Name: Difusa espectroscopia óptica para a avaliação quantitativa da Aguda de Radiação Ionizante toxicidade cutânea induzida pelo uso de um modelo de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Aprenda a usar espectroscopia óptica difusa para quantificar toxicidade cutânea induzida por radiação em modelo de camundongo. Esta técnica fornece biomarcadores objetivos para avaliar eritema agudo pós-irradiação.

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Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa concedidas à SKL pela Abbott CARO (Associação Canadense de Oncologistas de Radiação), Uro-Oncologic Radiation Awards e Alan E. Tiffin Foundation. A EK foi apoiada pela Bolsa de Pós-Graduação Frederick Banting e Charles Best Canada, pela Bolsa de Pós-Graduação Scace em Pesquisa do Câncer de Próstata e pela Bolsa de Pós-Graduação Paul Starita.

Os métodos a seguir estão em conformidade com as orientações do Comitê de Ética do Instituto de Pesquisa Sunnybrook animal Care. Sistema 1. Espectroscopia de reflectância difusa <ol><li> Recolhe espectros de reflectância difusa utilizando um computador de mão, uma sonda de fibra óptica e do sistema de aquisição de espectroscopia portátil que tenha sido previamente descrita (Kim et al. 2010) e também uma revisão na Figura 1 (e as legendas relacionados) para a completude 1,2. </li></ol> 2. Preparação de Rato Modelo de radiação aguda danos de pele <ol><li> O pedido de ratinhos de 6 semanas de idade (de preferência sem pêlo, atímicos, tais como ou SKH-1) e permitir que eles se aclimatar na instalação para animais durante uma semana antes de iniciar as experiências. Reserve pelo menos 3 ratos para um grupo de controle não irradiado e 5 ratos para um grupo irradiado. </li><li> Antes de base medições DOS e irradiação, rotular os ratos usando socos de ouvido ou permanente marcador markings na cauda. Se os ratos não são nu, remover os pêlos em uns 2 cm por 2 cm pedaço de pele flanco, mas isso pode causar irritação na pele. </li></ol> 3. difusa Aquisição de Dados espectroscopia óptica <ol><li> Ligue a fonte de alimentação para o sistema eletrônico. </li><li> Para a pele do rato, definir os parâmetros de sinal para o software de aquisição, digitando em 25 ms para tempo de coleta, 25 para médias de sinal e de 1 para a largura de filtro de vagão. Estes parâmetros oferecer um equilíbrio razoável entre o tempo de aquisição e de sinal para ruído. </li><li> Usando software de aquisição de costume programado, adquirem automaticamente uma leitura de fundo, R bg (LED desligado) e reflectância difusa em duas distâncias de separação fonte de detectores, meas R (260 mm, 520 mm), clicando no botão &quot;Adquirir&quot;. O tempo de aquisição total é de aproximadamente 2 segundos. </li><li> Desligue todas as luzes da sala fluorescentes pressionando o interruptor de luz da sala antes de efectuar medições. NOTA: fluoresluz da sala ent interferir com o sinal detectado (estas luzes produzem uma intensidade de luz variável com o tempo e, portanto, é difícil para subtrair como um sinal de fundo). Embora as lâmpadas incandescentes podem ser empregues manter as luzes a uma distância a partir da sonda DOS para evitar altos níveis de fundo (e pobre sinal ao ruído). </li></ol> 4. Medidas de anestesia Animal e Base DOS <ol><li> Prepare o aparelho de anestesia, garantindo que todas as conexões são de nível isoflurano intacta e líquido é adequado. Use uma câmara de indução da anestesia com um tubo ligado e cone do nariz que pode ser gravada para baixo a uma superfície esterilizada, almofadado a uma distância confortável da sonda DOS. </li><li> Anestesiar uma gaiola de ratinhos de cada vez na câmara de indução através da indução com 4% de isoflurano durante 30 seg. Reduzir a quantidade de isoflurano a 2% para o próximo 2 min. Verifique se o mouse está anestesiado, observando nenhuma resposta de beliscar um dedo do pé do membro posterior. </li><li> Rapidamentemover um rato para o DOS área de sondagem esterilizado, coloque-o de lado, apertar seu focinho para o cone do nariz e abrir o tubo de nariz cone para o fluxo de anestesia (2% de isoflurano). NOTA: Se o processo demora mais do que 1-2 min, aplique pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura. </li><li> Antes de adquirir medições da pele do rato, esterilizar a sonda, limpando com 70% de etanol. Não esterilizar a pele. </li><li> Coloque a sonda suavemente sobre a pele do flanco certificando-se de evitar a dispersão da vasculatura local. Mantenha a sonda à mão durante o período da medição. </li><li> Adquirir dados de reflectância por sondagem de uma área da pele do flanco de cerca de 2 cm por 2 cm de altura (a área a ser irradiada), seguindo a formação de 5-ponto numa matriz. Mantenha esse padrão, a área, a pressão sondagem sonda e lateral do corpo (esquerda ou direita) consistente para todas as medições posteriores. NOTA: A varredura completa leva aproximadamente 60 seg. pressão da sonda deve ser apenas o suficiente para obter uma varredura sem dispersar lvasculatura ocal. </li><li> Mova o rato em uma gaiola de recuperação, e mover a próxima seta do mouse sobre a área de sondagem do DOS. Repita os passos 4,2-4,6 até que todos os ratinhos foram medidos. