Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV
12 de janeiro de 2016
Este artigo descreve um método pelo qual a arquitetura vascular no cérebro pode ser quantificada usando microscopia de dois fótons in vivo e ex vivo.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar alterações nas redes de capilares corticais após exposição prolongada à virotoxina do HIV, tat. Este método pode auxiliar na análise de alterações-chave na morfologia dos capilares corticais que podem contribuir para a patogênese dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a quantificação fisiologicamente precisa de múltiplos parâmetros morfológicos capilares.
Embora este método possa fornecer informações sobre a patogênese dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV, ele também pode ser aplicado a outras doenças nas quais ocorrem alterações vasculares, como a doença de Alzheimer. Inicie este procedimento aplicando gel de lágrima artificial nos olhos de um camundongo anestesiado.
Em seguida, rape a cabeça usando uma máquina de cortar cabelo elétrica. Depois, aplique solução de poviodine para esterilizar o couro cabeludo e deixe secar. Em um microscópio de luz, remova o couro cabeludo do animal para expor completamente os ossos parietais, os ossos frontais caudais e o ponto bregmático.
Aplicar uma pequena quantidade de uma solução a dez por cento de cloreto férrico sobre o crânio, a fim de secar a membrana para facilitar sua remoção. Em seguida, remover a membrana seca, raspando suavemente o crânio com a pinça. Depois, aplicar uma camada fina de cola ao redor da janela da placa craniana.
Pressione suavemente a placa craniana contra o crânio do camundongo, mantendo a área de interesse no centro da janela. Em seguida, aplique uma gota de cimento dental sobre a placa craniana para polimerizar a cola. Depois, aplique uma camada fina de cola ao longo da borda da janela da placa craniana para criar um reservatório que contenha a solução salina.
Uma vez que a cola tenha secado, parafuse a placa craniana no arnês da placa craniana do camundongo. Remova qualquer resíduo de cola da janela da placa craniana utilizando uma broca acoplada a uma micro-torquês, ajustada em 6.000 rpm. Pare a cada 10 a 15 segundos para evitar o superaquecimento do crânio do camundongo.
Em seguida, utilizando uma broca nova, comece a afinar o crânio com uma broca micro-tórpeda ajustada em 4.000 rpm. Mova a broca suavemente sobre o crânio sem pressão direta para baixo. Uma vez que o crânio esteja completamente afinado, desconecte o camundongo do suporte e coloque-o sobre as costas.
Fixe suavemente com fita adesiva ambas as patas traseiras para expor claramente as coxas mediais. Em seguida, remova os pelos das duas coxas mediais e desinfete o local cirúrgico cobrindo as coxas com iodopovidona. A seguir, remova cuidadosamente a pele da coxa medial direita, acima da veia e artéria femorais.
Aplique aproximadamente três a cinco gotas de solução salina 0,9% no local cirúrgico. Em seguida, separe a veia femoral da artéria, disseccionando cuidadosamente o feixe neurovascular femoral. Agora, posicione dois pedaços de fio cirúrgico com três centímetros de comprimento sob a artéria femoral, separados aproximadamente por um centímetro.
Gire a sutura superior no sentido horário para criar um torniquete vascular que ajudará a prevenir a perda excessiva de sangue durante a cateterização. Posteriormente, faça uma pequena incisão na artéria femoral usando uma tesoura de mola, local onde o cateter será posteriormente inserido para monitorar os parâmetros fisiológicos do camundongo. Neste procedimento, remova a pele da coxa medial esquerda do camundongo.
Em seguida, localize a veia femoral. Usando uma seringa de um mililitro e uma agulha de 30 graus, aspire 130 microlitros da solução de corante fluorescente. Injete lentamente 100 microlitros do corante na veia femoral.
Após remover a agulha, aplique pressão suave e constante no local da injeção para interromper qualquer sangramento e permita que o corante circule por cinco minutos. Em seguida, feche o local cirúrgico com pontos. Vire cuidadosamente o camundongo sobre o estômago e coloque-o no suporte para cabeça de camundongo.
Para a imagem in vivo com dois fótons, mova o aparelho cirúrgico para o microscópio de dois fótons e certifique-se de manter o nível de anestesia do animal. Em seguida, coloque uma pequena quantidade de solução salina 0,9% no reservatório da placa craniana e abaixe a objetiva do microscópio até que entre em contato com a solução salina. Depois, localize a área de interesse utilizando a objetiva de visualização em campo claro.
