Name: Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Aprenda a rotular neurônios em microdomínios funcionais do neocórtex combinando imagem de sinal intrínseco e microscopia de dois fótons. Este método permite estudar estrutura e função neuronal com alta resolução.

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Este trabalho foi financiado por doações do National Eye Institute R01EY017925 e R21EY020985 e financiamento das Fundações Dana &amp; Whitehall para PK Agradecemos também Mateus Petrella para a assistência com procedimentos cirúrgicos; Graça Dion para rastrear os dendritos mostrados na Figura 5A e Pratik Chhatbar para comentários sobre o manuscrito.

1. Preparação cirúrgico <ol><li> Induzir a anestesia e continuamente monitorar a freqüência cardíaca, acabam de CO 2 das marés, EEG, e temperatura. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Universidade Médica da Carolina do Sul e foram baseados naqueles que anteriormente publicado 9,15. </li><li> Expor a superfície dorsal do crânio através do corte na pele com uma lâmina de bisturi. Dissecar os tecidos conjuntivos que recobrem o osso usando uma cureta Brudon. Limpe o osso através de aplicadores de algodão e gaze de algodão ponta. Aplicar a cera óssea (quando necessário) ao crânio, para parar o sangramento ocasional através de pequenas veias emissário. </li><li> Anexar uma placa de titânio ou de aço inoxidável para a cabeça do crânio (sobre a região de interesse, onde a craniotomia será executada) usando cimento dental misturada com tinta preta (ver Materiais). Uma abertura rectangular no centro da placa frontal proporciona acesso para a craniotomia e imagiologia óptica. Anexar uma câmara metálica no topo da placa frontal. Esta câmara serve como um reservatório de fluido para geração de imagens com a lente objectiva de imersão em água. </li><li> Fixe a placa de cabeça para um estágio xy usando postes de metal. </li><li> Diluir uma grande área do osso dentro da abertura rectangular da headplate usando uma broca de dentista. A área a ser diluído deve estender-se para além dos limites da craniotomia planeada. A cabeça dura não roedora mamíferos devem ser diluídos, se imagens de alta resolução estão a ser adquiridos a partir do neocortex, porque no local da craniotomia, a espessura do osso vai ditar a espessura da lamela de agarose entre a superfície e neocortical (ver abaixo) . </li><li> Perfurar um 2 x 2 esboço mm quadrados no osso para a craniotomia. Enxaguar a câmara periodicamente com fresco fluido cerebrospinal artificial (ACSF), para remover fragmentos ósseos e minimizar a dissipação de calor ao córtex subjacente. Aplique cera de osso, conforme necessário, para parar o sangramento ocasional. </li><li> Lift do retalho ósseo com pinça # 3. </li><li> Remover todos, mas a camada inferior de duração usando uma pinça fina (# 5CO) e tesoura primavera Vannas. A dura-máter em mamíferos não roedora é espesso e opaco, mas pode ser removido em camadas distintas. A hemorragia é rara, mas pode ser interrompido com Gelfoam e qualquer resíduo de sangue deve ser cuidadosamente removido da camada restante de dura usando uma pinça e enxaguamento com ACSF. A camada final de dura é transparente e vasos Pial deve ser claramente visível através dele. Deixando esta camada final de dura intacta durante o exame sinal intrínseco irá aumentar a taxa de sucesso de carregamento a granel de indicadores de cálcio fluorescentes para a fase posterior de imagens de dois fótons do experimento (ver discussão). </li><li> Aplique uma gota de agarose morna 2% (dissolvido em ACSF) e coloque imediatamente uma lamela sobre a craniotomia. Verifique a craniotomia para assegurar que as pulsações respiratórias e cardiovasculares são mínimos, utilizando um microscópio de dissecção cirúrgica ou as oculares do dois-fóton em microscópio de campo claro modo. </li></ol> 2. Intrínseca sinal óptico de imagem <ol><li> Adicionar gel de espuma embebidas com ACSF em torno do exterior da lamela para evitar a secagem de agarose durante o exame do sinal intrínseco. </li><li> Anexar o intrínseco sinal de imagem da câmara CCD para a porta de montagem C padrão em cima do microscópio de dois fotões (Figura 1). Coloque a fonte de luz de iluminação sobre a mesa de ar perto do palco xy (Figura 1A). Posição e manter as guias de luz sobre a craniotomia e headplate / câmara (Figura 1B). Retrair o dicróico primário e do espelho inferior da porta C-montagem de