Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

Pegue um camundongo transgênico anestesiado expressando proteínas fluorescentes na microglia. Prenda-o em uma estrutura estereotáxica com um estágio motorizado sob um microscópio de dois fótons.

O crânio é equipado com um tubo de metal com fundo de vidro que achata suavemente o alvéus acima da região do corno ammonis 1 ou CA1 do hipocampo, garantindo uma interface óptica clara sem

pressão excessiva no tecido subjacente.

Encha o tubo de metal com água para otimizar a transmissão óptica.

Ative o laser pulsado no comprimento de onda de excitação.

Usando fluorescência do parênquima cerebral e luz refletida do tubo de metal, ajuste o foco na região CA1.

Reposicione a cabeça do mouse para alinhar o fundo do vidro paralelo ao plano de imagem, garantindo um foco uniforme em todo o campo de visão.

Ajuste a objetiva para uma resolução ideal e observe a dinâmica microglial in vivo na região CA1.

Em seguida, imagine o giro denteado, onde a microglia fluorescente confirma a integridade do CA1.

Coloque o mouse no dispositivo de fixação da cabeça sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons e no estágio de varredura XY motorizado. Em seguida, preencha o espaço entre o fundo do vidro e a lente objetiva com água sem criar bolhas de ar. Ajuste o foco para CA1 com a orientação da fluorescência emitida pelo parênquima cerebral e a luz refletida da borda do tubo de metal, sob iluminação contínua pelo laser pulsado.

Ajuste o ângulo da cabeça do mouse inclinando o dispositivo de fixação da cabeça para que o fundo do vidro fique paralelo ao plano de imagem. Em seguida, ajuste o colar de correção da objetiva para obter a resolução mais alta em uma profundidade da estrutura alvo no CA1. Em seguida, confirme se as células fluorescentes na camada molecular do giro denteado, ou DG, a uma profundidade de 500 micrômetros do fundo do vidro, são visualizadas em todo o campo de visão. Somente no caso de uma cirurgia bem-sucedida, os sinais de DG podem ser detectados imediatamente.

Certifique-se de que a micróglia recuperou sua morfologia ramificada. Em seguida, execute imagens in vivo na camada de interesse no CA1.