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li></ol> 5. irradiação animal NOTA: Este protocolo requer a utilização de um irradiador, e preparação animal pode necessitar de ser ajustada para satisfazer as necessidades do dispositivo irradiador. Durante a irradiação, apenas a pequena área da pele do flanco deve ser exposta ao feixe de radiação. O irradiador deve estar localizado em uma instalação estéril e adequada esterilização gaiola deve ser observada quando da devolução ratos para a sua área de habitação estéril. <ol><li> Prepara-se o aparelho de anestesia (tal como nos passos 4.1 - 4.2) e anestesiar um rato de cada vez na câmara de indução antes preparando-o para a irradiação. </li><li> Remover o rato da câmara de indução, genTLY apertar a fita da pele flanco e coloque sobre e abaixo da pele esticada, formando uma aba. </li><li> Colocar o rato em uma fase de plexiglass e cobrir o corpo com um gabarito de chumbo personalizado (um desenho de trabalho é uma caixa rectangular com o fundo e, pelo menos, uma extremidade aberta, juntamente com uma janela lateral para permitir que o flanco da pele a ser puxado através). Puxe a aba de pele através da janela do gabarito e gentilmente fita a aba para o palco. NOTA: O gabarito chumbo personalizado é pequeno o suficiente para imobilizar o mouse. Se o gabarito personalizado não imobilizar completamente o rato, em seguida, usar limitadores adicionais e / ou administrar a cetamina (80-100 mg / kg) e xilazina (10 - 12,5 mg / kg) via injecção intraperitoneal de manter o rato imobilizado ao longo de toda a irradiação procedimento. </li><li> Coloque a fase de plexiglass com o gabarito e mouse para o irradiador. Determinar as configurações (distância da pele a partir da fonte de raios-x, voltagem, amperagem e duração) e entregar a dose desejada (por exemplo, 11 cm a partir de um kVp X- 160ray fonte para 2,5 min com 6,3 mA). NOTA: Tenha cuidado com a fonte de raios-x, seguindo as diretrizes de uso da máquina para evitar queimaduras e danos ao DNA. NOTA: os ratos pelados atímicos desenvolver descamação úmida em torno de 14 dias após a irradiação em resposta a 35 Gy, mas apenas pequenas descamação irregular com 17 Gy. </li><li> Leve o aparelho e mouse para fora do irradiador, remova a blindagem, retire a fita e colocá-lo em uma gaiola de recuperação individual. Devolver o mouse para sua gaiola compartilhada normal depois que se recuperou da anestesia. Repita os passos de 5,2-5,4 para todos os ratos, e realizar uma operação simulada em ratos controle. </li><li> Após a irradiação, abrigar os animais em suas condições normais. Se o comportamento anormal se desenvolve (por exemplo, postura curvada, o que pode significar dor), consultar um veterinário para diagnosticar o problema. alívio da dor podem incluir a administração de 0,1 mg / kg de buprenorfina por via subcutânea ou conforme indicado pelo médico veterinário. Se a perda de peso superior a 20% do normal bOdy massa, casa-lo separadamente em sua própria gaiola e fornecer alimentos de alta de nutrientes. </li></ol> 6. Medidas DOS de acompanhamento <ol><li> Monitorar e medir pele intensidade da reação utilizando a técnica quantitativa DOS. Inspeção visual das alterações cutâneas e trabalhos anteriores sugerem que grandes mudanças nos parâmetros do DOS pode ser esperado (em relação à linha de base) em torno de 6 - 12 dias após a irradiação 3,4. No entanto, uma vez que mudanças significativas podem ocorrer ainda mais cedo ou mais tarde, dependendo do modelo, outros pontos de tempo de medição pode ser útil para investigar. </li><li> Configurar equipamentos e calibrações descritos na secção 3.Prepare o aparelho de anestesia e adquirir medições DOS conforme descrito na seção 4 DOS. </li></ol> 7. Pós-aquisição Processing NOTA: Todas as etapas no seguinte seção são executados usando um programa personalizado criado em um ambiente de software de alto desempenho. convento de nomenclatura padronizadaiões para cada ficheiro de aquisição espectral são utilizadas para permitir o processamento em lote. Todos os passos são ilustrados na Figura 2. <ol><li> Subtrair a linha de base (nível de ruído) de todo o espectro medido, incluindo a leitura de fundo. </li><li> Subtrair a leitura de fundo, R bg (LED desligado), obtido no Passo 3.3 a partir do espectro de medição, meas R. NOTA: Para o restante deste artigo todos os espectros estão a ser assumida piso de ruído de fundo e subtraído e referida como R corr. </li><li> Converter R corr a reflectância absoluta, R ABS, tal como descrito em referências 1,2 na Secção 1. <ol><li> Obter medições de reflectância relativos, Rrel, em Intralipid 20% a fantasmas (Fresenius Kabi, Suécia) com fantasmas aumentando 3% fracções alíquotas de até 48% (ou seja, 3%, 6%, 9%, ..., 48%) e criar de lote de Rrel versus concentração de Intralipid. </li><li> Gerar uma trama absoluta de abs R comparação &amp;# 956; s &#39;usando a equação de difusão de reflectância 14. </li><li> Combinar