Name: Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a quantificar a arquitetura vascular cerebral usando microscopia de dois fótons em modelo de neuroinflamação induzida por HIV em camundongos. Este método permite análise precisa de parâmetros morfológicos capilares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Maria Jepson, Dra. Paivi Jordan e Dra. Linda Callahan do University of Rochester Multiphoton Core por aconselhamento técnico durante a conclusão deste protocolo. Também agradecemos ao Dr. Changyong Feng pelo aconselhamento estatístico especializado e ao Dr. Maiken Nedergaard, do Centro Médico da Universidade de Rochester, pelo design da placa de cabeça usado neste artigo. Este trabalho foi apoiado em parte por doações T32GM007356 e R01DA026325 do National Institutes of Health (NIH); e pelo Centro de Pesquisa da AIDS da Universidade de Rochester P30AI078498 (NIH).

A Universidade do Comitê Universidade de Rochester em Recursos Animais aprovado todos os procedimentos realizados neste trabalho. Preparação 1. Pré-cirúrgica (e ratos) <ol><li> Prepare a área cirúrgica com todos os equipamentos necessários. Esterilizar todos os instrumentos utilizados durante o procedimento de antemão usando 70% de etanol. Opcionalmente, use um esterilizador de bolas de gude ou autoclave para esterilizar os instrumentos. </li><li> Posicione o mouse em uma câmara de indução isoflurano ligado a um vaporizador de isoflurano. Definir níveis de isoflurano a 4% a uma taxa de 1 L / min. Nota: para as experiências aqui relatadas, ratinhos com uma doxiciclina (DOX) indutível transgene HIV-1 Tat conduzida pela proteína glial fibrilar específicos de astrócitos (GFAP) promotor (ratinhos Tat de HIV-Tg) 10 foram utilizados para examinar o efeito do VIH -1 induzida neuroinflamaï¿½o em estrutura vascular cerebral, como descrito anteriormente 7,10. </li><li> Delicadamente incline a câmara de indução para observar o rato &amp;# 39; s reflexo de endireitamento. Uma vez que o reflexo de endireitamento foi suprimida, definir o nível de isoflurano a 2% e redireccionar o fluxo de ar a partir da câmara de indução para o cone de nariz na bancada cirúrgica. </li><li> Mova rapidamente o mouse da câmara de indução à infusão de água almofada de aquecimento. Continuar a aplicar isoflurano (1,5-2%), através do cone do nariz. Ajuste anestesia de acordo com a tolerância individual do mouse avaliada através freqüência respiratória (FR) de monitoramento. Nota: A depressão de RR pode perturbar parâmetros fisiológicos de gases que alteram o fluxo sanguíneo cerebral e avaliação diâmetro do vaso. Tentativa de manter RR entre 55-65 respirações por minuto. A frequência cardíaca (HR) também pode ser usado avaliar profundidade da anestesia; HR manter entre 300-450 batimentos por minuto para evitar alterações fisiológicas ao diâmetro do vaso. Tipicamente, a anestesia adequada será entre 1,5-2,0% de isoflurano em 1 L / min para um dado rato. </li><li> Realizar uma pitada dedo do pé para buscar ainda mais a profundidade da anestesia. Se o mouse não responder, commrência os procedimentos cirúrgicos. </li></ol> 2. Preparação do Cranial Janela Thin-crânio <ol><li> Aplique gel lágrima artificial para os olhos do mouse. Completamente remover os pêlos do couro cabeludo do rato usando uma tesoura ou um barbeador elétrico. </li><li> Esterilizar o couro cabeludo através da aplicação de solução de iodo-povidona; deixar secar. Então, sob um microscópio de luz, retire a pele do couro cabeludo do rato, expondo completamente os ossos parietais, ossos frontais caudais, e marcação Bregma. </li><li> Aplicar uma pequena quantidade de uma solução de cloreto férrico a 10% no crânio, a fim de secar as membranas para remoção fácil. Retirar as membranas secas com o # 5/45 fórceps raspando suavemente o crânio. </li><li> Aplicar uma fina camada de cola em torno da janela placa frontal. Pressionar suavemente a placa frontal contra o crânio do rato, mantendo a área de interesse no centro da janela. Aplicar uma gota de cimento dental para a placa frontal para polimerizar a cola. </li><li> Aplique uma camada finade cola ao longo da borda da janela de placa frontal para criar um reservatório em que a segurar salina. Uma vez que a cola secar, parafuso da placa frontal para o arnês do mouse placa frontal. Nota: o arnês de rato Headplate utilizado neste procedimento é uma estrutura com uma base de metal e duas colunas de metal. Em cada coluna há uma mola e uma porca de orelhas. A placa frontal é colocada no topo da mola, e a porca de orelhas é apertado até que a cabeça está nivelada e não se move. </li><li> Remova qualquer cola da janela placa frontal usando uma broca anexado a uma broca MicroTorque fixado em 6.000 rpm. Pare a cada 10-15 segundos para evitar o superaquecimento do rato crânio que pode resultar em danos estruturais aos navios. <ol><li> Utilizando uma nova broca, colocar a broca de 1,5 mm MicroTorque lateralmente a partir da linha média (um terço do diâmetro da janela da placa frontal). Começam a diluir o crânio em torno este local a 4.000 rpm. Mova a broca suavemente em todo o crânio sem pressão descendente direto. </li><li> Cease drilling cada 10-15 segundos para evitar o superaquecimento do crânio mouse. Durante este tempo, remover a poeira acumulada crânio utilizando um reservatório de ar comprimido. </li><li> Use gotas de solução salina RT para esfriar crânio para 5-10 seg. Remova cuidadosamente todo o líquido com um tecido macio para continuar afinamento crânio. </li></ol></li><li> Para a diluição final do crânio, colocar um pequeno volume de solução salina no reservatório placa frontal e levemente varrer uma micro-lâmina dentária através da área de interesse até pequenos vasos são claramente visíveis. </li></ol> 3. verificação de parâmetros fisiológicos <ol><li> Uma vez que o crânio é completamente diluído, retire o rato do suporte e colocá-lo em sua parte traseira. Gentilmente fita para baixo ambas as pernas traseiras para expor claramente as coxas medial. </li><li> Remova o cabelo sobre ambas as coxas medial com uma tesoura ou um barbeador elétrico. Desinfetar o local da cirurgia, cobrindo as coxas com iodopovidona. </li><li> Comprimir a pele na coxa medial à direita acima da veia femorale a artéria usando uma pinça # 5. Puxe delicadamente a pele para cima e usar uma tesoura para cortar e remover a pele. Nota: a coxa esquerda é reservada em caso de complicações cirúrgicas (anomalias vasculares, vasos rompidos). </li><li> Aplique aproximadamente 3-5 gotas de solução salina 0,9% ao sítio cirúrgico. Isto permite uma maior ampliação de navios, bem como mantendo o local hidratada e prevenir a secagem dos vasos. Separa-se a veia femoral a partir da artéria por sem rodeios dissecar no feixe neurovascular femoral usando dois # 5/45 fórceps. </li><li> Coloque dois, três