Name: Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprenda a identificar e isolar células em diferentes fases do ciclo celular em esferoides 3D de melanoma usando FUCCI, citometria de fluxo e análise de imagem. Este método permite visualização em tempo real e purificação de células vivas.

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Agradecemos à Sra. Danae Sharp e à Sra. Sheena Daignault pela assistência técnica. Agradecemos ao Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, cidade de Wako, Japão, por fornecer as construções FUCCI, ao Dr. Meenhard Herlyn e à Sra. Patricia Brafford, do Instituto Wistar, Filadélfia, por fornecer linhagens celulares, ao Imaging and Flow Cytometry Facility do Centenary Institute pelo excelente suporte técnico. Agradecemos ao Sr. Chris Johnson e ao Dr. Andrew Barlow pelo suporte técnico do software Volocity. N.K.H. é um Cameron fellow do Instituto de Pesquisa de Melanoma e Câncer de Pele, Austrália. K.A.B. é membro do Instituto do Câncer de Nova Gales do Sul (13 / ECF / 1-39). W.W. é membro do Instituto do Câncer de Nova Gales do Sul (11 / CDF / 3-39). Este trabalho foi apoiado pelas bolsas de projeto RG 09-08 e RG 13-06 (Conselho do Câncer de Nova Gales do Sul), 570778 e 1051996 (Esquema de pesquisa colaborativa de câncer orientado por prioridades / Cancer Australia / Cure Cancer Australia Foundation), 08 / RFG / 1-27 (Instituto do Câncer de Nova Gales do Sul) e APP1003637 e APP1084893 (Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica).