o pico de ambas as curvas e ajustar o eixo x Rrel para coincidir com o eixo X-R abs. </li><li> A uma dada separação de comprimento de onda e fonte de detector, dimensionar o eixo y usando: <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq2.jpg" /> NOTA: Na seção seguinte, toda instalação de medições se referem a R abs. </li></ol></li></ol> Fitting 8. Dados espectro Observação: A seção seguinte descreve a teoria ea algoritmo de ajuste utilizada para extrair parâmetros funcionais da pele de camundongos. Por toda a teoria utilizada, consulte os seguintes artigos 14-18 e referências nele contidas. Todas as equações são assumidos para ser programado em um ambiente de software científico de ponta (contendo módulos pré-programada) comumente usado em física ou engenharia laboratórios. <ol><li> Programar uma função que descreve o umespectro bsorption, um u (λ) da pele como a soma de cromóforos individuais relevantes na gama espectral de interesse utilizando a equação: <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq4.jpg" /> Aqui, H b é a concentração total de hemoglobina (g / L), enquanto StO 2 é a saturação de oxigénio sem unidade variando de 0 a 1. </li><li> Obter oxi, <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq5.jpg" /> , E desoxi, <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq6.jpg" /> , Espectros de hemoglobina (armazenados como ficheiros de texto) a partir da recolha em linha de Prahl 19. </li><li> Programar uma função que descreve o espectro de espalhamento de pele, <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573eq7.jpg" /> , Utilizando-se uma dependência da lei de potência, em que A (cm-1) é o valor de μ s &#39;na λ o = 1 nm e K é um factor de potência média dependente16. </li><li> Programa de uma função matemática para o modelo para a frente de reflectância difusa com base em equações de referência 14, que incorporam as equações espectrais de Passos 8,2-8,3 para a função de modelo para a frente (ou seja, R (r, u a (λ), u s &#39;(λ )) = R (r, H b, STO 2, A, K). NOTA: Embora existam vários modelos, a equação teoria da difusão de estado estacionário fornece uma descrição simples e precisa da distribuição de luz no tecido. </li><li> Programa de uma função que praças a diferença entre a frente modelada espectros de reflectância da Seção 8.4 e os espectros de reflectância medido. </li><li> Iterativamente mudar H b, STO 2, A e k até o mínimo função praças diferença na Seção 8.5 é menor. lsqcurvefit do Matlab pode ser utilizado para efectuar este passo automaticamente. </li><li> REPEAt passos 8,5-8,6 para obter parâmetros DOS (H b, STO 2, A e k) para todos os conjuntos de dados de reflectância medidos. </li><li> Traçar a mudança relativa no parâmetro DOS com a medição da linha de base única correspondente usando a média de conjunto de 3 de cada mouse - 5 medições pontuais sonda normalizados. Estes gráficos são criados usando o comando plot do MatLab. </li></ol> 9. Visual radiação Dermatite Período Scoring <ol><li> Monitorar e marcar a pele intensidade da reação utilizando uma escala de classificação qualitativa (ver Douglas e Fowler escala de classificação 20) após irradiação a cada 48 h (pode-se também observar mudanças 3 - 24 horas após irradiação). Dois investigadores cegos são ideais. Aquisição de fotografias com uma câmara e escala de referência de mão (ou seja, régua) pode ajudar com avaliações. </li><li> NOTA: Marcar a pele a cada dois dias após a irradiação pode ajudar a determinar os tempos ideais de medição DOS for o modelo. pontuação mais frequente pode produzir dados importantes, dependendo do modelo e da pesquisa pergunta. </li><li> Traça-se a mediana de cada grupo em cada ponto de tempo. Comparar os grupos em pontos de tempo específicos ou áreas global mediana sob cada curva. </li><li> Depois de ratinhos foram seguidos até ao ponto de cicatrização da pele que é desejado (por exemplo, 4 semanas), a eutanásia dos ratos através de um método adequado (aprovada). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Uma abordagem DOS para avaliar quantitativamente toxicidade cutânea de radiação utilizando biomarcadores ópticos foi apresentado. sistemas de pontuação visuais de toxicidade de pele exigem formação especializada e, mesmo assim, são propensas a variabilidade inter-observador e subjetividade. O sistema e análise de software DOS é simples de usar, requer um mínimo de treinamento e retorna parâmetros funcionais objetivos para interpretar alterações fisiológicas na pele. Além disso, em vez de descrever a aparência de uma lesão da pele, como parâmetro único, DOS fornece uma variedade de informações em forma espectral, propriedades ópticas e funcionais / parâmetros microestruturais que oferecem um maior grau de sensibilidade e especificidade não disponíveis em métodos de pontuação qualitativos actuais. Os pontos 1 e 7 de destacar as principais etapas de processamento para a obtenção de dados espectrais absolutos que podem ser utilizados para a montagem quantitativa de biomarcadores ópticos. Antecedentes e subtracção da linha de base são vitais para