteróide Edge.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma a duas semanas, um período de tempo que inclui o crescimento do esteróide, a imagem e a análise. Após esses procedimentos, os rads podem ser implantados na matriz de colágeno e, em seguida, visualizados por meio de uma microscopia TimeLapse. Eles podem então ser submetidos à análise de proteínas ou RNA, e isso pode nos ajudar a responder a perguntas como se a posição no esteróide e o acesso a oxigênio e nutrientes podem alterar os fenótipos das células cancerígenas.