Em seguida, inicie a imagem de dois fótons. Localize um leito capilar na tela de visualização e amplie esta área utilizando também o zoom óptico. Adquira imagens dos capilares utilizando o software de imagem de dois fótons.
Para a imagem ex vivo com dois fótons, faça uma incisão no couro cabeludo desde os ossos interparietais até os ossos frontais do camundongo decapitado. Fixe a pele nas laterais do crânio com o dedo indicador e o polegar, posicione a tesoura extrafina sob o osso interparietal medial e corte o crânio ao longo da sutura sagital até cerca de três milímetros após o ponto bregmático. Em seguida, separe o crânio do cérebro e remova cuidadosamente qualquer meninge da superfície do cérebro com a pinça.
Deslize suavemente a pinça sob o cérebro para soltá-lo do crânio. Em seguida, coloque o cérebro em uma matriz cerebral específica para camundongos e lave com gotas de ACSF. A seguir, remova uma seção coronal do cérebro com espessura de um milímetro.
Coloque a seção cerebral sobre uma lâmina de vidro côncava contendo ACSF, com a parte mais anterior da seção voltada para cima. Em seguida, cubra suavemente a fatia cerebral com uma lamínula de vidro. Transfira a lâmina para a platina do microscópio e coloque uma pequena quantidade de solução salina 0,9% sobre a lamínula.
Abaixe o objetivo do microscópio até que entre em contato com a solução salina. Em seguida, localize a linha média do cérebro utilizando o objetivo de campo claro. Agora, inicie a imagem de dois fótons e localize novamente a linha média usando o objetivo de 25x.
Realize isso procurando pela fissura longitudinal na superfície cortical da seção coronal. Em seguida, posicione a borda direita da tela de imagem sobre a linha média e mova a tela de visualização lateralmente por três quadros completos. Localize a profundidade na qual os capilares são mal visíveis na tela de visualização.
Em seguida, abaixe o plano de foco em mais 20 micrômetros para determinar o topo da pilha z. Defina a espessura da imagem como um micrômetro. Abaixe a tela de visualização em 100 micrômetros e ajuste a potência do laser continuamente, de modo que menos de um por cento dos pixels estejam superexpostos.
Por fim, adquira o z-stack. Nesta figura, após o corte do cérebro ter sido preparado, uma área de imagem localizada aproximadamente a 1,5 milímetros da linha média é identificada. Um z-stack de 100 micrômetros produz uma imagem tridimensional utilizada para análise no software analítico Amira.
A rede capilar é então traçada manualmente colocando nós no início e no fim de um capilar ou em qualquer local onde um capilar se ramifica em outro. Isso produz uma imagem completamente esqueletizada a partir da qual os parâmetros morfológicos são extraídos automaticamente. O número de nós capilares, segmentos, comprimento médio dos segmentos e o comprimento total dos segmentos pode ser extraído utilizando imagem ex vivo de dois fótons de fatias cerebrais de camundongo.
Aqui, uma imagem bidimensional das redes capilares é produzida por meio de imagem in vivo, na qual o diâmetro capilar pode ser extraído e o volume capilar total pode ser calculado utilizando o diâmetro capilar e o comprimento total do segmento obtido a partir da imagem ex vivo. Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em três horas e meia, se for realizado corretamente. Durante a realização deste procedimento, é importante agir rapidamente, mantendo ao mesmo tempo um nível constante de anestesia, pois o isoflurano pode causar vasodilatação dos capilares corticais, distorcendo assim os dados.
Durante este procedimento, outros parâmetros capilares podem ser obtidos, como a velocidade das hemácias ou o fluxo de hemácias, os quais podem fornecer uma compreensão mais profunda das alterações patogênicas observadas nos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV e em outras doenças neurodegenerativas. Boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método pelo qual a arquitetura vascular no cérebro pode ser quantificada utilizando microscopia de dois fótons in vivo e ex vivo. O objetivo geral deste procedimento é quantificar alterações nas redes capilares corticais após exposição prolongada à virotoxina do HIV, tat.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia vascular
- Transtornos neurocognitivos
Contexto
- Este método ajuda a examinar alterações importantes na morfologia dos capilares corticais.
- Pode contribuir para a patogênese dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV.
- A técnica permite a quantificação fisiologicamente precisa de múltiplos parâmetros morfológicos capilares.
- Também pode ser aplicada a outras doenças com alterações vasculares, como a doença de Alzheimer.