permitir que o usuário executeas medições do DOS sob condições normais de iluminação. Secção 8 proporciona os modelos e as equações necessárias para descrever ratinhos atímicos antes e após irradiação com raios-X necessárias. Aqui, a escolha de absorventes apropriados é vital para uma descrição precisa do espectro medido. É aconselhável que o usuário investigar minuciosamente na literatura os absorventes principais que dominam o intervalo e tecido de juro utilizada em um determinado estudo prévio para a construção de um modelo de ajustamento biomarcador óptica de comprimento de onda. Finalmente, as secções 3-5 descrevem o tratamento dos ratinhos atímicos durante a aquisição DOS. Para evitar prejudicar a vascularização local, usar a força suave para colocar a sonda DOS na superfície da pele do rato. Apesar de ser relativamente barata em comparação com sistemas de câmara de hiper 3,4, uma clara limitação do DOS abordagem descrita é a utilização de uma sonda de medição de ponto de reflectância difusa. Este necessidades geometria de reflectância contato suave com a pele etem o potencial de apresentar incerteza de medida por dispersão da vasculatura, se a pressão da sonda-pele consistente não é empregue. projetos futuros da sonda DOS pode incorporar um sensor de pressão para manter resultados consistentes. Além disso, embora o uso de separação de fontes detector estreita (&lt;2-3 mm) permite a profundidades de sondagem ópticos específicos à superfície da pele, a especificidade melhorada vem em uma perda de resolução espacial em relação à imagem 2D hiperespectral. Para minimizar essa limitação, uma varredura quadrante de 5 pontos que capta o volume irradiado geral foi empregado. Apesar da falta de resolução espacial, o trabalho anterior em ratos 5 demonstrou a capacidade de biomarcadores ópticos, calculados sobre uma área escassa para diferenciar não só pele irradiada e não irradiado, mas também o impacto da pele poupadores de drogas intervencionistas, como Vasculotide 6. Deve notar-se que, enquanto a concepção global do sistema pode ser modificado para a pele diferente<html> modelos, a forma subjacente espectros de base e de espalhamento podem precisar de ser optimizada. Especificamente, enquanto oxi- e desoxi-Hb bem descrever um modelo de ratinho atímico, a aplicação do mesmo modelo de pele mais escura pode exigir a adição de melanina para a montagem óptima. Além disso, a extensão da largura de banda para DOS maiores comprimentos de onda&gt; 950 nm necessitaria da adição de água, o qual domina a comprimentos de onda mais elevados. Além disso, os modelos animais com diferentes espessuras de pele podem exigir uma fonte de separação de detectores diferente para optimizar a sensibilidade profundidade. Por último, o recurso sem pêlos faz algoritmos simples. Embora os modelos não-calvos pode ser ótimo para determinadas questões de pesquisa, que vai exigir a remoção do cabelo antes das medições do DOS, e irritação da pele a partir deste processo podem afetar os resultados. Para a pesquisa, onde a função imunológica total é fundamental, um rato sem pêlo imunocompetente (por exemplo, SKH-1) pode servir como um modelo melhor devido à sua natureza eutímicos. ent &quot;&gt; Considerações importantes para as medições da sonda DOS são consistentes RT e estimativa da área irradiada. flutuações de temperatura podem afetar o tecido Hb e Sto 2 níveis. Medindo um grupo de 3 animais não irradiados em cada tempo de coleta de dados pode servir como uma base para que flutuações ambientais não intencionais nos valores dos parâmetros pode ser normalizada. Além disso, a área irradiada pode ser difícil de estimar (se preparações de aba de pele não eram consistentes) antes que os danos começa a manifestar-se visualmente por volta do dia 5 (40 Gy). Se usando o marcador permanente preto para dot os limites da pele exposta a radiação, evitar a utilização excessiva de tinta para evitar que manchas de tinta, o que pode comprometer leituras. Uma característica adicional do sistema é a capacidade de absorção de separar as propriedades de espalhamento. Enquanto sistemas de imagens hiperespectrais alternativos também fornecem a capacidade de monitorar oxiHb e concentração de Hb, a geometria do espaço livre i imagem hiperespectral<html> é incapaz de resolver mudanças dispersão. Esta limitação pode resultar em imprecisões no voltou oxiHb, Hb e Sto 2 parâmetros, se mudanças significativas na dispersão ocorrer devido a eritema (vermelhidão). Além disso, o monitoramento de mudanças espalhamento usando DOS pode fornecer biomarcadores ópticos adicionais para a avaliação eritema. Como mostrado na Figura 6, os resultados iniciais de Yohan et al. (2014) indicam que A e k demonstram uma tendência temporal, após radiação ionizante que não se correlacionam com as tendências observadas de outros métodos alternativos, tais como sistemas de pontuação visual. Isto indica que as alterações de dispersão não manifestar de um modo visualmente descritiva e pode, de facto, estar a descrever um processo biológico separada. Portanto, em comparação com métodos