Name: Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a desenvolver bioinks de hidrogel tecido-específicos para bioprinting 3D usando componentes modulares comerciais. Este método permite fabricar construtos teciduais funcionais para modelagem de doenças e testes de drogas in vitro.

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Os autores agradecem o financiamento pela Agência de Redução de defesa contra ameaças (DTRA) sob Space and Naval Warfare Center Sistemas Pacífico (SSC Pacífico) Contrato nº N6601-13-C-2027. A publicação deste material não constitui uma aprovação pelo governo dos achados ou conclusões aqui.

1. Formulações de hidrogel Bioink e Preparação <ol><li> A fim de proporcionar perfis bioquímicos específicos do tecido, preparar-tecido específico ECM digerir soluções como previamente descrito para o fígado. 20 Nota: Em geral, este ECM Digest irá compreender 40% do volume bioink hidrogel final que é empregue. Várias centenas de mililitros de solução de ECM digestão pode ser preparado, aliquotas, e congelado a -80 ° C para uso futuro. </li><li> Antes da formulação de hidrogel, dissolver um fotoiniciador, 2-hidroxi-4 &#39;- (2-hidroxietoxi) -2-metilpropiofenona, em água a 0,1% w / v. NOTA: Os volumes no intervalo de 50-100 ml pode ser preparado com antecedência e guardadas protegida da luz a 4 ° C durante vários meses. </li><li> Para formar bioinks hidrogel, dissolver primeiro os componentes de material de base a partir do ácido hialurónico (HA), kits de hidrogel na solução de água-fotoiniciador. <ol><li> Dissolver a gelatina tiolada HA e tiolado separadamente em água-psolução hotoinitiator (passo 1.2) para fazer 2% w / v soluções. </li><li> Dissolve-se diacrilato de polietileno glicol (PEGDA), o agente de reticulação nos kits de hidrogel, em solução de água-fotoiniciador (passo 1.2) para fazer uma solução a 8% w / v. </li><li> Dissolve-se polietileno glicol (PEG) de 8 braços alcino (10 kDa MW) em solução de água-fotoiniciador (passo 1.2) para fazer uma solução a 8% w / v. </li></ol></li><li> Em geral, formam hidrogeles utilizando o seguinte esquema, embora personalização adicional é possível. <ol><li> Combine 4 partes de 2% tiolados HA, 4 partes de 2% de gelatina tiolado, 1 parte de agente de reticulação 1, 1 parte de agente de ligação cruzada 2 com 8 partes de solução ECM tecidos e 2 partes de meios de cultura de hepatócitos (HCM) (ou 10 partes de água como um não-tecido genérico hidrogel especï¿½ico). Nota: adicional de HA não modificada ou gelatina podem ser adicionados para fazer a extrusão bioink mais suavemente. Isto é descrito abaixo. </li></ol></li><li> Vortex-se a mistura resultante em alta (velocidade 10 de 10) durante 10 segundos para misturar antes de usar. &lt;/ Li&gt; <li> Uso de hidrogel bioink <ol><li> Para extrusão ou ensaios bioprinting, transferir a mistura em um cartucho de seringa ou impressora e permitir que a ligação cruzada de forma espontânea, durante 30 minutos (etapa 1 de reticulação) a 37 ° C. </li><li> Para medições reológicas, transferir a mistura numa placa de Petri de 35 milímetros e permitir que ele para reticular durante 30 min. Nota: A mistura imediatamente começa a reticular por meio de formação da ligação tiol-acrilato e começará a aumentar em viscosidade. A mistura deve ser transferido para uma seringa, cartucho de impressão, ou local alvo dentro de 10 minutos para evitar o entupimento de uma pipeta ou uma seringa durante a transferência. </li><li> Quando é desejada reticulação secundária (fase 2), a fase de irradiar um geles reticulados com luz ultravioleta (365 nm, 18 W / cm2) para se iniciar uma reacção de polimerização tiol-alcino. Nota: A duração da irradiação é dependente da área da superfície do material. Em geral, um centímetro quadrado de material requer apenas 1-2 segundos de exposição de UV a esta fonte de UV. </li></ol></li></ol> Teste de Compatibilidade 2. Printer <ol><li> Antes de testes de integração com dispositivos bioprinting, características de teste de extrusão sobre a bancada de laboratório com testes de extrusão simples