1. FUCCI Transdução e Cultura de Células <ol><li> Transdução FUCCI <ol><li> Criar linhas de células que expressam estavelmente o FUCCI constrói mKO2-hCdt1 (30-120) e MAG-hGem (1-100) 15 utilizando co-transdução de lentivírus, como descrito anteriormente 7. Nota: O sistema FUCCI já está disponível comercialmente. </li><li> Gerar sub-clones com fluorescência brilhante pela triagem de uma única célula. Ordenar as células individuais positivas tanto para AG e KO (amarelo) por fluorescência de células activadas por triagem em uma placa de 96 poços como anteriormente descrito 7,16. </li></ol></li><li> A cultura de células de melanoma <ol><li> Células de melanoma humano C8161 cultura como anteriormente descrito 7,17. </li></ol></li></ol> 2. Formação esferoidal 3D (como descrito anteriormente 3,9) <ol><li> Placa preparação de agarose <ol><li> Dissolve-se 1,5% de agarose (ou ágar nobre) em 100 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) ou fosfato Buffered salina (PBS) por ebulição no microondas por 3-5 min com agitação. Certifique-se a agarose é completamente dissolvido. </li><li> Dispensar imediatamente 100 uL da solução de agarose por poço para uma placa de 96 poços de cultura de tecidos de fundo plano, utilizando uma pipeta multi-canal. Nota: Agarose pode solidificar nas pontas após um curto período de tempo, para ultrapassar este problema pontas deve ser mudado entre as placas, se fazer mais do que uma placa de agarose. </li><li> Deixar placa de 96 poços sobre uma superfície plana de agarose a endurecer durante pelo menos 1 h. </li></ol></li><li> Preparação de Células e de sobreposição em agarose <ol><li> Cultivar células de aproximadamente 80% de confluência num frasco T75. Lava-se com 10 ml de HBSS. </li><li> Separe as células utilizando 1,5 ml de tripsina a 0,05% / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ressuspender em 10 ml de meio normal. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro 18 ou outro método de contagem automatizada. </li><li> Ressuspender as células até uma concentração final de 25.000 células / ml em normamédio al. </li><li> Overlay poços de agarose com 200 ul da suspensão de células para um número final de 5.000 células por poço. </li><li> Placas de retorno para a incubadora de cultura celular (5% de CO 2 e 37 ° C) para formar esferóides durante aproximadamente 3 dias. Nota: O tempo necessário para formar um esferóide varia entre diferentes linhas celulares. Algumas linhas de células de não formar esferóides utilizando este método de todo. </li><li> Imagem esferóide morfologia com um microscópio invertido usando uma objetiva de 4X e um filtro de contraste de fase. Uma linha de células que forma com sucesso esferóides irá produzir agregados de células, aproximadamente esféricos compactos, e deve haver apenas um esferóide por poço. Nota: Opcional: Uma vez que os esferóides se terem formado, que podem ser transplantadas em colagénio ou outra matriz para análise de crescimento e invasão 3,7,17. Para remover esferóides de colagénio, trata-se com 500 ul de 2 mg / ml de colagenase, a 37 ° C até que o colagénio é dissolvido suficiente para o spheroids para vir livre no meio (cerca de 30 min). Remova cuidadosamente esferóides utilizando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Para realizar o corte / imagiologia esferóides fix (quer isolados a partir de colagénio ou cultivadas durante 3-5 dias em agarose) em 10% de formalina tamponada neutra (CUIDADO: Formalina deve ser utilizado em uma câmara de exaustão) durante pelo menos 2 horas à temperatura ambiente (TA) , ou durante a noite (O / N) a 4 ° C. Os esferóides podem ser armazenados em HBSS a 4 ° C durante vários dias. </li></ol></li></ol> 3. Spheroid Vibratome Seccionamento <ol><li> Dissolve-se 5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 100 ml de HBSS em uma garrafa de vidro de 500 ml num forno de microondas. Use uma configuração fogo médio com agitação. CUIDADO: Mantenha a tampa solta quando ferver a solução para que a pressão pode ser liberada. Use luvas heatproof de proteção para proteger as mãos de queimaduras ao manusear a garrafa de vidro quente. </li><li> Aguarde até que a agarose esfria um pouco - para que a garrafa pode ser tocado sem as mãos em chamas. </li><li> Despeje approximamadamente 2 ml de agarose para o fundo de um copo de contador de Coulter ou moldes de plástico semelhante. Imediatamente aspirar um esferóide fixo (ver secção 2.2.8) usando uma pipeta de 1 ml em o menor volume de líquido possível. Adicionar esferóide à agarose. Algumas esferóides (até 10) podem ser adicionados por chávena. </li><li> Cubra os esferóides com 2 ml mais de agarose. Fazê-lo rapidamente para evitar o endurecimento de agarose antes da segunda camada é adicionada. </li><li> Permitir que a agarose endureça à TA no escuro durante pelo menos 3 horas. Em vista disso, do ponto de copos pode ser armazenada por um curto período de tempo, a 4 ° C com 2-3 ml de HBSS sobrepostos para evitar a desidratação. </li><li> Remover agarose do copo. Apare a agarose contendo os esferóides para que ele se encaixa no bloco de metal vibratome, e esferóides estão perto do topo da agarose. Esferóides podem ser vistos como pequenos objetos brancos dentro da agarose. Super cola a agarose para o bloco. </li><li> Encha o vibratome com água destilada e montar o bloco no vibratome. Colocou ovibratome para cortar 100 mm seções usando velocidade baixa (definição 2) e vibração elevada (ajuste 8). Defina o ângulo de lâmina de corte de 16 °. Vire em vibratome, acender a luz vibratome e cortar seções do topo da agarose até 100 mm seções esferóides