alternativos, DOS fornece uma alta resolução para mudanças de espalhamento superficial, uma avenida para investigar biomarcadores de dano da pele novos que podem ser separadas das habituais medidas baseadas em Hb. jove_content &quot;&gt; Embora o nosso modelo emprega uma grande dose única de radiação (em vez de múltiplas doses fraccionadas pequenas que são utilizados na prática clínica), esta imita a patofisiologia da radiotoxicidade pele humana aguda 21. Prevê-se que com uma maior optimização, DOS pode fornecer uma abordagem quantitativa para a pontuação automatizado e padronizado de reacções cutâneas de radiação induzida. Depois de dominar esta técnica, aplicações futuras podem incluir monitoramento diferenças entre terapêutica preservação de pele (por exemplo, comparando os níveis de oxiHb entre um controle e tratamento experimental para radioproteção pele, ou para a promoção de cicatrização de feridas ). Enquanto ideal para o rastreio de fármacos de alto rendimento em modelos animais, o sistema dOS é potencialmente adaptável para o ambiente clínico, devido a facilidade de utilização e a capacidade de medir, em condições normais de iluminação. neste caso, o desenho da sonda podem requerer modificações menores com separações optode um pouco maior para dar contao aumento da espessura da pele humana. Um sistema DOS clínica iria permitir uma avaliação on-line de terapias de intervenção que poderiam minimizar reacções cutâneas dolorosas e melhorar o conforto do paciente e conformidade. No futuro, pode ser interessante para expandir quantificação DOS para as características de radiação induzida por danos crônica da pele (por exemplo, fibrose).

melhorias tecnológicas em radioterapia (RT) o planejamento e entrega agora permitem doses terapêuticas altamente isolantes a serem entregues para a região do tumor, poupando simultaneamente estruturas normais circundantes. No entanto, as toxicidades agudas graves e por vezes são inevitáveis ​​quando o alvo altas doses está em estreita proximidade com a pele. Se for grave o suficiente, os danos tecido normal resultante pode afetar negativamente o resultado do tratamento de RT e qualidade de vida do paciente 1,2. Apesar das consequências prejudiciais, a presença da administração de eritema cutâneo radiação continua a ser inespecíficos, empregando cremes ou pomadas que ignoram os mecanismos biológicos subjacentes que levam a danos. Estas abordagens baseiam-se em minimizar os sintomas e não a causa. Além disso, o calendário ea administração de terapias de intervenção é complicada pela natureza qualitativa e subjetiva da avaliação radiação lesão da pele. Enquanto vários reconhecidoorganizações (RTOG, EORTC) fornecem recomendações de classificação visual, instituições variam em sua escolha de pontuação preferida, obscurecendo, assim, as comparações de toxicidades normais de tecidos para fins de meta-análises. Além disso, tais sistemas de classificação são grosseiros e propenso a variabilidade inter-observador, de modo que as diferenças na radiação gravidade da lesão pode ser imperceptível nos estudos que avaliam estratégias de redução da toxicidade. Em vez de descrever visualmente o grau do eritema em pele irradiada, uma abordagem alternativa é a medição de parâmetros que descrevem quantitativamente as alterações fisiológicas subjacentes que ocorrem no órgão. Hemoglobina no sangue (MP), a saturação de oxigénio do tecido (STO 2) ou os níveis de hemoglobina oxigenada (oxiHb) têm sido utilizados como substitutos para o eritema induzido por irradiação nos ratos 3-6. Após a irradiação, os níveis totais de Hb sofrer flutuações, mas oxiHb ou StO 2 submetidos a uma característica início de subida acentuada, seguida por umcair e outra 3,6 subida mais persistente. Quando irritantes são utilizados para induzir eritema da pele, os níveis de oxiHb vasculares correlacionam directamente com a gravidade do eritema local e inflamação 7. Difuso espectroscopia óptica (DOS) emprega luz do infravermelho próximo para proporcionar informação funcional sobre os componentes bioquímicos e microestruturais dos componentes tecidos vitais. Esta tecnologia óptica quantitativa, não-invasiva oferece um método para medir a vasodilatação induzida por citocina em vasos sanguíneos que ocorrem durante o eritema através substitutos funcionais da concentração de Hb e StO 2. Estudos recentes comparando parâmetros medidos DOS com métodos de pontuação clínicos controlados 8-11 indicam o potencial da técnica para superar as limitações inerentes à classificação actual sistemas. Aqui nós descrevemos, um sistema DOS in-house portátil, que emprega substitutos funcionais para quantitativamente detecting diferenças de toxicidade cutânea induzida por radiação em um modelo de rato pré-clínica 5. A plataforma descrito pode fornecer um meio de pontuação eritema padronizado com alta sensibilidade para a detecção precoce e diferenciação sutil de resposta à droga intervencionista. Além disso, apenas com pequenas adaptações, a instrumentação podem, eventualmente, ser utilizados clinicamente para o controlo à cabeceira em tempo real.