peças cm de sutura cirúrgica por baixo da artéria femoral aproximadamente 1 cm de distância. Torça o horário de sutura superior para criar um torniquete vascular que vai ajudar a evitar a perda excessiva de sangue durante o cateterismo. </li><li> Faça uma pequena incisão na artéria femoral usando a tesoura primavera. Colocar o cateter na artéria através da incisão e avanço até que o cateter é segura no interior da artéria. </li><li&gt; Untwist a sutura superior (torniquete) para avaliar se há vazamentos e colocação do cateter adequado. Fixar o cateter na artéria femoral, amarrando dois nós em torno do cateter no interior do recipiente utilizando as suturas. </li><li> Injectam-se 10 uL de heparina (100 IU / ml) através do catéter para impedir a coagulação do sangue. Em seguida, feche cirurgicamente a coxa direita por costura a pele, juntamente com uma sutura 4-0 em um padrão simples interrompido. </li><li> Injecte 50 ul de uretano (1,2 mg / g) por via intraperitoneal no quadrante inferior direito. Cinco minutos mais tarde, repita com outra injecção de 50 uL para o quadrante inferior esquerdo para um total de 100 ul de uretano intraperitoneal. Lentamente reduzir os níveis de isoflurano para cerca de 0,25%, enquanto que concomitantemente rechecking rato para a profundidade de anestesia. Nota: Manter a agulha superficial dentro da cavidade peritoneal, ao longo da parede abdominal posterior de modo a que não perfure o intestino. Isto pode ser conseguido por beliscar o mu reto abdominalscles longe das vísceras e, em seguida, injetar. </li><li> Usando um tubo capilar, recolher uma amostra de 40 ul de sangue arterial a partir do catéter. Encaixe do cateter ao transdutor de pressão do sangue equipado com uma torneira de quatro vias cheio de solução salina e seringa cheia de heparina. </li><li> Tape o transdutor de pressão sanguínea para o aparelho cirúrgico para a remoção não intencional prevenir do cateter. Iniciar a monitoração da pressão arterial média. </li><li> Insira o sangue encheu tubo capilar em uma porta de entrada analisador de gases no sangue. Uma vez todo o sangue ter sido extraído, remover o tubo capilar a partir da porta de entrada. Os O 2 e CO 2 níveis de gases sanguíneos aparece em um papel impresso do analisador de gases no sangue. </li></ol> 4. Injecção do corante fluorescente <ol><li> Comprimir a pele na coxa esquerda medial usando o # 5 fórceps. Puxe delicadamente a pele para cima e usar uma tesoura para cortar e remover a pele. Prepare corante vermelho de rodamina conjugada com dextrano emissores(70 kDa) (10 mg / kg, dissolvidos em soro fisiológico). </li><li> Localizar a femoral vein.Using uma seringa de 1 ml com uma agulha G 30 anexado, desenhar uma solução previamente preparada de um corante fluorescente adequada para a imagiologia para a linha de 130 ul da seringa. Retirar as bolhas de ar através da elaboração o corante completamente para dentro da seringa e sacudindo firmemente parede da seringa. <ol><li> Dobre a agulha G 30 em um ângulo de aproximadamente 30 graus, pressionando-o contra uma superfície dura lado bisel para cima. Encher a agulha com o corante e eliminar qualquer excesso de líquido, deixando uma amostra de 100 ul. </li></ol></li><li> Injectar a amostra de 100 ul de corante lentamente para dentro da veia femoral. Após a remoção da agulha, aplicar constante, a pressão suavemente para o local da injecção para parar qualquer sangramento. Permitir que o corante circular durante 5 min. Nota: Alternativamente, a veia femoral direita pode ser usado em vez de a injecção de corante fluorescente para evitar a perda de sangue através da criação de um outro local cirúrgico. Além disso, se oanimais é a hemorragia descontrolada do local cirúrgico, este pode ser uma indicação de que o excesso de heparina foi determinada para lavar o cateter. Se não houver a coagulação dentro de 10-15 min e o mouse ainda está sangrando, considere reiniciar o experimento com um novo mouse. </li><li> Feche a coxa esquerda por costura a pele, juntamente com uma sutura 4-0, em seguida, virar cuidadosamente o mouse sobre seu estômago, e colocá-lo no arnês do mouse placa frontal. </li></ol> 5. In Vivo Two-Photon Imagens <ol><li> Mova o aparelho cirúrgico para o microscópio de dois fotões, certificando-se de manter os níveis de anestesia contínuas. Colocar uma pequena quantidade de 0,9% de solução salina para dentro do reservatório placa frontal e diminuir o objectivo do microscópio de modo que ele entra em contacto com a solução salina. Localize a área de interesse, utilizando o objetivo de visualização brightfield </li><li> Definir a excitação de dois fotões a um comprimento de onda de laser adequado para o corante fluorescente. Comece a imagem de dois fótons usando a 25x objective. Note-se que nestas experiências foi utilizado um dextrano conjugado com um corante rodamina vermelho emissor de que estava animado em um comprimento de onda de 780 nm. Um filtro passa banda 607/36 de emissão para detectar a fluorescência do corante, e um filtro de emissão de 480/20 passa banda foi utilizado para detectar a autofluorescência arterial </li><li> Localize um capilar cama na tela de exibição e ampliar essa área usando o zoom 2. Adquirir imagens ópticas dos capilares usando o software de imagem de dois fótons. </li><li> Depois de imagem estiver concluída, sacrificar o rato por deslocamento cervical seguido por decapitação. </li></ol> 6. Ex Vivo Two-Photon Imagens <ol><li> Usando a tesoura Extra Fino, fazer uma incisão no couro cabeludo dos ossos interparietais para os ossos frontais do mouse. Fixar a pele para os lados do crânio com o dedo indicador e o polegar. </li><li> Coloque a tesoura extra fino por baixo do osso interparietal medial e cortar o crânio ao longo da sutura sagital. Pare o corte do crânio de aproximadamente 3 mm após o bregma marcação. Nota: Aplicar uma pressão ascendente ao cortar o crânio para evitar o corte do cérebro. </li><li> Usando o # 5 fórceps, separar o crânio a partir do cérebro e cuidadosamente remover qualquer meninges a partir da superfície do cérebro. Meninges restantes podem acidentalmente lacerar o cérebro; deve ser tomado extremo cuidado para evitar isso. Deslize cuidadosamente os # 5 fórceps sob o cérebro avançando lentamente para a frente até que o cérebro está livre de crânio. Nota: se a pressão para baixo deve ser usado, a fim de evitar a perfuração do cérebro. </li><li> Coloque o cérebro de uma ferramenta de corte cerebral específico para ratos. Lave o cérebro através da aplicação de gotas de líquido cefalorraquidiano artificial sobre o cérebro. </li><li> Retirar a 2 mm Secção coronal do cérebro de bregma 0 a bregma -2. Coloque a secção coronal numa lâmina de vidro côncavo contendo líquido cefalorraquidiano artificial com a 0 bregma (maior parte cranial da secção) virado