são cortadas. Coloque seções esferóides cortado em HBSS em uma placa de 24 poços. </li><li> Escolha seções do meio de análise de imagem. Seções de montagem em lâminas de transferência da seção plana para o slide usando uma pinça. Encha uma seringa de 10 ml com graxa de vácuo; adicionar uma linha fina de pasta de vácuo em torno das extremidades da secção, a fim de impedir que o meio de montagem de funcionar fora das extremidades da lâmina e ajudar a selar à secção sob a lamela. Cubra a seção com a montagem médio e uma lamela. Selar bordas da lamela com unha polonês. Loja desliza a 4 ° C antes de imagem. </li></ol> 4. confocal Image Acquisition <ol><li> Tome uma imagem z-slice de uma seção esferóide meio FUCCI usando um 10Xou objectiva 20X como descrito anteriormente 7. Certifique-se de qualquer sobreposição ou crosstalk ocorre entre o Kusabira Orange2 e Azami Green. Se comparando análise de imagem entre várias seções esferóide, mantenha potência do laser e outras definições da mesma entre as amostras. </li></ol> 5. Hoechst Dye Difusão Ensaio para Fluxo Seleção <ol><li> Transferir esferóides vivos (3-5 dias após a semeadura agarose) para um tubo de 15 ml. Vamos esferóides gravidade se depositam no fundo do tubo. Vários esferóides pode ser manchado por tubo. Aproximadamente 20 esferóides são necessários para obter números de células suficientes para citometria de fluxo. </li><li> Remover o excesso de meio e adicionar 1 ml de 10 mM a Hoechst diluídos em meio normal. Incubar esferóides a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora. Use flicking suave para voltar a suspender as esferóides uma ou duas vezes durante a incubação. Nota: O tempo de incubação pode ser variado para alterar o modo como o corante Hoechst longe penetra nos esferóides. Isto irá variar com base naso tamanho do esferóide, densidade e linha celular. Para algumas esferóides grandes / densas, pode haver uma penetração máxima de corante que é inferior a 100%. </li><li> Lavar os esferóides suavemente com 5 mL de HBSS, utilizando a gravidade de sedimentação. <ol><li> Opcional: Para imagiologia de penetração do corante: Fix esferóides com 10% de formalina tamponada neutra para, pelo menos, 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. Prepare vibratome seções, montar em slides e imagem no confocal, como descrito nas etapas 3 e 4 acima. </li></ol></li><li> Para preparar as células para citometria de fluxo, Trypsinize esferóides com 1 ml de tripsina a 0,05% / EDTA a 37 ° C durante aproximadamente 30 min, com sacudindo a cada 10 min para quebrar os esferóides separados. Nota: Os esferóides são difíceis de entrar em suspensão de célula única, as condições podem necessitar de ser optimizado. Viabilidade de C8161 4 dias de idade esferóides após este processo é de aproximadamente 95%. </li><li> Células mancha com um ao vivo near-infrared / mancha mortos de acordo com o protocolo do fabricante. Lavar com HBSS, em seguida, fixar com umml de 10% de formalina tamponada neutra por aproximadamente 30 min. As células podem ser armazenadas em HBSS a 4 ° C durante vários dias antes da análise de fluxo. </li></ol> 6. Citometria de Fluxo Análise de Hoechst manchados Fucci Spheroids <ol><li> Assegurar que as células não são aglutinados, passando-os através de um filtro de células. Ressuspender o Hoechst coradas esferóides FUCCI em gelo frio de lavagem de FACS (PBS com 5% de soro fetal de vitela) a uma concentração de 1-5 x 10 6 células / ml. Transferir 200 ul de amostra de 5 ml de fundo redondo tubos. </li><li> Prepare as seguintes amostras de controle de cores individuais, conforme descrito em 6.1: células de melanoma manchado de un; células de melanoma aderentes coradas com 10 mM Hoechst, durante 1 hora; Azami Verde só expressando células de melanoma; e Kusabira Laranja única expressando células de melanoma. Nota: os controlos de cor individuais podem ser fixadas em formalina e armazenado em FACS lava-se com 0,1% de azida de sódio a 4 ° C durante semanas ou mesmo meses. </li><li> Executar suspensões de células únicas de ofluxo na citometria analisador com lasers apropriados e única cor / controles não coradas como descrito anteriormente 7,16. </li><li> Use um software de citometria comercial, como FlowJo para analisar o interior vs. células esferóides exteriores da seguinte forma: <ol><li> Remover detritos por gating na população de células principal em luz dispersa (FSC) vs. Luz Side Espalhados (SSC). </li><li> Remover doublets por gating em células individuais usando FSC (Area) vs. FSC (Altura) </li><li> Portão de células vivas por gating na população de baixa ao vivo / morto. </li><li> Definir a Hoechst células gated elevados, com base no sinal positivo a partir das células aderentes corados com Hoechst, como células &quot;exteriores&quot;. </li><li> Definir Hoechst células baixas ou negativas, fechado com base no sinal de controlo coradas-un, como células &quot;internos&quot;. </li><li> Após as populações de gating para interior e exterior, as células podem ainda ser fechado para FUCCI vermelho (G1), amarelo (S precoce), verde (S / G2 / M) ou negativo (G1 precoce). Nota: Compensation utilizando os controlos de cor única pode não ser necessária para definir adequadamente as populações vermelho, amarelo, verde e negativos FUCCI. </li></ol></li><li> Uma vez que o teste foi otimizado e Hoechst penetração validado via microscopia confocal, as células correr sem fixar em um classificador de célula de fluxo, como descrito anteriormente 7,16 para posterior análise de sub-populações de células ao vivo. </li></ol> 7. Análise de Imagem de FUCCI Spheroid