Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

O objetivo geral deste procedimento é direcionar com precisão microdomínios em um mapa funcional para estudar a estrutura e a função dos neurônios em alta resolução. Isso é feito realizando primeiro imagens de sinal intrínseco em uma grande área do córtex para obter um mapa da característica do estímulo de interesse. O segundo passo é determinar a localização precisa no mapa que deve ser direcionada para imagens de fótons de alta resolução.

Em seguida, depois de posicionar cuidadosamente a pipeta carregada com corante fluorescente, os neurônios são marcados com o marcador fluorescente. Finalmente, imagens de alta resolução para fótons de respostas ou estruturas neuronais são coletadas. Em última análise, um mapa de características de sinal intrínseco pode ser usado para encontrar uma região de interesse, como uma singularidade cata-vento de orientação que pode então ser direcionada para estudo em resolução de neurônio único.

A principal vantagem deste protocolo é que se pode obter imagens do córtex em diferentes escalas espaciais usando a mesma configuração de microscópio com apenas alguns ajustes rápidos no sistema. Isso permite combinar essas técnicas para usar o mapa de sinal intrínseco de resolução de curso como um guia para escolher uma região de neurônios a serem rotulados com sondas fluorescentes para imagens de alta resolução. O animal foi anestesiado de acordo com um protocolo aprovado pelo comitê institucional de cuidados com os animais, e o crânio foi exposto e limpo.

A mistura de cimento dentário tem sido usada para prender uma placa de cabeça de aço inoxidável com uma abertura retangular no centro ao crânio. Uma câmara de metal no topo da placa principal serve como um reservatório para imagens com a lente objetiva de imersão em água. A placa de cabeça foi fixada em um estágio XY usando postes de metal.

Use uma broca odontológica para afinar uma grande área de osso dentro da abertura retangular da placa da cabeça. Aplicação de ceras ósseas necessárias para parar sangramentos ocasionais. A área fina deve se estender além dos limites da craniotomia planejada.

Em seguida, perfure um contorno quadrado de dois por dois milímetros no osso para a craniotomia. Enxágue a câmara periodicamente com líquido cefalorraquidiano artificial fresco para remover fragmentos ósseos e minimizar a dissipação de calor para o córtex subjacente. Agora, levante o osso com uma pinça número três.

Use uma pinça número cinco e uma tesoura de mola Vana para remover as camadas superiores da dura-máter, deixando a camada inferior intacta. A camada final da dura-máter é transparente e os vasos de casca devem ser claramente visíveis através dela. Aplique uma gota de 2%aeros quente dissolvido em A CSF e coloque imediatamente uma lamínula sobre a craniotomia.

Primeiro, uma espuma de gel embebida em A CSF ao redor da parte externa da lamínula para evitar que os agros sequem durante a imagem de sinal intrínseco. Em seguida, conecte a câmera CCG de imagem de sinal intrínseco à porta de montagem C padrão na parte superior dos dois fotomicroscópios e coloque uma fonte de luz iluminante na mesa de ar perto da posição do estágio XY e prenda a guia de luz sobre a craniotomia. Retraia o dicróico primário e o espelho abaixo da porta do monte submarino para que a luz vermelha refletida necessária para sinais intrínsecos passe diretamente da craniotomia para a câmera CCD.

Insira um filtro infravermelho no caminho da luz para evitar que o córtex aqueça. Em seguida, coloque um filtro que passe luz verde e registre uma imagem de referência digital dos vasos sanguíneos da superfície cortical. Em seguida, mova o foco Z para 500 mícrons abaixo da superfície cortical.

Substitua o filtro verde por um filtro vermelho para iluminar o córtex para medir sinais intrínsecos. Certifique-se de que o córtex esteja uniformemente iluminado. Proteja a craniotomia da luz produzida pela exibição do estímulo visual e apresente uma sequência de estímulos visuais e registre imagens de dados de refletância para gerar um mapa de orientação Em 10 minutos, colete dados correspondentes a quatro repetições de uma sequência de oito estímulos com quatro orientações e duas direções para cada orientação.

Agora analise os dados do sinal intrínseco para gerar um mapa de cores de orientação falsa, como visto aqui. Em seguida, selecione regiões-alvo potenciais para a marcação de dois fótons de neurônios. Por exemplo, as singularidades do cata-vento de orientação apontam no mapa para onde todas as orientações preferenciais convergem.

Em seguida, sobreponha o mapa de orientação e a imagem da vasculatura da superfície cortical e use o layout dos domínios funcionais e a localização de grandes vasos superficiais para selecionar um alvo, evitando locais com grandes vasos sanguíneos e artérias. Prepare as soluções fluorescentes D e puxe uma pipeta cônica longa de acordo com as instruções do protocolo escrito. Coloque cinco microlitros da mistura de corante na pipeta.

Em seguida, remova a camada final de dura-máter para facilitar a inserção da pipeta e obter imagens de dois fótons da mais alta qualidade, conforme ilustrado por este diagrama. A pipeta deve ser conduzida para o córtex em um ângulo de 30 graus para passar entre a câmara e a objetiva. Portanto, a localização da superfície cortical da posição de entrada da pipeta não será diretamente sobre a região alvo de interesse.