para cima. Gentilmente cobrir o cérebro slgelo com uma lamela de vidro. Nota: Evite pressionar o vidro uma vez colocado no seção do cérebro, pois isso pode deformar a arquitetura vascular. </li><li> Transferir as lâminas para o estágio do microscópio e coloque uma pequena quantidade de solução salina 0,9% sobre a lamela. Abaixe a objetiva do microscópio até que ele entra em contato com a solução salina. Localizar a linha média do cérebro utilizando a objectiva de campo claro. </li><li> Comece a imagem de dois fótons e localize a linha média novamente usando o objetivo de 25x. Conseguir isso, procurando a fissura longitudinal na superfície cortical da secção coronal. Coloque a borda direita da tela de imagem na linha média e mover a tela do espectador sobre lateralmente três quadros completos (aproximadamente 1,5 mm da linha média). Note-se que nestes experimentos, os parâmetros de imagem foram idênticos aos mencionados na nota no passo 5.2. </li><li> Localize a profundidade em que os capilares são pouco visíveis na tela de exibição. Abaixe o plano de foco mais 20iM para determinar o início do Z-pilha. </li><li> Defina a espessura imagem para 1 m. Abaixe a tela de visualização para 100 mm e ajustar a potência do laser ao longo de tal forma que menos de 1% dos pixels são oversaturated. Nota: as imagens z-stack são compilados a partir de uma série de 100 imagens 500x500x1 consecutivo M. Quanto maior a pilha z-os mais precisos os cálculos de pós-processamento será. Em geral, tentar recolher uma pilha de Z-100 um ou maior. </li><li> Pressione o ícone de repetição XY seguido pelo ícone XY adjacente. Uma vez que o z-stack for concluída, pressione o ícone Série Feito e salve o arquivo. </li></ol> 7. Processamento de Dados <ol><li> Abra uma imagem capilar vivo em no software ImageJ. Definir manualmente o pixel à relação de distância com base nos valores obtidos a partir do software de dois fótons. <ol><li> Selecione o ícone * * reta a partir do menu ferramentas. Desenhar uma linha que se estende a partir de uma parede capilar para o OPPOparede capilar local, e gravar o tamanho fornecido pelo ImageJ. Note-se que pode ser necessário para aumentar a imagem, a fim de visualizar claramente as bordas das paredes capilares. </li><li> Repetir o passo 7.1.1 em diferentes locais ao longo do capilar, assim como para múltiplos capilares na imagem. </li></ol></li><li> Abra o arquivo z-stack no software analítico, como Amira. Selecione o ícone Filament editor da barra de ferramentas sub-aplicação <ol><li> Defina a espessura do espectador a aproximadamente 20. Mova o espectador a parte superior ou inferior de z-stack. </li><li> Selecione o ícone de rastreamento e mova o cursor sobre a imagem carregada. Nós colocar no capilares nos locais descritos na Figura 2C; segmentos aparecerá automaticamente entre nós adjacentes. Seguir a capilares em todo o inteiro z-pilha. Nota: será necessário colocar os nós de entre os pontos finais e pontos de ramificação, a fim de traçar os capilares throughout o z-stack. </li><li> Para remover esses nós, clique no ícone Intermediate Remover. Nota: Isto pode criar segmentos em loop errôneas que devem ser removidos manualmente, selecionando o loop usando o ícone Individual Select, e em seguida, selecionando o ícone Remove Selected. Se lacetes continuam a aparecer na mesma área, durante o rastreio, é provável que os gânglios foram colocados em diferentes capilares. </li><li> Uma vez que o rastreamento estiver completo, selecione o ícone Graph informações para abrir uma planilha contendo os parâmetros vasculares extraídos automaticamente. O número de nós e segmentos estão disponíveis na tela de visualização principal. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coat+of+many+colors%3A+neuroimmune+crosstalk+in+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection.</a> Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).</li>
<li>Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+associated+dementia%3A+symptoms+and+causes%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 associated dementia: symptoms and causes.</a> Retrovirology. 3, 28(2006).</li>
<li>Antinori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+research+nosology+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).</li>
<li>Clifford, D. B., Ances, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-associated+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-associated neurocognitive disorder.</a> The Lancet. Infectious diseases. 13 (11), 976-986 (2013).</li>
<li>Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-associated+neurocognitive+disorder%3A+pathogenesis+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmune+pharmacology+%3A+the+official+journal+of+the+Society+on+NeuroImmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities.</a> Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-targeted+production+of+IL-17A+induces+glial+activation%2C+microvascular+pathology+and+enhances+the+neuroinflammatory+response+to+systemic+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia.</a> PloS one. 8 (2), e57307(2013).</li>
<li>Silva, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+central+nervous+system+expression+of+HIV-1+Tat+leads+to+accelerated+rarefaction+of+neocortical+capillaries+and+loss+of+red+blood+cell+velocity+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity.</a> Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Bruce-Keller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+causes+rapid+increases+in+glial+activation+and+neuronal+injury+in+the+striatum+of+inducible+HIV-1+Tat+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice.</a> Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+hypercapnia+reveals+an+underlying+cerebrovascular+pathology+in+a+murine+model+for+HIV-1+associated+neuroinflammation%3A+role+of+NO-cGMP+signaling+and+normalization+by+inhibition+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterase-5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 253(2012).</li>
<li>Farber, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+and+agent-specific+dilation+of+intracerebral+microvessels+by+volatile+anesthetics+in+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices.</a> Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método aqui descrito pode ser aplicado para analisar as estruturas microvasculares cerebrais em uma ampla gama de modelos / configurações experimentais. Para o sucesso deste método, três passos críticos deve ser dominado. Em primeiro lugar, a janela crânio-fina não deve danificar o crânio ou cérebro subjacente. É fácil de perfurar o crânio durante o desbaste, ou causar perda vascular induzida pelo calor. Isto pode interferir com a formação de imagens conforme o corante fluorescente vai infiltrar-se no plano de foco e ...

Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (VIH-1) invade o cérebro durante a fase aguda da infecção pelo vírus, e produtivamente infecta ambas as microglia e macrófagos residentes cérebro, que conduz à sua activação - e a libertação de ambos os mediadores inflamatórios derivados do hospedeiro e solúvel HIV-1 virotoxins como Tat e gp120 (revisto em 1,2). Como consequência, um estado neuroinflamatória crônica torna-se estabelecido no CNS, que é pensado para contribuir para a patogênese do HIV-1 Distúrbios Associated neurocognitivos (a mão) 3-5. Superexpressão crónica do HIV-1 Tat ou interleucina (IL) -17 no SNC de ratinhos foi mostrado para resultar em 6,7 rarefacção microvascular. Isto levanta a possibilidade de que neuroinflamaï¿½o crónica pode contribuir para a patogénese da mão através de efeitos sobre a vasculatura cerebral. A fim de analisar melhor esta questão, temos desenvolvido métodos para quantificar struc vasculares cerebraisturas. Este artigo descreve um método para a quantificação do número de nodos capilares, segmentos capilares, comprimento do segmento, o comprimento total do segmento dizer, o diâmetro médio do capilar, e o volume total do capilar utilizando imagiologia in vivo de redes capilares através de uma janela cortical crânio fina (modificado a partir do descrito anteriormente protocolos de 8,9), assim como ex vivo de imagens de secções do cérebro, utilizando microscopia de dois fotões. Esta abordagem combinada fornece para uma quantificação global de parâmetros vasculares cerebrais, desde fina-crânio janela cortical in vivo permite a preservação do meio ambiente cerebral, enquanto ex vivo de imagens de redes capilares em fatias de cérebro permite a reconstrução completa, tridimensional - redes capilares que pode, então, ser quantificada utilizando software disponível comercialmente.