modo que a luz reflectida vermelho necessário para sinais intrínsecos irá passar directamente a partir da craniotomia para a câmara CCD (Figura 1C-D). Usando o objectivo ar 4x (0,13 NA, 17 mm DI), um campo de 2 x 2 mm de exibição está disponível para a imagem do sinal intrínseco. </li><li> Inserir um filtro de calor na light caminho para evitar que a partir de córtex de aquecimento. Use um filtro que passa luz verde (546 nm centro λ) e gravar uma imagem de referência digital dos vasos sanguíneos superficiais corticais. </li><li> Mover o foco para z 500 mm abaixo da superfície cortical. Usar um filtro vermelho (630 nm centro λ) para iluminar o córtex para medir sinais intrínsecos. Posicionar as guias de luz de tal forma que a superfície cortical é uniformemente iluminado. Proteger a craniotomia da luz produzida pelo mostrador estímulo visual. Apresentar uma seqüência de estímulos visuais e gravar imagens de dados de refletância. Para gerar um mapa de orientação dentro de 10 min, coletar dados correspondentes a quatro repetições de uma sequência de oito estímulos (4 orientações e duas indicações para cada orientação). </li><li> Analisar os dados de sinal intrínsecas para gerar um mapa de orientação falsa cor. Selecione regiões-alvo em potencial para dois fótons de rotulagem de neurônios, por exemplo, as singularidades de orientação pinwheel - pontos no mapa ondetodas as orientações preferidas convergem (Figura 2A). Sobrepor a orientação do mapa e a imagem da vasculatura superfície cortical (Figura 2B-C). Use o esquema de domínios funcionais e localização de embarcações de grande superfície para selecionar um alvo, evitando locais com grandes vasos sanguíneos e arteríolas 15. </li></ol> 3. Carregando em massa de Indicadores de cálcio fluorescentes <ol><li> Prepara-se uma solução de 20% de Pluronic / DMSO, adicionando 1 g de Pluronic em 5 ul de DMSO. Aquecer a mistura a 60 ° C durante 10 minutos para dissolver completamente o Pluronic. Deixar a mistura arrefecer até à temperatura ambiente. Adicionar 4 ul da mistura de Pluronic / DMSO para um frasco de 50 ug do indicador de cálcio fluorescente verde Oregon 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Em seguida, adicionar 1 ml de um corante vermelho (Alexa Fluor 594, 2 mM de solução stock) e 35 uL de solução de pipeta (ver Materiais) para uma concentração final de 1 mM OGB-1 AM. Sonicate a solução para ½ h emum banho de água gelada e em seguida, centrifuga com um filtro de 0,45 um para remover as impurezas. </li><li> Puxar uma pipeta de conicidade de comprimento com um diâmetro exterior da ponta de 2,0-2,5 | im. Carregar 5 uL da mistura de corantes para a pipeta. </li><li> Remover a camada final de dura-máter para facilitar a inserção de uma pipeta e obter a melhor qualidade de imagens de dois fotões. </li><li> Determinar a localização exacta da superfície cortical que a pipeta tem de ser colocado de modo a atingir o seu alvo na camada cortical 2/3. O nosso alvo predeterminado cortical é uma singularidade pinwheel na orientação do mapa (Figura 2). A pipeta tem de ser conduzido para o córtex no ângulo de 30 º para passar entre a parede da câmara e do objectivo. Assim, para identificar a região de destino 200 um abaixo da superfície cortical, a posição de entrada da pipeta na superfície cortical será de aproximadamente 350 um lateralmente à posição do alvo (figura 3-B). </li><li> Mover a fase xy (em que o animal e o pmicromanipulador ipette são colocados) para centrar a posição de entrada da superfície cortical no âmbito do objectivo (Figura 3C). Utilize uma objectiva de 20x ou 40x, com uma distância de trabalho (DT) de pelo menos 3 mm (ver Materiais) para garantir que a pipeta irá entrar facilmente no córtex sem tocar o objectivo ou o osso ao longo da parede da craniotomia. Uma vez que a posição de entrada está centrado no âmbito do objectivo, aumentar a posição Z do objectivo de 2 mm (Figura 3D). Com a luz verde epi-fluorescência ligada a visualizar o corante vermelho Alexa na pipeta, use o eixo diagonal do micromanipulador para mover a pipeta até a sua ponta é centrado (concentrado e), sob a objectiva directamente acima da superfície cortical entrada ( Figura 3E). </li><li> Baixar a pipeta na vertical (ao longo do eixo z), até que a pipeta atinge a superfície cortical (Figura 3F), enquanto continuamente visualizar a ponta da pipeta com a oculars do microscópio. Usando brilhante-campo de iluminação, os vasos