Objetivo do Estudo
- Quantificar alterações nas redes capilares corticais.
- Investigar os efeitos da virotoxina do HIV, tat, sobre a morfologia capilar.
- Fornecer subsídios para a compreensão da patogênese dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV.
Métodos Utilizados
- Microscopia de dois fótons in vivo e ex vivo.
- Aplicação de gel lacrimal artificial nos olhos de camundongos anestesiados.
- Quantificação de parâmetros morfológicos capilares.
- Análise das redes capilares corticais.
Resultados Principais
- Obteve-se a quantificação fisiologicamente precisa de parâmetros capilares.
- Foram observadas alterações significativas na morfologia capilar após exposição à virotoxina do HIV.
- O método forneceu informações sobre as alterações vasculares associadas a distúrbios neurocognitivos.
- Observou-se a aplicabilidade potencial a outras doenças.
Conclusões
- O método é eficaz para estudar a arquitetura vascular no cérebro.
- Pode aprimorar a compreensão dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV.
- Aplicações futuras podem estender-se a outras doenças neurodegenerativas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da arquitetura vascular cerebral fornece subsídios mecanicistas para modelos de doenças neuroinflamatórias, apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos para o SNC. Este método permite a avaliação pré-clínica de alterações vasculares que podem contribuir para disfunção cognitiva, orientando decisões de avanço ou interrupção em portfólios de doenças neurodegenerativas. Ao fornecer morfometria capilar fisiologicamente precisa, aumenta a confiança preditiva na desmistificação precoce de alvos terapêuticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas que relacionam neuroinflamação à rarefação vascular em distúrbios neurocognitivos associados ao HIV.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da quantificação da densidade capilar, comprimento dos segmentos e complexidade da rede.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar mecanismos mediados por alterações vasculares na deterioração cognitiva.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos posteriores, estabelecendo fenótipos vasculares de referência.
- Valor Operacional: Fornece saídas quantitativas padronizadas e reprodutíveis, incluindo contagem de nódulos capilares, comprimento médio de segmento e comprimento vascular total.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em diferentes modelos de doenças, como o de Alzheimer, onde a patologia vascular está implicada.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença por meio da medição direta de alterações nos capilares corticais em um modelo de camundongo transgênico de expressão da proteína Tat do HIV-1.
- Valor Operacional: Garante a continuidade translacional, da descoberta à validação pré-clínica, por meio de leituras morfológicas consistentes.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de avanço com ajuste de risco ao quantificar parâmetros de desvio de risco vascular.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes e os testes de eficácia pré-clínicos, especialmente para terapêuticas direcionadas ao SNC, onde a integridade vascular é um modificador mecanicista.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a disfunção da unidade neurovascular e a elucidação de vias em modelos de neuroinflamação.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio da aquisição padronizada de z-stacks e extração automatizada de parâmetros morfológicos.
- Análises: Fornece leituras quantitativas, como diâmetro capilar, fluxo de hemácias e fluxo volumétrico, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de métricas vasculares alinhadas a biomarcadores que predizem desfechos cognitivos.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável em diversos programas de doenças neurodegenerativas com comorbidade vascular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva por meio da redução de riscos mecanicistas das contribuições vasculares à neurodegeneração.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade em fluxos de trabalho de imagem in vivo e ex vivo.
- Valor Estratégico: Melhora decisões de prosseguir/não prosseguir ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados decorrentes de toxicidade vascular inesperada.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na modulação do fenótipo vascular.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em preparação neurocirúrgica, microscopia de dois fótons e injeção intravascular de corante.
- Depende de microscópios a laser de varredura de dois fótons, suportes de placa craniana, e software de análise de imagens, como o Amira.
- Necessita padronização entre equipes distintas nos procedimentos de cirurgia, aquisição de imagens e análise, para garantir a aquisição consistente de pilhas de imagens (z-stack).
- Envolve considerações de adaptação ao transladar modelos em camundongos para escalas vasculares relevantes ao ser humano.
- Limitado pela habilidade técnica necessária para manter uma anestesia estável sem induzir artefatos de vasoconstrição ou vasodilatação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:50
Preparation of the Thin-skull Cranial Window
2:41
Monitoring of Physiological Parameters
4:02
Injection of the Fluorescent Dye
4:54
In Vivo Two-Photon Imaging
5:42
Ex Vivo Two Photon Imaging
8:04
Results: Generation of Skeletonized Capillary Networks
9:17
Conclusion