<table><tbody><tr><td>Microscópio Leica</td><td>Leica Inc.</td><td>Iluminador de Alta Intensidade MZ8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dolan-Jenner</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de Aquecimento</td><td>Stryker&nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T / PUMP</td><td>Gaymar Industries, Inc.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 Vaporizador de Isoflurano</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>Gel Lágrima Artificial</td><td>Butler AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodo-povidona&nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Bonn Extra Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Fórceps</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Cloreto Férrico</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Prisma Gel Adesivo Instantâneo</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Microtoruqe II Handpiece Kit</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Burr para Micro Broca</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina Norland (Microblade Dental)</td> <td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Uretano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>Cancerígeno do grupo 2B</td></tr><tr><td>Sutura Trançada</td><td>Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Cateter Arterial</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>MAC-01</td><td>A extremidade do cateter foi esticada manualmente para diminuir seu diâmetro.&nbsp;</td></tr><tr><td>Monitoramento de Pressão Arterial</td><td>World Precision Intruments</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de Pressão Arterial e Cabo</td><td>World Precision Intruments</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab Analisador de Gases de Sangue&nbsp;</td><td>Siemens&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; l Tubo capilar</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-dextrano (70.000 MW, 10 mg/kg dissolvido em solução salina)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de fatiador de cérebro de camundongo adulto</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio multifotônico Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td></td><td>Disponível em http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>Visage Imaging&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação de vascular cerebral arquitetura usando dois fótons microscopia em um modelo de mouse neuroinflammation induzida por hiv