sanguíneos superficiais corticais e demais membranas das meninges (pia e aracnóide) são facilmente visíveis como a pipeta se aproxima da superfície cortical. Se a pipeta não atinge a posição de entrada desejado, aumentar a pipeta e recalibrar alvo com base nos pontos de referência vasculares na superfície cortical. </li><li> Retire o objetivo, pavio líquido cefalorraquidiano excesso da craniotomia e secar o osso adjacente usando lanças sem fiapos de absorção. Aplicar uma gota de quente de agarose a 3% (dissolvido em ACSF) para estabilizar o córtex que é visível através da craniotomia (Figura 3G). Em animais não roedores, agarose a 3% é necessário para amortecer pulsações para uma implantação bem sucedida de corantes fluorescentes pelos neurónios. Para imagiologia sinal óptico intrínseco somente 2% de agarose é necessária porque a combinação de agarose a 2% e a lamela fornece a estabilidade necessária. Aqui, não lamela é usado para o passo de corante de carregamento de modo agarose 3%necessário. Após a agarose solidificou, insira uma objetiva de 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) e re-encher a câmara com ACSF. </li><li> Mudar de campo brilhante para dois fótons de visualização e localizar a ponta da pipeta. Usando o eixo diagonal do micromanipulador, mover a pipeta até a sua ponta atinge a profundidade desejada, no córtex (Figura 3H). Puffs pressão ocasionais de ejeção da mistura de corante (a psi poucos, cada pulso de 0,1 seg) irá ajudar a evitar a ponta da pipeta de entupimento. Porque OGB-01:00 só se torna visível após entrar nas células, o corante vermelho Alexa é crítica para a visualização da ponta da pipeta dentro do córtex. </li><li> Antes de tentar carregar neurônios na camada cortical 2/3 com a dose completa do corante, re-centrar o objectivo da superfície cortical para confirmar a profundidade da ponta da pipeta e garantir que a ponta está no local de destino com base na disposição de vasos sanguíneos superficiais. Se a pipeta está na camada de 2/3, puffs pequenas da mistura de corantes deve iluminar oespaço extracelular e revelar um conjunto denso de corpos celulares circulares como sombras escuras. </li><li> Para carregar os corpos celulares neuronais em uma esfera de córtex 300-600 um de diâmetro, injectar a mistura de corantes para o espaço extracelular com 30-90 pulsos, cada pulso de 1,0 seg, 2-10 psi. Os impulsos de pressão não deve ser tão forte que o tecido se move. Após a injeção é completo, espere alguns minutos, retire a pipeta e objetiva. Aguarde 1 hora para permitir que a OGB-01:00 para ser totalmente absorvido pelas neurônios. </li><li> Remover a agarose utilizada para a carga de corante e lavar a câmara de gravação. Coloque uma pequena gota de agarose de 2-3% na superfície e rapidamente colocar uma lamela sobre a craniotomia. Porque os corantes fluorescentes são sensíveis à luz, evitar uma exposição excessiva do córtex a brilhante-campo ou epi-fluorescente luz. Insira um alto NA (1,0) 20x objetivo no suporte objetivo e re-centro a região cortical rotulado sob o objetivo utilizar o estágio xy. Proteger a craniotomia de extraneous fontes de luz, por exemplo, exibição de estímulo visual, usando várias camadas de material de apagão. </li></ol> 4. De uma única célula de electroporação de corantes fluorescentes <ol><li> Para estudar a morfologia dendrítica, preparar uma solução de 100 uM de Alexa Fluor 594 (diluição 1:20 em ACSF de 2 mM estoque Alexa Fluor 594). Para imagiologia funcional de um sal de OGB dendrites podem ser utilizados 16,17. </li><li> Puxar uma pipeta de cone longo com um bico de 1 fim e carregar 5 ul de corante para a pipeta. Todos os outros passos de direccionamento um domínio funcional é idêntico ao método de carregamento a granel (Figuras 1-3). Para posicionar a ponta da pipeta adjacente a uma membrana neuronal de células do corpo, monitorizar o aumento da impedância do eléctrodo e aplicar pressão baforadas de corante para iluminar o espaço extracelular e ver corpos celulares como sombras durante dois fótons de imagem. </li><li> Quando a ponta da pipeta é adjacente a uma membrana de célula neuronal corpo, use o 800A Axoporator aplicarPulsos 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms de pulso). O preenchimento imediato do neurônio com corante é facilmente visualizado com dois fótons de microscopia. Remova a pipeta e recolher imagens de alta resolução de dendrites e axónios in vivo. </li></ol>