Secções <ol><li> Abrir software por exemplo. Volocity, escolha a única configuração quantificação. </li><li> Criar uma nova biblioteca. Importe o arquivo de imagem confocal FUCCI esferóide para o software arrastando o arquivo de dados brutos do confocal para a biblioteca. Como alternativa, use o Arquivo&gt; Importar comando. </li><li> Vá até a aba medições para construir um protocolo de análise de imagem. O Protocolo é construído, arrastando e soltando os comandos apropriados na ordem correta como se segue na janela de protocolo. </li><li> Encontre objECTS no canal verde: Arraste comando (encontrado em &#39;Finding&#39;) na janela do protocolo a encontrar objetos, selecione o canal correto nos objetos find protocol.Add um comando de abertura (que se encontra em «tratamento»), então um tocantes objetos separados comando (encontrado em &#39;Processamento&#39; - o que irá separar as células). Excluir objetos de tamanho &lt;50 mm (encontrado em &#39;Filtragem&#39; - isso irá excluir os pequenos objetos não celulares). Nota: As variáveis ​​tais como a encontrar objetos limiar, o número de iterações aberto, o tamanho dos objectos a serem separadas e o tamanho dos objectos a excluir deve ser optimizado manualmente até que as máscaras de objectos corresponder à imagem. </li><li> Encontre objetos no canal vermelho: Repetir a encontrar objetos como acima para o canal vermelho. Protocolos de verde e vermelho pode ter de ser ajustada separadamente. Nota: Devido a estar em núcleos G2, núcleos verdes são muitas vezes um pouco maior. </li><li> Confirme objetos encontrados são precisos: Confirmar vermelho e objetos verdes coincidir com onúcleos vermelho e verde na imagem, desligando e nos canais verde e vermelho (usando a ocultar ou mostrar comando canal) ao exibir as máscaras vermelhas e verdes encontrados pelo protocolo. Medições opções de realimentação (feedback)&gt; opções pode ser utilizada para modificar a aparência das máscaras de objectos. </li><li> Encontre objetos amarelos (células em fase S inicial): Para encontrar células amarelas, adicione uma interseção vermelho com células verdes de comando (encontrado em &#39;Combinando&#39;). Excluir objetos de tamanho (&lt;50 mm, encontrados em &#39;Filtragem&#39;) para excluir quaisquer objetos pequenos não celulares. </li><li> Encontre objetos exclusivamente vermelhos (células em fase G1): Para encontrar núcleos exclusivamente vermelhos, subtrair as células amarelas das células vermelhas (encontrados em &#39;Combinando&#39;). Excluir objetos de tamanho &lt;50 mm, (encontrado em &#39;Filtragem&#39;) para remover quaisquer pequenos objetos não celulares criados. </li><li> Encontre objetos exclusivamente verdes (células em fase S / G2 / M): Repita o procedimento para o canal verde para encontrar exclusivamente verde. Nãote: Se ainda houver objetos não celulares restantes, um comando população filtro pode ser adicionado ao exclusivo protocolos vermelho, verde ou exclusivas (encontrados em &#39;Filtragem&#39;) para reter apenas os objetos com um fator de forma maior do que 0,25. Isto irá remover objetos não-circulares. </li><li> Encontre o esboço esferóide: Encontre o contorno esferóide usando um achado de comando (encontrado em &#39;Finding&#39;) com o canal verde ou vermelho (o que tem mais células ao redor da borda do esferóide) objetos. Um limiar muito inferior (que se encontra na encontrar objetos variáveis) terá que ser usada para encontrar o contorno esferóide em comparação com as células individuais. <ol><li> Use um comando de fechamento para se juntar objetos (encontrados em «tratamento»), em seguida, preencher buracos em objetos (encontrados em «tratamento»), em seguida, usar um filtro fino (encontrado em &#39;Filtragem&#39;) para remover o ruído de objetos. Finalmente, excluir objetos por tamanho para remover objectos mais pequenos &lt;30.000 ^ m (dependendo do tamanho do esferóide). Nota: Este protocolo terá de ser otimizada manualmente até o contorno esferóide é preciso. Uma imagem de campo claro, também podem ser utilizadas - no entanto, este é geralmente menos preciso com uma secção esferóide, e um comando invertido (encontrada em &#39;Combinando&#39;) terá de ser utilizado. </li></ol></li><li> Medir distâncias dos núcleos de esferóide a delinear: Medir distâncias (encontrado no &quot;relativa a&quot;) a partir das populações de amarelo, verde e exclusivamente exclusivamente vermelhas do centróide célula para o bordo do esferóide outline.To visualizar as distâncias mínimas, que deve ser a partir da célula para o bordo esferóide mais próximo, ligue mostrar distâncias na guia relações de opções de retorno (Medidas&gt; Opções&gt; Relações Comentário). </li><li> Guardar o protocolo. Este protocolo pode ser reaplicado para outras imagens, usando as medidas&gt; Restaurar comando de protocolo. </li><li> Criar um item de medições (Medidas&gt; Faça Medição item). Os dados podem ser analisados ​​utilizando a análisefunções. <ol><li> Vá até a aba análise no item medições. Vá para o menu Análise (Analysis&gt; Analisar) e analisar a distância mínima entre o baricentro celular (vermelho, verde ou amarelo) para a borda esferóide, resumidos por contagem e organizado pela população. </li><li> Para contar o número de células encontradas a uma certa distância da borda criar um filtro (Análise&gt; Filtrar). O filtro para a distância mínima na Figura 2 é baseado em Hoechst penetração (por exemplo a distância mínima é inferior a 80 dá a população &quot;exterior&quot;). Alternativamente, a exportação de dados não processados ​​para uma planilha para análise posterior. </li></ol></li></ol>