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

A infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana 1 (HIV-1) freqüentemente resulta em Distúrbios Neurocognitivos Associados ao HIV-1 (HAND) e é caracterizada por um estado neuroinflamatório crônico no sistema nervoso central (SNC), que se acredita ser impulsionado principalmente pela ativação mediada por vírus da microglia e macrófagos residentes no cérebro. A infecção pelo HIV-1 também é acompanhada por alterações no fluxo sanguíneo cerebrovascular (FSC), levantando a possibilidade de que a neuroinflamação crônica associada ao HIV possa levar a alterações no FSC e/ou na arquitetura vascular cerebral. Para abordar essa questão, usamos um modelo de camundongo para neuroinflamação induzida pelo HIV e testamos se a exposição a longo prazo a esse ambiente inflamatório pode danificar a vasculatura cerebral e resultar em rarefação de redes capilares. Neste artigo, descrevemos um método para quantificar alterações na densidade capilar cortical em um modelo de camundongo com doença neuroinflamatória (camundongos transgênicos HIV-1 Tat). Essa abordagem generalizável emprega imagens in vivo de dois fótons de capilares corticais através de uma janela cortical de crânio fino, bem como imagens ex vivo de dois fótons de capilares corticais em seções cerebrais de camundongos. Esses procedimentos produzem imagens e arquivos z-stack de redes capilares, respectivamente, que podem ser submetidos a análises quantitativas para avaliar alterações na arquitetura vascular cerebral.

A janela cortical crânio-fino permite in vivo de dois fotões imagiologia de capilares corticais (Figura 1). Uma área adequada para a imagem mostra numerosos capilares, distintos (Figura 1A). No mesmo campo de visão, não há nenhuma parede arterial autofluorescência celular, e podem existir outros sinais fluorescentes, tais como o colagénio, a fluorescência induzida por geração segunda harmónica 11 (Figura 1B). <p c...

Este artigo descreve um método pelo qual a arquitetura vascular no cérebro pode ser quantificada usando microscopia de dois fótons in vivo e ex vivo.