usando seringas padrão e pontas de agulha de pequeno calibre (20-30 bitola). <ol><li> Empurre a bioink através de uma seringa padrão para alcançar filamentos suavemente extrudados de hidrogel com poucos ou sem solavancos. Extrusão de linhas ou padrões simples é suficiente para determinar o sucesso. </li></ol></li><li> Para a integração bioprinter, carregar bioink preparações pipetando-los em cartuchos de impressora, e permitir 30 min para o bioink se submeter espontânea estágio 1 de reticulação dentro do cartucho. Nota: O volume de bioink depende da aplicação específica e deve ser determinada pelo utilizador. Cartuchos de impressora podem assemelhar-se ou ser seringas que são compatíveis com o dispositivo bioprinter. </li><li> Avaliar a compatibilidade de extrusãopara bioprinting imprimindo um padrão simples usando o bioink. Por exemplo, imprimir um padrão de 7 x 7 milímetros composta de linhas paralelas. Aplicar pressão (pressão pneumática por exemplo, 20 kPa), enquanto a cabeça de impressão se desloca no plano XY a uma velocidade de cerca de 300 mm / min. Nota: os diâmetros de bicos da cabeça de impressão de diferentes tamanhos podem ser usados, mas os bicos cónicos com aberturas de 400-500 um de diâmetro são óptimas para a impressão de esferóides no intervalo de 250-350 um. <ol><li> Se os materiais extrudados são irregulares ou irregulares, consulte o passo 2.4, ou reduzir a quantidade de PEGDA para amolecer o material reticulado estágio 1. formulações bioink devidamente preparados expulsar sem problemas, permitindo a deposição precisa em padrões ou arquiteturas desejados. Nota: Os procedimentos bioprinting uso descrito um costume 3-D dispositivo bioprinting projetado em casa especificamente para o tecido construir a impressão 32 Como tal, os parâmetros de impressão específicas variam drasticamente para cada tipo de dispositivo e requerem testin.g pelo utilizador. </li></ol></li><li> Para melhorar as propriedades de extrusão, complementar não modificada HA e gelatina para os bioinks (1,5 mg / ml e 30 mg / ml, respectivamente). </li></ol> 3. Validação por bioprinting com construções de fígado primário <ol><li> Prepare 3-D esferóides fígado célula primária por enforcamento métodos de queda como o componente celular 33 Nota: bioprinting pode ser realizada sem esferóides, mas em vez disso com as células individuais em suspensão nas bioinks hidrogel bem. Os esferóides são empregues aqui para acelerar as interacções célula-célula e construir funcionalidade. O número de esferóides ou células empregues depende da aplicação específica e deve ser determinada pelo utilizador. Estes passos devem ser realizados sob condições estéreis, utilizando fontes estéreis. <ol><li> Prepare HCM, adicionando o conteúdo descongelados do kit de componentes suplemento HCM para a mídia de hepatócitos basal (HBM) e filtragem estéril. <ol><li> Descongelar o componentes do suplemento until líquido. </li><li> Adicionar os componentes do suplemento (ácido ascórbico, 0,5 ml; albumina de soro bovino [ácido gordo livre], 10 ml; gentamicina / sulfato de anfotericina B, 0,5 ml; hidrocortisona 21-hemissuccinato, 0,5 ml; insulina, 0,5 ml; factor de crescimento epidérmico humano recombinante , 0,5 ml; transferindo, 0,5 mL) à 500 ml HBM. </li><li> Filtrar em condições estéreis através de um ou de 0,45 um filtro de 0,22 uM utilizando uma unidade de filtro de topo de garrafa ou de um filtro de ponta de seringa. </li></ol></li><li> Determinar a densidade celular de hepatócitos humanos primários, células de Kupffer e células estreladas por contagem em um hemocitómetro após cada tipo de célula foi descongelado de acordo com as instruções dos fabricantes. </li><li> Combinar hepatócitos humanos primários, células de Kupffer e células estreladas numa razão 80:10:10 pelo número de células em meios de CMH, que foi aquecido a 37 ° C num tubo cónico. Nota: O volume do material a ser usado depende do número total da célula específica para a aplicação e deve ser determinada por The usuário. </li><li> Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 520 xg a 20 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante, deixando para trás o sedimento celular. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em meio de HCM, para se obter uma suspensão de células contendo 1000 células por meios 40 ul. O volume total é dependente do número de esferóides a ser produzido. </li><li> Transferir a suspensão de células a placas de 96 poços gota formato de suspensão. Adicionar um total de cerca de 1000 células para cada poço na CMH e manter a 37 ° C, em 5% de CO 2 durante 3 dias, durante o qual esferóides multicelulares formam. </li><li> Recolhe esferóides fígado a partir do prato de gota suspensa usando um pipetador. Transfira para um tubo de 15 ml estéril. </li></ol></li><li> esferóides fígado Bioprint em bioink hidrogel específico do fígado <ol><li> Prepara-se uma formulação de fígado contendo ECM bioink hidrogel tal como descrito no Passo 1, utilizando 8% PEGDA e 8% de PEG com 8 braços alcino como agentes de reticulação. Use esta combinação para a sua capacidade em resulting em um hidrogel de perto no módulo de elasticidade ao corte de tecido do fígado nativo. </li><li> Deixe os esferóides se depositam no fundo do tubo cónico em que foram colocados no passo 3.1.7. Isso varia de acordo com o tamanho e densidade esferóide, mas geralmente ocorre dentro de 1-2 min. Remova toda a mídia com cuidado aspiração ou com uma pipeta. </li><li> Transferir o volume desejado de solução de hidrogel bioink preparada de fresco ao tubo cónico contendo os esferóides. Geralmente, é adequado um volume de 10% -25% maior do que o volume da construção 3-D a ser impresso. Cuidadosamente pipeta cima e para baixo para voltar a suspender os esferóides na solução de hidrogel bioink. Transferir para um cartucho bioprinter usando uma pipeta ou pipeta serológica. </li><li> No interior do cartucho de bioprinter, permitir que a solução submetida à primeira fase de reticulação (reacção tiol-acrilato) durante 30 min. Nota: Dependendo do tamanho do esferóide, o cartucho pode ter de ser rodado lentamente ou o conteúdo pode ter de ser misturada comuma espátula estéril para manter os esferóides distribuídos por todo o bioink durante a fase de uma reticulação. Isto é menos de uma necessidade para bioinks preparados com células em suspensão em vez de esferóides. Nota: Após a fase 1 de reticulação, os usuários têm uma janela de funcionamento de várias horas. No entanto, recomenda-se realizar o processo de bioprinting rapidamente para melhorar a viabilidade celular. </li><li> Após uma fase de reticulação, utilizar um dispositivo bioprinting para criar estruturas de hidrogel desejados contendo os esferóides hepáticos primários (ou outras células). Nota: Esta tecnologia proporciona um sistema para biofabricating uma ampla variedade de estruturas. Parâmetros tais como o volume total, o número de células ou esferóides, a geometria da estrutura de impresso, e o substrato sobre o qual são impressas as construções são altamente dependentes dos objectivos do utilizador. </li><li> Após a deposição para a configuração desejada, administrar luz UV durante 2-4 segundos para iniciar o mecanismo de reticulação secundária, estabilizando a constructs e aumento da rigidez para o nível desejado. Nota: A concentração de PEG-alcino, e, assim, a densidade global de reticulação final, controla principalmente a rigidez construção final. </li><li> Repetir o 3.2.4 e 3.2.5 passos, a fim de criar estruturas de várias camadas. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Autores não têm nada a revelar.

Existem vários componentes que são essenciais para considerar quando se tenta biofabricate 3-D construções de tecido, para eventual utilização em humanos ou para aplicações de rastreio in vitro. Empregando os componentes celulares adequadas determina o fim funcionalidade potencial, enquanto o próprio dispositivo biofabrication determina a metodologia geral para atingir a construção final. O terceiro componente, o biomaterial, é igualmente importante, uma vez que serve duplo papel. Especificamente, o componente ...