<ol><li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li>
<li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li>
<li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li>
<li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li>
<li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17%2F18+border+in+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li>
<li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li>
<li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whose+Cortical+Column+Would+that+Be%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).</li>
<li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li>
<li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging%3A+comparison+with+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li>
<li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li>
<li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li>
<li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li>
<li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li>
<li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li>
<li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonhoeffer%2C+T+%22Brain+mapping%3A+The+Methods%22">Brain mapping: The Methods</a>. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Apresentamos um método para alvejar a rotulagem de corpos celulares neuronais (ou dendritos e axônios) na pré-determinados funcionais micro-domínios do neocórtex. A fusão de imagem do sinal óptico intrínseco com dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar quais as sinapses e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional, quer correlaciona selectividade neuronal com a localização do neurónio em um mapa funcional e o circuito neuronal componentes que a mudança com uma experiência vis...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Suporte de vida / experiência prep </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Vet Webster </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Vaporizador isoflurano </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Comentários cobertor de aquecimento regulado </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de ECG </td><td> Digicare Biomédica </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador de EEG </td><td> Sistemas AM </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor EEG </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> Ao final da expiração de CO 2 do monitor </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Otimizar a ventilação </td></tr><tr><td> Rebarbas brocas de perfuração de metal duro para osso </td><td> Henry Schein </td><td> fina (0,5 ponta mm) e grossa (1,25 dica mm) </td><td></td></tr><tr><td> Cimento para headplate / câmara </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Pó preto tinta têmpera </td><td> Sargent Arte Inc. </td><td> 22-7185 </td><td> Adicionar para cimentar a melhorar a luz blindagem e reduzir os reflexos </td></tr><tr><td> Agarose - Tipo III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Para minimizar pulsações durante sinal intrínseco e dois fótons de imagem </td></tr><tr><td> Lamela: 5 ou 8 mm de diâmetro, 0,17 mm de espessura </td><td> Precisão mundo emtrumentos </td><td> 502040, 502041 </td><td> Para minimizar pulsações durante o exame, a lamela pode ser cortado, conforme necessário </td></tr><tr><td> Curetas Brudon </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Limpeza da superfície do crânio </td></tr><tr><td> Cera de osso </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Rapidamente parar de sangrar </td></tr><tr><td> Algodão aplicador derrubado </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72308-05 </td><td> Superfície do osso limpo e seco </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Agarre camadas individuais de duração ou pia </td></tr><tr><td> Vannas Primavera Tesoura </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td> Cut dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Para parar a hemorragia na dura </td></tr><tr><td> Lanças de absorção</td><td> Belas Science Tools </td><td> 18105-01 </td><td> Absorção ultra-rápida e sem fiapos da CSF </td></tr><tr><td> Material de apagão </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Escudo craniotomia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Tingir preparação / injecção </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Verde Oregon 488 BAPTA-1 AM </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Indicador de cálcio </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífugas filtro (tamanho de poro 0,45 um) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Para remover as impurezas, antes da injecção </td></tr><tr><td> Pipeta de vidro extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro borosilicato filamentado capilar (1,5 mm de diâmetro externo) </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 1B150F-4 </td><td> Pipeta de ejeção Dye </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Para o carregamento de tinta no pipeta </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Para posicionar pipeta </td></tr><tr><td> Controlador de pressão de pulso </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Para a injecção de pressão do corante </td></tr><tr><td> Uma única célula electroporador </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Para a electroporação do corante </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrínseca imaging </td></tr><tr><td> Objetivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Intrínseca hardware / software </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> Software VDAQ é usado para geração de imagens episódica </td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de alimentação da fonte luminosa </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de luz </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> HAL 100 </td><td> A intensidade da luz na superfície cortical é de 3-5 mW </td></tr><tr><td> Filtro verde (para a imagem vascular) </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> λ = 546 nm (banda de 30 nm) </td><td> Para imagem de referência da vasculatura superfície </td></tr><tr><td> Red filtro (por sinal intrínseco) </td><td> Óptico Imaging Inc. </td><td> λ = 630 nm (banda de 30 nm) </td><td> Para a coleta de sinais intrínsecos </td></tr><tr><td> Calor filtro </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. Dois fótons de plataforma / imagem </td></tr><tr><td> Microscópio de dois fotões e software </td><td> Prairie Technologies </td><td></td><td> Veja Shen et al. 2.012 para o caminho de luz, filtros e potência do laser </td></tr><tr><td> Ti: Safira a laser </td><td> Spectra Physics- </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA; 3,5 milímetros WD) </td><td> Olimpo </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 NA objectivo é apenas usado para alinhar pipeta sobre a craniotomia (não para duas imagens de fotões) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA; 2,0 milímetros WD) </td><td> Olimpo </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 milímetros WD) </td><td> Olimpo </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Mesa de ar </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Isola preparação de vibrações externas </td></tr><tr><td> fase xy </td><td> Máquina de Mike Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Sujeito experimental e micromanipulador Sutter colocado no palco xy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Receitas </td></tr><tr><td> Líquido cefalorraquidiano artificial </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl2 (1,0 mM), CaCl2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Adição da solução de 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de micro-do neocórtex por combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