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar alterações nas redes de capilares corticais após exposição prolongada à virotoxina do HIV, tat. Este método pode auxiliar na análise de alterações-chave na morfologia dos capilares corticais que podem contribuir para a patogênese dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a quantificação fisiologicamente precisa de múltiplos parâmetros morfológicos capilares.Embora este método possa fornecer informações sobre a patogênese dos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV, ele também pode ser aplicado a outras doenças nas quais ocorrem alterações vasculares, como a doença de Alzheimer. Inicie este procedimento aplicando gel de lágrima artificial nos olhos de um camundongo anestesiado.Em seguida, rape a cabeça usando uma máquina de cortar cabelo elétrica. Depois, aplique solução de poviodine para esterilizar o couro cabeludo e deixe secar. Em um microscópio de luz, remova o couro cabeludo do animal para expor completamente os ossos parietais, os ossos frontais caudais e o ponto bregmático.Aplicar uma pequena quantidade de uma solução a dez por cento de cloreto férrico sobre o crânio, a fim de secar a membrana para facilitar sua remoção. Em seguida, remover a membrana seca, raspando suavemente o crânio com a pinça. Depois, aplicar uma camada fina de cola ao redor da janela da placa craniana.Pressione suavemente a placa craniana contra o crânio do camundongo, mantendo a área de interesse no centro da janela. Em seguida, aplique uma gota de cimento dental sobre a placa craniana para polimerizar a cola. Depois, aplique uma camada fina de cola ao longo da borda da janela da placa craniana para criar um reservatório que contenha a solução salina.Uma vez que a cola tenha secado, parafuse a placa craniana no arnês da placa craniana do camundongo. Remova qualquer resíduo de cola da janela da placa craniana utilizando uma broca acoplada a uma micro-torquês, ajustada em 6.000 rpm. Pare a cada 10 a 15 segundos para evitar o superaquecimento do crânio do camundongo.Em seguida, utilizando uma broca nova, comece a afinar o crânio com uma broca micro-tórpeda ajustada em 4.000 rpm. Mova a broca suavemente sobre o crânio sem pressão direta para baixo. Uma vez que o crânio esteja completamente afinado, desconecte o camundongo do suporte e coloque-o sobre as costas.Fixe suavemente com fita adesiva ambas as patas traseiras para expor claramente as coxas mediais. Em seguida, remova os pelos das duas coxas mediais e desinfete o local cirúrgico cobrindo as coxas com iodopovidona. A seguir, remova cuidadosamente a pele da coxa medial direita, acima da veia e artéria femorais.Aplique aproximadamente três a cinco gotas de solução salina 0,9% no local cirúrgico. Em seguida, separe a veia femoral da artéria, disseccionando cuidadosamente o feixe neurovascular femoral. Agora, posicione dois pedaços de fio cirúrgico com três centímetros de comprimento sob a artéria femoral, separados aproximadamente por um centímetro.Gire a sutura superior no sentido horário para criar um torniquete vascular que ajudará a prevenir a perda excessiva de sangue durante a cateterização. Posteriormente, faça uma pequena incisão na artéria femoral usando uma tesoura de mola, local onde o cateter será posteriormente inserido para monitorar os parâmetros fisiológicos do camundongo. Neste procedimento, remova a pele da coxa medial esquerda do camundongo.Em seguida, localize a veia femoral. Usando uma seringa de um mililitro e uma agulha de 30 graus, aspire 130 microlitros da solução de corante fluorescente. Injete lentamente 100 microlitros do corante na veia femoral.Após remover a agulha, aplique pressão suave e constante no local da injeção para interromper qualquer sangramento e permita que o corante circule por cinco minutos. Em seguida, feche o local cirúrgico com pontos. Vire cuidadosamente o camundongo sobre o estômago e coloque-o no suporte para cabeça de camundongo.Para a imagem in vivo com dois fótons, mova o aparelho cirúrgico para o microscópio de dois fótons e certifique-se de manter o nível de anestesia do animal. Em seguida, coloque uma pequena quantidade de solução salina 0,9% no reservatório da placa craniana e abaixe a objetiva do microscópio até que entre em contato com a solução salina. Depois, localize a área de interesse utilizando a objetiva de visualização em campo claro.Em seguida, inicie a imagem de dois fótons. Localize um leito capilar na tela de visualização e amplie esta área utilizando também o zoom óptico. Adquira imagens dos capilares utilizando o software de imagem de dois fótons.Para a imagem ex vivo com dois fótons, faça uma incisão no couro cabeludo desde os ossos interparietais até os ossos frontais do camundongo decapitado. Fixe a pele nas laterais do crânio com o dedo indicador e o polegar, posicione a tesoura extrafina sob o osso interparietal medial e corte o crânio ao longo da sutura sagital até cerca de três milímetros após o ponto bregmático. Em seguida, separe o crânio do cérebro e remova cuidadosamente qualquer meninge da superfície do cérebro com a pinça.Deslize suavemente a pinça sob o cérebro para soltá-lo do crânio. Em seguida, coloque o cérebro em uma matriz cerebral específica para camundongos e lave com gotas de ACSF. A seguir, remova uma seção coronal do cérebro com espessura de um milímetro.Coloque a seção cerebral sobre uma lâmina de vidro côncava contendo ACSF, com a parte mais anterior da seção voltada para cima. Em seguida, cubra suavemente a fatia cerebral com uma lamínula de vidro. Transfira a lâmina para a platina do microscópio e coloque uma pequena quantidade de solução salina 0,9% sobre a lamínula.Abaixe o objetivo do microscópio até que entre em contato com a solução salina. Em seguida, localize a linha média do cérebro utilizando o objetivo de campo claro. Agora, inicie a imagem de dois fótons e localize novamente a linha média usando o objetivo de 25x.Realize isso procurando pela fissura longitudinal na superfície cortical da seção coronal. Em seguida, posicione a borda direita da tela de imagem sobre a linha média e mova a tela de visualização lateralmente por três quadros completos. Localize a profundidade na qual os capilares são mal visíveis na tela de visualização.Em seguida, abaixe o plano de foco em mais 20 micrômetros para determinar o topo da pilha z. Defina a espessura da imagem como um micrômetro. Abaixe a tela de visualização em 100 micrômetros e ajuste a potência do laser continuamente, de modo que menos de um por cento dos pixels estejam superexpostos.Por fim, adquira o z-stack. Nesta figura, após o corte do cérebro ter sido preparado, uma área de imagem localizada aproximadamente a 1,5 milímetros da linha média é identificada. Um z-stack de 100 micrômetros produz uma imagem tridimensional utilizada para análise no software analítico Amira.A rede capilar é então traçada manualmente colocando nós no início e no fim de um capilar ou em qualquer local onde um capilar se ramifica em outro. Isso produz uma imagem completamente esqueletizada a partir da qual os parâmetros morfológicos são extraídos automaticamente. O número de nós capilares, segmentos, comprimento médio dos segmentos e o comprimento total dos segmentos pode ser extraído utilizando imagem ex vivo de dois fótons de fatias cerebrais de camundongo.Aqui, uma imagem bidimensional das redes capilares é produzida por meio de imagem in vivo, na qual o diâmetro capilar pode ser extraído e o volume capilar total pode ser calculado utilizando o diâmetro capilar e o comprimento total do segmento obtido a partir da imagem ex vivo. Uma vez dominado, este procedimento pode ser concluído em três horas e meia, se for realizado corretamente. Durante a realização deste procedimento, é importante agir rapidamente, mantendo ao mesmo tempo um nível constante de anestesia, pois o isoflurano pode causar vasodilatação dos capilares corticais, distorcendo assim os dados.Durante este procedimento, outros parâmetros capilares podem ser obtidos, como a velocidade das hemácias ou o fluxo de hemácias, os quais podem fornecer uma compreensão mais profunda das alterações patogênicas observadas nos distúrbios neurocognitivos associados ao HIV e em outras doenças neurodegenerativas. Boa sorte com seus experimentos.