<table><tbody><tr><td>Camundongos nus</td><td>por exemplo, Charles River</td><td>Nu atímico Crl:NU(NCr)-Foxn1nu, ou nu imunocompetente Crl:SKH1-Hrhr</td><td></td></tr><tr><td>Irradiador de pequenos animais&nbsp;</td><td>por exemplo, Faxitron X-Ray Corp.</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia animal&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Se estiver usando máquina vaporizadora de isoflurano com câmara de indução, precisa de tubo e cone de nariz.</td></tr><tr><td>Gabarito de chumbo e estágio de plexiglass</td><td>Feito sob medida</td><td></td><td>Se o dispositivo irradiador expõe todo o corpo do animal à radiação, a blindagem de chumbo deve ser usada para expor apenas a aba da pele.</td></tr><tr><td>Fita médica&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Marcador permanente/perfurador de</td><td></td><td></td><td></td>orelha</tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks Inc., Natick, MA</td><td></td><td>Com StatisticsToolbox&nbsp;</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments, Vaudreuil-Dorian,</td> sistema <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> QB DOS <tr><td>Multiplexador óptico</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Modelo MPM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Modelo S200</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz branca</td><td>Ocean Optics, Dunedin, FL</td><td>Modelo LS-1</td><td></td></tr><tr><td>Intralipid-20%</td><td>Kabi Pharmacia, Nova York, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Padrão de refletância</td><td>INO, Quebec City, QB</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

difusa espectroscopia óptica para a avaliação quantitativa da aguda de radiação ionizante toxicidade cutânea induzida pelo uso de um modelo de rato

Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model

As toxicidades cutâneas agudas da radiação ionizante (IR) são um efeito colateral comum dos cursos terapêuticos de radioterapia de feixe externo (RT) e afetam negativamente a qualidade de vida do paciente e a sobrevida a longo prazo. Os avanços na compreensão das vias biológicas associadas às toxicidades normais dos tecidos permitiram o desenvolvimento de medicamentos intervencionistas, no entanto, os estudos de resposta atuais são limitados pela falta de métricas quantitativas para avaliar a gravidade das reações cutâneas. Aqui apresentamos uma abordagem espectroscópica óptica difusa (DOS) que fornece biomarcadores ópticos quantitativos da resposta da pele à radiação. Descrevemos o projeto de instrumentação do sistema DOS, bem como o algoritmo de inversão para extrair os parâmetros ópticos. Finalmente, para demonstrar a utilidade clínica, apresentamos dados representativos de um modelo pré-clínico de camundongo de eritema induzido por radiação e comparamos os resultados com uma pontuação visual comumente empregada. O método DOS descrito oferece uma avaliação objetiva e de alto rendimento da toxicidade da pele por meio da resposta funcional que é traduzível para o ambiente clínico.

A técnica de reflectância DOS fornece uma alternativa objetivo de métodos qualitativos tradicionais de avaliação de radiação induzida por toxicidade cutânea. alterações visuais na aparência da pele seguintes doses tóxicas de radiação presente como alterações em ambas a grandeza e forma dos espectros de reflectância medida. Ambos estão relacionados com alterações funcionais na microestrutura celular subjacente eo estado de tecido fisiológico. Nesta seção, os resultados representativos do trabalho publicado anteriormente por Yohan et al. 2014 5 são revistos. A Figura 3 (esquerda) mostram espectros (finas linhas azuis) representativos medido a uma fonte mm de separação de 260 em um modelo de rato atímicos de eritema cutâneo 6 dias após 40 Gy de irradiação. Em comparação com pré-irradiação (Figura 3, painel da direita), diferenças na forma espectral em ~ 550-650 nm são observados, likEly devido a um aumento da hemoglobina oxigenada. Um pequeno aumento na reflectância absoluta também é visto que está correlacionada com um aumento na potência de espalhamento do tecido. O espectro observado no dia 6 após a irradiação correlacionada com uma pontuação visual da pele de 0,75. Uma avaliação das mudanças de reflectância de irradiação pós em selecionar os comprimentos de onda não faz uso do espectro de reflectância completo e também carrega o potencial problema de sensibilidade de ruído. No entanto, a montagem do espectro completo permite que os dados de todo o conjunto a ser convertido em biomarcadores ópticos intuitivos (H B, STO 2). A Figura 3 mostra os ataques resultantes (linha verde sólido) dos dados medidos (fina linha ruidosa) usando as equações apresentadas na Seção é observado 4. Excelente acordo, confirmando que a escolha de cromóforos base e forma espalhando descrever adequadamente o modelo de pele de rato. <p class="jove_content"fo:. mantê-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Devido