Por exemplo, para rotular uma região-alvo 200 mícrons abaixo da superfície cortical, a posição de entrada da pipeta na superfície cortical será de aproximadamente 350 mícrons lateral à posição alvo. Mova o estágio XY para centralizar a posição de entrada da superfície cortical sob a objetiva de 20 x ou 40 x. Uma vez que a posição de entrada esteja centralizada sob a objetiva, aumente a posição Z da objetiva em dois milímetros.

Em seguida, ligue a luz de fluorescência epi verde e visualize o corante vermelho Alexa na pipeta e mova a pipeta até que a ponta esteja acima da posição de entrada da superfície cortical. Enquanto viewa ponta da pipeta através das oculares do microscópio com iluminação de campo claro, abaixe a pipeta até que a ponta atinja a posição de entrada desejada na superfície cortical. Em seguida, remova a objetiva e use lanças de absorção sem fiapos para absorver o excesso de líquido cefalorraquidiano da craniotomia e secar o osso adjacente.

Em seguida, aplique uma gota de 3% de rosa quente, dissolvido em um LCR para estabilizar o córtex. Assim que o aros solidificar, insira uma objetiva de 40 x e reabasteça a câmara com um LCR. Em seguida, use o eixo diagonal do micromanipulador para mover a pipeta até que a ponta atinja a profundidade desejada no córtex.

Sopros ocasionais de ejeção de pressão da mistura DI reduzirão a probabilidade de que a ponta da pipeta entupa quando a pipeta atingir a camada dois, três pequenos sopros da mistura DI iluminarão o espaço celular extra e revelarão um conjunto denso de corpos celulares circulares como sombras escuras para carregar corpos neuronais em uma esfera de córtex de 300 a 600 mícrons de diâmetro. Injete a mistura Dix no espaço extracelular usando 30 a 90 pulsos. Cada pulso um segundo, dois a 10 PSI.

Após a injeção, aguarde alguns minutos e, em seguida, remova a pipeta e a objetiva. O indicador fluorescente de cálcio será totalmente absorvido pelos neurônios em uma hora. Por fim, remova o aros usado para o download e enxágue a câmara de gravação.

Coloque uma pequena gota de dois a 3% de acaso na superfície e coloque rapidamente uma lamínula sobre a craniotomia. Insira uma objetiva alta NA 20 x no suporte da objetiva e recentralize a região cortical marcada sob a objetiva. Usando o estágio XY, proteja a craniotomia de fontes de luz estranhas e colete imagens de alta resolução dos neurônios marcados in vivo.

Alternativamente, a eletroporação de célula única pode ser usada para estudar a morfologia dendrítica ou a imagem funcional dos dendritos. Nesta metodologia, as DI são elaboradas de acordo com o protocolo escrito. Então, no ponto apropriado do procedimento, a ponta da pipeta é posicionada adjacente a uma membrana do corpo celular neuronal e um axo é usado para aplicar um a três pulsos.

O preenchimento imediato do neurônio com corante é prontamente visualizado com microscopia de dois fótons. Esta imagem mostra uma área de imagem de dois fótons mostrando corpos celulares marcados com o indicador de cálcio fluorescente OGB 1:00 AM na camada dois três do córtex visual, a barra de escala representa 100 mícrons. Esta imagem mostra a preferência de orientação de corpos celulares neuronais individuais do mesmo local mostrado na imagem anterior.

Um mapa organizado da orientação do estímulo preferido é visto em torno da singularidade do cata-vento que foi centrada na região da imagem. Aqui vemos o mapa de orientação obtido com imagens de sinal intrínseco. O quadrado preto corresponde à região mostrada na imagem anterior de dois fótons.

Esta imagem mostra os dendritos e o corpo celular de um único neurônio sobreposto ao mapa de orientação. O neurônio foi eletroporado com Alexa floor 5 94 sob orientação de dois fótons. Como a pilha Z foi coletada in vivo e os processos dendríticos foram rastreados offline usando neurolúcido como software.

O mapa de orientação foi obtido usando imagens de sinal intrínseco antes da eletroporação de célula única. A barra de escala representa 100 mícrons. Esta projeção Z de 10 mícrons da camada cortical um mostra dendritos apicais.

As setas vermelhas mostram espinhos ao longo dos dendritos, enquanto essas projeções Z de 10 mícrons da camada cortical dois mostram dendritos basais com espinhos indicados por setas vermelhas e axônios indicados por setas brancas. Este método é útil para estudar mapas funcionais no córtex em diferentes escalas espaciais e para direcionar com precisão os neurônios em um domínio específico de interesse. Dentro do mapa, demonstramos a aplicação do método para examinar mapas seletivos de orientação, mas pode ser estendido a outros mapas de características visuais, como retina, toppy, dominância ocular e direção, ou a outras modalidades sensoriais que possuem mapas funcionalmente organizados, como aqueles que codificam a sensação ou audição do somato.