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<li>Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Hoechst+33342+for+cell+selection+from+multicell+systems%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).</li>
<li>Laurent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroid+models+to+explore+cell+cycle+checkpoints+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D.</a> BMC cancer. 13, 73(2013).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).</li>
<li>Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+distribution+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+is+strongly+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent.</a> Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).</li>
<li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumours.</a> Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiobiological+studies+of+cells+in+multicellular+spheroids+using+a+sequential+trypsinization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique.</a> Radiation research. 86, 368-386 (1981).</li>
</ol>

PerkinElmer contribuiu para os custos de publicação.

Análise de imagens semi-automatizado identificou a região G1 presos interior esferóide, proliferando e camadas exteriores. Este método pode ser usado em esferóides vivo usando uma secção óptica, ou em secções fixas esferóides, para identificar mudanças na não só o ciclo celular, mas a expressão do marcador (por imunofluorescência), a morte celular, ou a morfologia das células nestas regiões diferentes. Motilidade celular dentro de diferentes regiões esferóides podem também ser quantificada - se as imagens ao vivo confoc...

Esferóides multicelulares 3D têm sido conhecida como um modelo de tumor durante décadas, no entanto, só recentemente é que eles tenham entrado em uso mais comuns, como um modelo in vitro para muitos cancros sólidos. Eles são cada vez mais utilizados em telas de alto rendimento de descoberta de drogas como um intermediário entre o complexo, caro e em modelos in vivo demorado e o simples, modelo de monocamada 2D baixo custo 1-6. Estudos em cultura 2D são muitas vezes incapazes de ser replicado in vivo. Modelos esferóides de muitos tipos de cancro são capazes de imitar as características de crescimento, de sensibilidade a drogas, a penetração da droga, as interacções célula-célula, a disponibilidade limitada de nutrientes e de oxigénio e de desenvolvimento de necrose que é visto in vivo em tumores sólidos 6-11. Os esferóides desenvolver um núcleo necrótico, uma região preso quiescente ou G1 que rodeia o núcleo, em proliferação e células na periferia do esferóide 7. O desenvolvimento destas regiõespode variar dependendo da densidade celular, a taxa de proliferação e do tamanho do esferóide 12. Postula-se que a heterogeneidade celular visto nestas sub-regiões diferentes podem contribuir para o câncer resistência terapêutica 13,14. Portanto, a capacidade de analisar as células nessas regiões é crucial para as respostas separadamente drogas compreensão tumorais. O sistema indicador de fluorescência ubiquitinação do ciclo celular (FUCCI) baseia-se no vermelho (Kusabira Laranja - KO) e verde (verde Azami - AG) a marcação fluorescente de CDT1 e geminin, que são degradados em diferentes fases do ciclo celular 15. Assim núcleos celulares aparecem em vermelho no G1, amarelo no início S e verde no S / G2 / M fase. Nós descrevemos aqui dois métodos complementares tanto utilizando FUCCI para identificar o ciclo celular, juntamente com o uso de software de imagem ou de um fluxo de difusão do corante citometria de ensaio para determinar se as células residem no centro da G1 preso ou o exterior proliferatinanel G, e a distância de células individuais a partir da borda do esferóide. Estes métodos foram desenvolvidos na nossa publicação anterior, onde foi demonstrado que as células de melanoma em regiões hipóxicas no centro do esferóide ou / e na presença de terapias específicas são capazes de permanecer em G1 prisão por longos períodos de tempo, e pode re- entrar no ciclo celular quando as condições mais favoráveis ​​surgem 7.

<table><tbody><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>agarose baixo ponto de fusão</td><td>Life Technologies</td><td>16520-050</td><td>Para seccionamento</td></tr><tr><td>de ágar nobre</td><td>Sigma</td><td>A5431</td><td>Para fazer esferoides</td></tr><tr><td>agarose para esferoides</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>Para fazer esferoides</td></tr><tr><td>0,05% tripsina/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina</td><td>Sigma</td><td>HT5014-1CS</td><td>CUIDADO: Nocivo, corrosivo. Use Equipamento de Proteção Individual, faça &nbsp; não fumaça de hálito (aberto em uma hotte).</td></tr><tr><td>vivo/morto perto de IR</td><td>Life Technologies</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>vibratomo</td><td>Technical Products International, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>copo de coulture</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>SIE936</td><td>Molde para seccionamento de esferóides</td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultura de tecidos de 96 poços</td><td>Invitro</td><td>FAL353072</td><td></td></tr><tr><td>colagenase</td><td>Sigma</td><td>C5138&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Analisador de citômetro de fluxo</td><td>Becton Dickinson</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>volocidade</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software de imagem</td></tr><tr><td>flowjo</td><td>Tree Star</td><td></td><td>Software de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Graxa de vácuo</td><td>Sigma</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de montagem</td><td>Vetor Laboratórios</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>FUCCI (construções comerciais)</td><td>Life Technologies</td><td>P36238</td><td>Apenas transfecção transitória</td></tr><tr><td>Filtro de células 70 &#956; m</td><td>In Vitro</td><td>FAL352350</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 5 ml com fundo redondo (estéreis)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352003</td><td></td></tr><tr><td>Tubos com fundo redondo de 5 ml (não estéreis)</td><td>In Vitro</td><td>FAL352008</td><td></td></tr></tbody></table>