aos não-invasivo e auto-calibrar natureza do sistema DOS, as medições podem ser convenientemente realizadas ao longo de vários dias em diferentes condições de iluminação A Figura 4 mostra mudanças relativas de pele StO 2 para vários pontos temporais (6, 9, 12 dias) em uma coorte irradiado do rato (n = 8), enquanto a Figura 5 mostra a pontuação de reação da pele qualitativos correspondentes. Um aumento progressivo no sótão 2 observa-se que é estatisticamente diferente em comparação com os valores pré-irradiação mais de todos os 3 dias (p &lt;0,05). Estas tendências refletem os aumentos observados visualmente em termos de gravidade danos da pele que o pico no dia 12 (pontuação média de ~ 3) demonstrando o potencial de sótão 2 como um substituto de pontuação visual (Figura 5). Deve notar-se que não há alterações estatisticamente significativas foram observadas para qualquer um dos marcadores ópticos para a retornadosnão irradiado grupo de controlo (n = 3) ao longo dos 12 dias medidos (dados não mostrados). Alterações em A e K também pode ser monitorizada ao longo do tempo (Figura 6), e estes indicam que as propriedades de dispersão da pele estão a mudar em resposta à radiação. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig1.jpg" /> Figura 1. DOS instrumentação. (A) Representação esquemática da geometria de medição de reflectância difusa (B) sonda de fibra óptica:. A sonda óptica é constituído por um conjunto linear de 200 um núcleo de fibras ópticas que são empacotados em uma agulha de metal 18 G e 260 uM espaçadas aparte. Duas fibras de base são acoplados a dois diodos emissores de luz de banda larga, enquanto uma fibra de detecção está ligado a um espectrómetro óptico. Ao transformar sequencialmente em cada uma das fontes, o espectrómetro pode recolher reflectância difusa, a distâncias de 260 ^ m e520 uM de cada uma das fibras da fonte (C) SISTEMA DOS completa, incluindo computador portátil, a caixa e sonda óptica de fibra óptica anexado:. Um programa de aquisição de dados automatizado é utilizado para conduzir a recolha sequencial de espectros. Os componentes eletrônicos estão alojados em uma caixa de aquisição que se conecta à sonda de fibra óptica via conectores SMA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig2.jpg" /> .. A Figura 2 processamento espectral Todas as escalas do eixo X estão na nm: (A) os espectros relativa bruto, a linha de base é a de ler aproximadamente entre 900 - 1000 nm e, aproximadamente, igual ao sinal de fundo (B) leitura de fundo Relativa (C.. ) Antecedentes e base subtraído s relativos<html> pectra. (D) Absolutely calibrado espectro seguinte escalonamento de espectros processados ​​mostrado em (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig3.jpg" /> Figura 3. típica branco espectros de luz reflectância (à direita) da pele do rato 6 dias não irradiadas (esquerda) e irradiadas postar irradiação. Excelente acordo entre a medição (azul barulhento) e ataques (verde sólido) foram tipicamente observadas. Duas principais diferenças foram observadas entre os dois grupos: 1) um aumento global de reflectância absoluta e 2) uma mudança distinta em forma espectral entre 550-600 nm. Com a permissão do Yohan et al. 2014 5.&gt; Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig4.jpg" /> Figura 4. Mudança na fração oxigenação da pele do rato seguinte 40 Gy irradiação. A diferença média da linha de base normalizada entre os dois grupos (por mouse) é significativo para Days 6 (Quadro 1), 9 (Caixa 2) e 12 (Quadro 3 ). Com a permissão do Yohan et al. 2014 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig5.jpg" /> Figura 5. Média de pele qualitativa reações pontuação (n = 8) como uma função dos dias seguintes 40 Gy irradiado pele de camundongos. Adaptado de Yohan et al. 2014 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53573/53573fig6.jpg" /> Figura 6. mudanças relativas em A e K da pele do rato seguintes 40 Gy irradiação nos dias 6 (Quadro 1), 9 (Caixa 2) e 12 (Quadro 3). A mudança na A (lado esquerdo) e k (lado direito) no dia 6 (Box 1, lados direito e esquerdo) foi encontrado para ser significativa (p &lt;0,026). Com a permissão do Yohan et al. 2014 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53573/53573fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos uma abordagem espectroscópica óptica difusa (DOS) que fornece biomarcadores ópticos quantitativos da resposta da pele à radiação. Descrevemos o projeto de instrumentação DOS, algoritmos de extração de parâmetros ópticos e os procedimentos de manuseio de animais necessários para produzir dados representativos de um modelo pré-clínico de camundongo de eritema induzido por radiação.

Difusa espectroscopia óptica para a avaliação quantitativa da Aguda de Radiação Ionizante toxicidade cutânea induzida pelo uso de um modelo de rato

Acute skin toxicities from ionizing radiation (IR) are a common side effect from therapeutic courses of external beam radiation therapy (RT) and ...