No córtex visual primário de mamíferos não roedora, os neurônios são agrupados de acordo com sua preferência por características de estímulo, tais como orientação 1-4, direção de dominância, 5-7 ocular 8,9 e 9 disparidade binocular. Seletividade orientação é a característica mais amplamente estudada e um mapa contínuo com um layout quase-periódica para orientação preferencial está presente em toda a córtex visual primário 10,11. Integrando as contribuições sinápticas, celular e rede que levam a respostas de estímulo seletivos nestes mapas funcionais requer a hibridização de técnicas de imagem que abrangem sub-mícron de milímetro escalas espaciais. Com imagem do sinal óptico intrínseco convencional, o layout geral dos mapas funcionais por toda a superfície do córtex visual pode ser determinado 12. O desenvolvimento de microscopia in vivo de dois fotões usando corantes de cálcio sensíveis permite que se determine a SYNAPTentrada IC chegar espinhas dendríticas individuais 13 ou registro de atividade simultaneamente a partir de centenas de corpos individuais de células neuronais 6,14. Consequentemente, a combinação de imagem do sinal intrínseco, com a resolução espacial sub-micron de dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar exactamente quais os segmentos dendríticas e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional no neocórtex. Aqui demonstramos um método de alto rendimento para a rápida obtenção de um mapa de orientação cortical e visando um domínio específico de micro-neste mapa funcional para rotular neurônios com corantes fluorescentes em um mamífero não roedora. Com o mesmo microscópio usado para dois fótons de imagem, primeiro gerar um mapa de orientação usando imagens de sinal óptico intrínseco. Então, vamos mostrar como alvo um domínio de micro-de interesse usando uma micropipeta carregado com corante para qualquer rótulo de uma população de corpos celulares neuronais ou etiqueta de um único neurônio de tal forma que os dendritos e axônios, espinhas são visíveis novivo. Nossos refinamentos mais métodos anteriores facilitar um exame da neuronais relações estrutura-função com sub-celular resolução no âmbito da neocorticais arquitecturas funcionais.