análise baseada em citometria de fluxo imaging- e da posição celular eo ciclo celular em 3d melanoma spheroids

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Os esferoides tumorais tridimensionais (3D) são utilizados na pesquisa do câncer como um modelo mais preciso do microambiente tumoral in vivo, em comparação com a cultura de células bidimensional (2D) tradicional. O modelo esferóide é capaz de mimetizar os efeitos da interação célula-célula, hipóxia e privação de nutrientes e penetração de drogas. Uma característica deste modelo é o desenvolvimento de um núcleo necrótico, circundado por um anel de células presas G1, com células proliferantes nas camadas externas do esferóide. De interesse no campo do câncer é como diferentes regiões do esferóide respondem a terapias medicamentosas, bem como à manipulação genética ou ambiental. Descrevemos aqui o uso do sistema indicador de ciclo celular de ubiquitinação de fluorescência (FUCCI) juntamente com citometria e análise de imagem usando software comercial para caracterizar o status do ciclo celular das células em relação à sua posição dentro dos esferoides do melanoma. Esses métodos podem ser usados para rastrear mudanças no status do ciclo celular, expressão gênica / proteica ou viabilidade celular em diferentes sub-regiões de esferóides tumorais ao longo do tempo e sob diferentes condições.

Existem vários métodos de produção de esferóides tumorais, este protocolo utiliza o método de crescimento não-aderente, em que as células são cultivadas em agar ou agarose 3,7,9. A Figura 1 mostra um exemplo de um esferóide melanoma C8161 após 3 dias em agar. Esferóides C8161 formar esferóides de tamanho regular com um diâmetro de 500-600 mm (média = 565, SD = 19, n = 3) após 3 dias. Outras linhas de células de melanoma que irão formar esferóides incluem: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu ...

Descrevemos dois métodos complementares usando o indicador de ciclo celular de ubiquitinação de fluorescência (FUCCI) e análise de imagem ou citometria de fluxo para identificar e isolar células nas regiões internas de G1 presas e externas de proliferação de esferoides 3D.

Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

O objetivo geral deste método é identificar, caracterizar e isolar células de um esteroide multicelular com base em seu estado do ciclo celular e posição dentro do esteroide, em comparação com o cultivo celular em 2D. O modelo OID 3D recapitula a biologia do câncer in vivo, pois imita a arquitetura tumoral e seu microambiente, combinando esferoides com citometria de fluxo e técnicas de imagem. Este método pode responder perguntas fundamentais na área do câncer, como a forma pela qual o microambiente tumoral altera a sensibilidade a fármacos, a motilidade celular e a proliferação.A principal vantagem deste método é que ele permite a visualização em tempo real do ciclo celular e possibilita a purificação de células vivas de uma região esteróide específica, demonstrando que o procedimento será realizado por A Sharp, uma assistente de pesquisa do nosso laboratório. Comece a preparar a formação de esteroides tridimensionais aquecendo no micro-ondas 1,5% de aros em 100 mililitros de solução salina balanceada de Hank ou HBSS por três a cinco minutos, agitando intermitentemente o frasco para garantir que o aros esteja completamente dissolvido. Em seguida, pipete imediatamente 100 microlitros da solução de aros em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de fundo plano com 96 poços. Incube a placa à temperatura ambiente por uma hora para permitir que o aros solidifique.Em seguida, retire um cultivo celular com 80% de confluência de células de melanoma expressando os construtos FCI do incubador de cultivo celular. Lave as células com 10 mililitros de HBSS. Adicione 1,5 mililitro de 0,05% em EDTA e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por aproximadamente dois minutos.Uma vez que as células tenham se destacado, suspenda-as em 10 mililitros de meio de cultura celular. Conte manualmente as células utilizando um hemocitômetro e microscópio invertido e dilua-as para 25.000 células por mililitro em meio de cultura celular. Em seguida, pipete 200 microlitros da suspensão celular para recobrir cada poço da placa de 96 poços.Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por aproximadamente três dias para formar esferoides celulares. Após a incubação, visualize os esferoides em um microscópio invertido utilizando uma objetiva Forex e um filtro de contraste de fase. Os esferoides devem aparecer como agregados celulares compactos e aproximadamente esféricos para preparar o esteroide celular para corte e imagem.Use uma pipeta de um mililitro para transferi-los para um tubo cônico. Em seguida, deixe o esteroide sedimentar no fundo do tubo cônico. Depois, remova o meio por sucção e, então, fixe os esferoides incubando-os em formalina tamponada neutra a 10% por pelo menos duas horas à temperatura ambiente.SP pode então ser armazenado em HBSS a quatro graus Celsius por vários dias após o corte e a aquisição da imagem da célula. Abra o software de análise de imagem e selecione a configuração somente de quantificação. Em seguida, crie uma nova biblioteca e importe o arquivo de imagem confocal do esferoide arrastando o arquivo de dados brutos para a biblioteca.Em seguida, vá até a aba de medições para criar um protocolo de análise de imagem arrastando e soltando comandos na ordem correta na janela de protocolo. Para encontrar objetos no canal verde, arraste e solte o comando "encontrar objetos" da seção de detecção para a janela de protocolo e selecione o canal apropriado. Adicione um comando de abertura encontrado em processamento e, em seguida, adicione um comando separado de objetos em contato para separar as células.Por fim, na seção de filtragem, adicione e exclua objetos por tamanho. Instrua a exclusão de objetos menores que 50 micrômetros para remover objetos não celulares pequenos. Em seguida, arraste e solte um novo comando de encontrar objetos na janela do protocolo.Após seguir os mesmos passos, selecione o canal vermelho e aplique todos os comandos subsequentes. Uma vez que os objetos tenham sido identificados, utilize os comandos ocultar canal ou mostrar canal para verificar visualmente se os objetos vermelhos e verdes correspondem aos núcleos vermelhos e verdes. Se necessário, clique em medições e depois em opções de feedback para modificar a aparência das máscaras dos objetos.Agora, para encontrar objetos amarelos que correspondam a células em fase S inicial, utilize o comando de interseção encontrado na seção de combinação e selecione interseccionar objetos vermelhos com objetos verdes. Novamente, exclua objetos com tamanho inferior a 50 micrômetros. Para identificar células em fase G1, utilize o comando de subtração encontrado na seção de combinação e escolha subtrair objetos amarelos dos objetos vermelhos para encontrar exclusivamente os objetos vermelhos.Da mesma forma, subtraia os objetos amarelos dos objetos verdes para identificar exclusivamente os objetos verdes que se correlacionam às células nas fases SG dois e MPH, tanto para os objetos exclusivamente vermelhos quanto para os exclusivamente verdes. Remova objetos não celulares conforme necessário, aplicando um comando de população de filtro na seção de filtragem com um fator de forma maior que 0,25. Em seguida, localize o contorno do esferoide S.Utilizando um comando de encontrar objetos na seção de detecção, tanto no canal verde quanto no vermelho. Utilize um comando de fechamento na seção de processamento para unir as células individuais em um único objeto. Em seguida, adicione um comando de preenchimento de buracos em objetos para preencher as lacunas na esfera.Em seguida, utilize um filtro fino para remover o ruído do objeto Sphero. Conclua a identificação do contorno do esferoide escolhendo excluir objetos por tamanho, para remover objetos menores que 30.000 micrômetros. Após todos os objetos terem sido definidos, adicione a medição de distâncias na seção correspondente para determinar a distância de cada OID até a borda do contorno do esferoide S.Realize isso em cada uma das populações amarela, vermelha exclusiva e verde exclusiva. Para visualizar as distâncias mínimas da célula até a borda mais próxima do esferoide S, abra a guia de medições e selecione opções de feedback seguidas por relações. Em seguida, escolha mostrar distâncias.Por fim, salve o protocolo para armazenar os dados criados pelo protocolo. Escolha o item fazer medição na seção de medição. Em seguida, para interpretar os dados, selecione o item de medição, vá até a aba análise na seção de medição e escolha Analisar no menu de análise para contar as células encontradas a uma determinada distância da borda do esteroide.Crie um filtro selecionando filtro na guia de análise. Por exemplo, mostre apenas dados em que a distância da borda da esfera seja menor que 100 microns. Para exportar os dados brutos, selecione exportar na guia arquivo e então salve os dados como texto separado por vírgulas ou por tabulações.Esses dados podem ser abertos em um programa de planilha para análise adicional. Esferóides celulares gerados a partir do C81161. Células de melanoma humano que foram transduzidas com o sistema Fuji foram fixadas e seccionadas.Realizou-se a imagem confocal para o verde AZA, que marca as células na fase M do ciclo celular e para o laranja Berra, que marca as células na fase G1. Quando essas imagens são sobrepostas, características importantes, como um núcleo necrótico, podem ser observadas, conforme esperado. As células vermelhas na fase G1 predominam mais próximas ao núcleo necrótico, enquanto as células vermelhas e verdes em proliferação aumentam de maneira gradiente em direção à borda externa, onde o acesso a oxigênio e nutrientes é maior.Após a análise de imagem semi-automatizada, as máscaras das células fucci e o contorno do esferoide S podem ser definidos. Um software de imagem foi utilizado para quantificar as células vermelhas e verdes na região interna ou externa do esferoide S. Essa análise mostrou que as células arrestadas na fase G1 estão enriquecidas na região interna, enquanto as células em proliferação predominam mais próximas à borda do esteroide.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma a duas semanas, um período que inclui o cultivo do esteroide, a aquisição de imagens e a análise. Após esse procedimento, os rads podem ser implantados em uma matriz de colágeno e então visualizados por meio de microscopia de lapso de tempo. Em seguida, podem ser submetidos à análise de proteínas ou RNA, o que pode nos ajudar a responder perguntas como se a posição no esteroide e o acesso a oxigênio e nutrientes podem alterar os fenótipos das células cancerígenas.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

