Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar uma abordagem versátil para o desenvolvimento de bioinks em hidrogel que possam ser extrudidos por meio de dispositivos de bioimpressão. Os bioinks podem então ser utilizados para fabricar construtos tridimensionais de tecidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de bioimpressão, como a forma de controlar as propriedades mecânicas necessárias para fornecer um material que possa ser extrudido usando um bioimpressor.

A principal vantagem desta técnica é que utilizamos componentes comercialmente disponíveis combinados de forma modular para criar um bioink de hidrogel simples e eficaz, passível de bioprintagem. As aplicações dessas tecnologias incluem a criação de organoides tridimensionais que podem ser usados para modelar com precisão os efeitos de fármacos, toxinas e doenças. Embora este método possa fornecer uma estrutura para a bioprintagem de construtos hepáticos tridimensionais, ele também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos, como músculo, pulmão e cólon.

De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque são utilizados diversos reagentes diferentes para criar a bioink em hidrogel, mas o processo é na verdade bastante simples. O procedimento será demonstrado por Young-Joon Seol, um pós-doutorando da nossa equipe. Para começar, prepare um digesto de matriz extracelular específico para o tecido, a ser usado na formulação do hidrogel, conforme descrito em outro lugar.

Em seguida, dissolva um fotoiniciador em água numa proporção de peso por volume de 0,1%. Para formar as bioinks de hidrogel, primeiro dissolva os componentes da matriz básica dos kits de hidrogel de ácido hialurônico em alíquotas individuais da solução aquosa de fotoiniciador. Depois, combine a solução de matriz extracelular, o ácido hialurônico tiolado 2%, a gelatina tiolada 2%, os agentes de reticulação e o meio de cultura de hepatócitos nas proporções indicadas aqui. Para melhorar as propriedades de extrusão da bioink, adicione 1,5 miligramas por mililitro de ácido hialurônico não modificado e 30 miligramas por mililitro de gelatina à mistura.

Em seguida, agite a mistura resultante em vórtex em alta velocidade por dez segundos antes do uso. Antes de testar o bioink em um dispositivo de bioprintagem, teste primeiramente as características de extrusão na bancada do laboratório. Utilizando uma seringa padrão, retire uma amostra do bioink e, em seguida, acople uma agulha de 20 a 30 gauge na seringa.

Permita que o bioink sofra reticulação e, em seguida, empurre o bioink através da agulha para obter filamentos de hidrogel extrudidos suavemente. Se a formulação for capaz de criar um filamento com poucas ou nenhuma saliência, então está pronta para a bioprintagem. Para carregar as preparações de bioink em uma bioprintadora, pipete o bioink para dentro de cartuchos esterilizados da impressora.

Deixe-os repousar por 30 minutos antes da extrusão, pois a bio-tinta sofrerá cruzamento espontâneo de estágio um dentro da cartela. Em seguida, carregue a cartela na configuração de impressão e conecte uma fonte de pressão pneumática à cartela. Prepare um padrão simples, como esta grade de sete por sete milímetros com linhas paralelas, para imprimir, a fim de avaliar sua compatibilidade com a extrusão.

Enquanto o cabeçote de impressão se move no plano XY a uma velocidade de aproximadamente 300 milímetros por minuto, aplique uma pressão de 20 quilopascal ao cartucho para extrusão do bioink. Se os materiais extrusados apresentarem grumos ou irregularidades, reduza a quantidade do agente de reticulação adicionado, com o objetivo de suavizar o material reticulado na etapa um. Uma formulação de bioink adequadamente preparada deve ser extrusada de forma homogênea, permitindo deposição precisa e arquiteturas bem definidas.

Prepare esferoides hepáticos de células primárias tridimensionais em uma placa de 96 poços utilizando o método da gota suspensa, conforme descrito no protocolo de texto complementar. Após três dias em cultura, colete os esferoides hepáticos da placa de gota suspensa usando uma pipeta e transfira-os para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Deixe os esferoides sedimentarem no fundo do tubo cônico por um a dois minutos.

Em seguida, aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta. Transfira de 110 a 125 por cento do volume desejado do constructo impresso em 3D da solução de bioink hidrogel recém-preparada para o tubo cônico contendo os esferoides. Em seguida, pipete os esferoides suavemente para cima e para baixo para re-suspenderlos na solução de bioink hidrogel.

Uma vez suspensas uniformemente, transfira a solução de esferoides para uma cartela de bioprintagem usando uma pipeta e deixe a solução passar pela primeira etapa de reticulação por 30 minutos. Após essa etapa de reticulação, utilize um dispositivo de bioprintagem para criar as estruturas desejadas de hidrogel contendo os esferoides hepáticos primários. Após cada camada depositada, exponha a bio-tinta impressa à luz UV por dois a quatro segundos para iniciar o mecanismo secundário de reticulação.

Isso estabilizará as estruturas e aumentará a rigidez ao nível desejado. A concentração de alquino de PEG na solução é o que controla a densidade geral de reticulação e, portanto, controla principalmente a rigidez da estrutura final. Após a bioimpressão, observou-se alta viabilidade celular nas estruturas hepáticas utilizando microscopia confocal.

Em condições ambientais ideais, a viabilidade deve ser superior a 85%. Além disso, quando os constructos foram corados para marcadores indicativos de tecido hepático, observou-se expressão positiva de CYP3A4, uma isoforma do citocromo P450, albumina intracelular, E-caderina, uma proteína de adesão célula-célula epitelial, e DPP4, uma proteína altamente expressa no fígado. Quando o meio de cultura foi analisado quanto aos níveis de ureia e albumina, verificou-se que o constructo secretou tanto ureia quanto albumina em níveis constantes ao longo do período de 14 dias. Isso reforça a ideia de que as biotintas de hidrogel específicas para tecidos auxiliam na manutenção da função das células hepáticas.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de duas horas do início ao fim, se realizada corretamente. No entanto, isso geralmente depende do dispositivo de bioimpressão específico que é empregado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os passos demonstrados muitas vezes precisam ser adaptados para serem compatíveis com outros tipos de tecidos ou dispositivos de bioimpressão.

Após este procedimento, outras formulações de bioinks de hidrogel podem ser criadas para suportar a bioimpressão de outros tipos de tecidos. O desenvolvimento dessas tecnologias ajudou a abrir caminho para a criação de plataformas de órgãos múltiplos, tipo corpo-em-um-chip, para triagem de fármacos e modelagem de doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como começar a projetar materiais que possam ser usados para a bioimpressão de estruturas de tecidos tridimensionais utilizando reticulação em múltiplas etapas.

Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso para a visão, e precauções como o uso de óculos de proteção contra UV devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.