O objetivo geral desta técnica de espectroscopia óptica difusa é desenvolver um biomarcador quantitativo para descrever a eritema aguda induzida por radiação. Este método pode ser utilizado na área da radioterapia como um biomarcador preditivo para identificar pacientes com risco de toxicidade cutânea grave por radiação. Assim, a principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma métrica objetiva e sistemática para quantificar toxicidades cutâneas por radiação.Eu demonstrarei a técnica de espectroscopia óptica difusa, e Elina, uma pesquisadora do Laboratório Loo, manipulará os camundongos. Ligue a eletrônica e aguarde o sistema inicializar. Em seguida, desligue todas as luzes fluorescentes da sala e posicione luzes incandescentes a uma distância do dispositivo de medição para fornecer alguma iluminação de trabalho.Em seguida, configure o instrumento para realizar medições na pele de camundongo. Defina os parâmetros do sinal conforme a seguir. Ajuste o tempo de aquisição para 25 milissegundos, defina a média dos sinais para 25 e ajuste a largura do filtro boxcar para um.Esses parâmetros oferecem um equilíbrio razoável entre o tempo de aquisição e a relação sinal-ruído. Em seguida, utilizando o software personalizado de aquisição programado, adquira automaticamente uma leitura de fundo com o LED desligado. Depois, adquira uma leitura com refletância difusa em duas distâncias de separação entre fonte e detector.Realize uma medição em 260 micrômetros e a segunda em 520 micrômetros. O tempo total de aquisição deve ser de aproximadamente dois segundos. Após anestesiar o camundongo, mova-o para a área esterilizada de sondagem DOS.Posicione-o de lado e fixe seu focinho a um cone nasal que fornece gás isoflurano a 2% para manter a anestesia. Agora, esterilize a sonda com etanol a 70%, mas não tente esterilizar a pele. Segure suavemente a sonda esterilizada contra a pele do flanco.Não pressione demais, pois a vasculatura local não deve ser dispersa pela pressão da sonda. Enquanto segura a sonda, adquira dados de refletância ao longo da área quadrada de dois centímetros que será irradiada. Colete os dados em uma formação de cinco pontos, como em uma face de dado.Mantenha esse padrão e pressão de sondagem consistentes em todas as medições subsequentes. Após realizar as medições, coloque o camundongo em uma gaiola de recuperação. Enquanto o camundongo se recupera, repita o procedimento no próximo camundongo.Este procedimento é adaptado ao irradiador disponível. Ajuste conforme necessário para irradiar uma pequena seção da pele. Após anestesiar um camundongo, pinçe suavemente um pouco da pele em seu flanco e fixe a pele esticada com fita adesiva para formar uma aba.Em seguida, posicione o camundongo sobre uma plataforma de Plexiglass e cubra seu corpo com uma guia de chumbo personalizada. Utilize uma caixa de chumbo acessível por dois lados e que possua uma janela para a pele ser irradiada. Em seguida, puxe a dobra da pele através da janela da guia e fixe-a à plataforma com fita adesiva.Se o camundongo não estiver imobilizado pelo suporte, aplique uma injeção anestésica. Em seguida, coloque a platina com o suporte e o camundongo no irradiador. Calcule a dose de irradiação necessária.Por exemplo, uma fonte de raios X com pico de tensão de 160 quilovolts posicionada a 11 centímetros de distância irradiaria adequadamente a pele operando em 6,3 miliampères por 2,5 minutos. Em seguida, aplique a dose calculada. Após a administração da dose ao animal, devolva-o a uma gaiola de recuperação.Uma vez recuperado da anestesia, devolva o camundongo à sua gaiola normal de convivência compartilhada. Os camundongos foram irradiados e medidos conforme descrito. Antes da irradiação, um espectro de linha de base foi obtido com uma separação da fonte de 260 mícrons em um modelo de camundongo atímico de pele.A linha verde grossa mostra um ajuste matemático da linha azul fina. Em comparação com medições feitas seis dias após uma irradiação de 40 gray, foram observadas diferenças na forma espectral entre 550 e 600 nanômetros, provavelmente devido a um aumento na hemoglobina oxigenada. Também foi observado um pequeno aumento na refletância absoluta, que pode estar correlacionado a um aumento na capacidade de espalhamento do tecido.Os dados ajustados fornecem biomarcadores ópticos quantitativos que podem ser rastreados como uma função do tempo após a irradiação. Por exemplo, as medições de saturação de oxigênio tecidual aumentaram progressivamente após a irradiação. Esses dados quantitativos correlacionaram-se com um grau visual da toxicidade cutânea, que também aumentou progressivamente após a irradiação.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como empregar a espectroscopia óptica difusa para a pontuação quantitativa das toxicidades cutâneas causadas pela radiação. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois ou três minutos, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante pressionar suavemente a sonda de DOS para evitar a dispersão da vasculatura.Essa técnica pode ser utilizada na área da radioterapia como um meio de associar parâmetros fisiológicos na descrição da resposta de tecidos normais à radiação.

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