Tomografia de coerência óptica (OCT), uma tecnologia de imagem tridimensional, foi usada para monitorar e caracterizar a cinética de crescimento de esferoides tumor multicelulares. Precisa quantificação volumétrica de esferoides tumor usando um voxel contando a abordagem e deteção de tecido livre de rótulo morto nos esferoides baseado no contraste intrínseco atenuação óptica, foram demonstradas.

Longitudinal de morfológicas e fisiológicas, monitoramento de esferoides Tumor tridimensional usando a tomografia de coerência óptica

Este protocolo descreve a geração de spheroids paciente-derivados, e a análise a jusante que inclui a quantificação da proliferação, do teste da citotoxicidade, da citometria do fluxo, da coloração da imunofluorescência e da imagem latente confocal, a fim avaliar a medicina potencial dos candidatos como terapêutica antineoplásica. Este protocolo suporta a medicina da precisão com identificação de drogas específicas para cada paciente e estágio da doença.

Spheroids 3D derivados do paciente fisiológico para a seleção antineoplástica da droga para alvejar pilhas de haste do cancro

Aqui, nós apresentamos diversos métodos simples para avaliar a viabilidade e a morte em spheroids da pilha de cancro 3D, que imitam os gradientes physico-químicos de tumores in vivo muito melhor do que a cultura 2D. O modelo esferóide, portanto, permite a avaliação da eficácia do câncer de drogas com melhor tradução para as condições in vivo.

Avaliando a viabilidade celular e morte em 3D culturas esferóides de células cancerosas

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Um novo modelo esferoide tridimensional baseado na interação heteroplípica das células tumorais e fibroblastos estrômios é estabelecido. Aqui, apresentamos cocultura de células tumorais e fibroblastos estrômicos, imagens de lapso de tempo e microscopia confocal para visualizar a formação de esferoides. Este modelo tridimensional oferece uma plataforma pertinente para estudar interações tumor-stroma e testar a terapêutica do câncer.

Um novo modelo esferoide de tumor 3D modulado por fibrosa estromal para estudar a interação tumoral-stroma e a descoberta de drogas

Aqui, descrevemos um ensaio de invasão fácil de usar para glioblastoma. Este ensaio é adequado para células-tronco de glioblastoma. Uma macro Fiji para fácil quantificação de invasão, migração e proliferação também é descrita.

Um modelo esferóide 3D para glioblastoma

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.

Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

Os esferoides tumorais estão se tornando cada vez mais utilizados para avaliar as interações de microambientes de células tumorais e a resposta terapêutica. O presente protocolo descreve um método robusto, mas simples, para imagens semi-de alta produtividade de esferoides tumorais 3D usando limpeza óptica rápida.

Limpeza óptica rápida para análise semi-de alto rendimento de esferoides tumorais

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a interação de macrófagos primários derivados de monócitos humanos com um esferóide tumoral em uma matriz tridimensional (3D) de colágeno I, com a possibilidade de comparar o impacto das propriedades solúveis e físicas do microambiente na invasão celular.

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

Aprenda a identificar e isolar células em diferentes fases do ciclo celular em esferoides 3D de melanoma usando FUCCI, citometria de fluxo e análise de imagem. Este método permite visualização em tempo real e purificação de células vivas.

Análise baseada em Citometria de Fluxo Imaging- e da Posição celular eo ciclo celular em 3D melanoma Spheroids

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