quantification-cerebral-vascular-architecture-using-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós descrevemos um método para visualizar repetidamente microglia murino e monócitos...

A Técnica de Janela crânio-fino para Crônica de dois fótons In vivo Imaging da Microglia murino em Modelos de Neuroinflammation

Microscopia intravital para seguir temporal e espacial eventos inflamatória e hemodinâmica na microcirculação pial.

Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

Aqui nós descrevemos um método para visualizar diretamente hipóxia tecidual microrregional no córtex do...

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/53582/quantificação-da-arquitetura-vascular-cerebral-usando-microscopia-de-dois-fótons-em-um-modelo-de-camundongo-de-neuroinflamação-induzida-por-HIV'&gt; Nishimura, C. et al. Quantificação da Arquitetura Vascular Cerebral usando Microscopia de Dois Fótons em um Modelo de Camundongo de Neuroinflamação Induzida pelo HIV. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra a visualização in vivo de capilares corticais no cérebro de...

 Microscopia de dois fótons para imagens in vivo de microvasculatura cerebral de camundongos 

Fonte: Arango-Lievano, M. et. al., Imagem longitudinal in vivo da cerebrovasculatura: relevância para doenças do SNC. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra imagens in vivo de dois fótons para visualizar placas amilóides marcadas com fluorescência e vasculatura cerebral. A fluorescência azul marca as placas, enquanto a fluorescência verde destaca os vasos sanguíneos cerebrais. Um mapa 3D da região de interesse e imagens em mosaico de alta resolução revelam interações detalhadas de placas...

Imagens in vivo de vasos cerebrais e placas amilóides em um modelo de camundongo com doença de Alzheimer

Este protocolo descreve o pré-condicionamento hipóxico repetitivo ou breves exposições à hipóxia sistêmica que reduzem os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica após oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Ele também detalha a quantificação dupla do volume do infarto e da ruptura da barreira hematoencefálica após o AVC para avaliar a eficácia da proteção neurovascular.

Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Este manuscrito descreve um procedimento para controlar a remodelação do cerebrovasculature durante amyloid acúmulo de placa in vivo utilizando microscopia de dois fótons longitudinal. Uma preparação crânio-diluídos permite a visualização de corantes fluorescentes para avaliar a progressão do dano vascular cerebral num modelo de rato da doença de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Aqui nós apresentamos um protocolo baseado em microscopia para imagens de alta resolução e uma reconstrução tridimensional do mouse unidade neurovascular e barreira hemato - encefálica usando seções flutuantes de cérebro. Este método permite a visualização, análise e quantificação das organelas intracelulares no BBB.

De alta resolução de imagem latente Confocal da barreira sangue - cérebro: geração de imagens, reconstrução 3D e quantificação de Transcytosis

O objetivo deste artigo é apresentar um método que permite uma reconstrução 3-dimensional da árvore vascular em ratos após micro computado tomografia computadorizada e determinação de volumes de segmentos de toda embarcação que podem ser usados para quantificar o vasoespasmo cerebral em modelos de murino de hemorragia subaracnoide.

Um método volumétrico para quantificação de vasoespasmo Cerebral em um modelo murino de hemorragia subaracnoide

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Aprenda a quantificar a arquitetura vascular cerebral usando microscopia de dois fótons em modelo de neuroinflamação induzida por HIV em camundongos. Este método permite análise precisa de parâmetros morfológicos capilares.

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV (Vídeo) | JoVE Journal

Quantificação de Vascular Cerebral Arquitetura usando dois fótons Microscopia em um modelo de mouse Neuroinflammation induzida por HIV

Explorar mais vídeos