Para ilustrar a precisão dos nossos métodos de marcação de corantes, que alvo menor do domínio de qualquer micro-mapa funcional conhecida no neocórtex não roedor. Esparsamente pontuado em todo o mapa de orientação do córtex visual primário são singularidades. Estes ocorrem nos pontos em que todas as orientações preferidas convergem de tal modo que, em mapas de cor falsas da orientação preferida, as regiões de todo o olhar como singularidade &quot;pinwheels&quot; (Figura 2A-B). Um cata-vento por cranioto...

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

O objetivo geral deste procedimento é direcionar com precisão microdomínios em um mapa funcional para estudar a estrutura e a função dos neurônios em alta resolução. Isso é feito realizando primeiro imagens de sinal intrínseco em uma grande área do córtex para obter um mapa da característica do estímulo de interesse. O segundo passo é determinar a localização precisa no mapa que deve ser direcionada para imagens de fótons de alta resolução.Em seguida, depois de posicionar cuidadosamente a pipeta carregada com corante fluorescente, os neurônios são marcados com o marcador fluorescente. Finalmente, imagens de alta resolução para fótons de respostas ou estruturas neuronais são coletadas. Em última análise, um mapa de características de sinal intrínseco pode ser usado para encontrar uma região de interesse, como uma singularidade cata-vento de orientação que pode então ser direcionada para estudo em resolução de neurônio único.A principal vantagem deste protocolo é que se pode obter imagens do córtex em diferentes escalas espaciais usando a mesma configuração de microscópio com apenas alguns ajustes rápidos no sistema. Isso permite combinar essas técnicas para usar o mapa de sinal intr

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Este artigo apresenta uma abordagem que combina a fotostimulação com varredura a laser e gravações em célula inteira em camundongos transgênicos que expressam GFP em populações limitadas de neurônios inibitórios. A técnica permite o mapeamento extensivo e a análise quantitativa de circuitos sinápticos locais de neurônios corticais inibitórios específicos.

Mapeamento Inibitória Circuitos Neuronal por Laser Scanning fotoestimulação

Transporte retrógrado de corante fluorescente rotula uma sub-população de neurónios baseado em projecção anatómica. Axônios rotulados pode ser alvo...

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Aqui descrevemos um procedimento para tecido limpando, etiquetando fluorescente e imagens em grande escala do tecido de cérebro de rato que, desse modo, permite a visualização da organização tridimensional de tipos de células no neocórtex.

Imagem tridimensional em grande escala de organização celular no neocórtex Mouse

Quando integrada com uma placa de cabeça e um design óptico compatível com microscópios de um e dois fótons, a lente de microprisma apresenta uma vantagem significativa na medição de respostas neurais em uma coluna vertical sob diversas condições, incluindo experimentos bem controlados em estados fixos na cabeça ou tarefas comportamentais naturais em animais em movimento livre.

Imagem de Longo Prazo de Populações Neurais Identificadas Usando Microprismas em Animais em Movimento Livre e Cabeça Fixada

Esse protocolo fornece uma descrição abrangente de um método para o registro simultâneo de sinais de cálcio de neurônios e astrócitos em múltiplas regiões cerebrais relacionadas à memória e demonstra sua aplicação durante um paradigma de aprendizagem e comportamento da memória.

Um método de fotometria de fibra bicolorida para registrar a atividade dos neurônios dos astrócitos em múltiplas regiões cerebrais durante comportamentos de aprendizagem e memória

Aprenda a rotular neurônios em microdomínios funcionais do neocórtex combinando imagem de sinal intrínseco e microscopia de dois fótons. Este método permite estudar estrutura e função neuronal com alta resolução.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem (Vídeo) | JoVE Journal

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

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