Nos últimos anos, uma grande variedade de tecnologias tornaram-se disponíveis, que aborda a necessidade de fontes alternativas de órgãos e tecidos funcionais através pretende fabricar, ou biofabricate, eles. Bioprinting emergiu como um dos mais promissores destas tecnologias. Bioprinting pode ser pensado como uma forma de fabrico aditivo robótico de partes biológicas, que podem ser usados ​​para construir ou de padrão viável estruturas de órgãos ou de tipo de tecido, como em 3 dimensões. 1 Na maior parte dos casos, bioprinting emprega um 3-dimensional (3 D) do dispositivo de impressão que é dirigido por um computador para depositar as células e biomateriais em posições precisas, recapitulando assim anatomicamente-imitando arquitecturas fisiológicas. 2 Estes dispositivos de impressão de um &quot;bioink&quot;, que podem assumir a forma de agregados de células, as células encapsuladas em hidrogéis ou fluidos viscosos, ou microtransportadores de células-semeado, bem como polímeros isentos de células que fornecem a estrutura mecânica ou agir como PLA isento de célulasceholders. 3,4 Na sequência do processo bioprinting, a estrutura resultante pode ser amadurecido em tecidos ou órgãos estruturas funcionais, e utilizado para a sua aplicação final pretendida. 5,6 Até à data, um órgão de tamanho humano totalmente funcional completa não foi impressa, mas continua a ser o principal objetivo de longo prazo de bioprinting pesquisa e desenvolvimento. 2 no entanto, em pequena escala &quot;organï¿½de&quot; construções de tecido estão actualmente a ser implementado em uma série de aplicações, incluindo modelagem de patologia, desenvolvimento de medicamentos e rastreio de toxicologia. Um dos principais obstáculos que os pesquisadores têm encontrado na aplicação de tecnologia bioprinting é que muito poucos materiais foram desenvolvidos para o propósito explícito de bioprinting. Para ter sucesso efetivamente em bioprinting, um biomaterial deve cumprir 4 requisitos básicos. O biomaterial tem de ter: 1) as propriedades mecânicas apropriadas para permitir a deposição (seja extrusão através de um bocal como um gel ou um inkjet como uma gota), 2) a capacidade de manter a sua forma como um componente de uma estrutura 3-D após a deposição, 3) a capacidade de controle do usuário sobre os 2 características anteriores, e 4) ambiente amigável e de suporte de uma célula em tudo as fases do processo bioprinting. 7 Historicamente, bioprinting trabalho tem muitas vezes tentou empregar biomateriais tradicionais existentes em dispositivos bioprinting sem consideração a sua compatibilidade, em vez de projetar um biomaterial para ter as propriedades necessárias para bioprinting e aplicações pós-impressão subseqüentes. Uma variedade de bioinks têm sido desenvolvidas recentemente para melhor interface com o equipamento de fabricação e deposição. sistemas de hidrogel padrão representar problemas significativos porque geralmente existem como um ou outro precursor de soluções de fluidos com propriedades mecânicas insuficientes, ou hidrogéis polimerizados que se impressos podem entupir bicos ou tornar-se dividido sobre o processo de extrusão. A nossa equipa, bem como others, têm explorado várias formulações de hidrogel para resolver estes problemas bioprinting, incluindo impressão esferóide célula em substratos de hidrogel, 5,8 celular e filamentos de hidrogel de extrusão de tubos microcapilares, 9-11 extrudable ácido hialurônico (AH) hidrogéis de nanopartículas -Gold com propriedades de reticulação dinâmicos , 12 controlo temporal da rigidez hidrogel utilizando fotopolimerizável metacrilado HA e gelatina, 13 de reticulação à base de fibrinogênio-trombina, 14,15 géis de alginato-colágeno troca iônica, 16 e recentemente rápida polimerização por luz ultravioleta (UV) reticulação -initiated, 17 Estes exemplos demonstram a viabilidade de materiais que geram que pode por bioprinted eficazmente. No entanto, para além de integração com o hardware, com sucesso para gerar construções de tecido 3-D viáveis ​​e funcionais, biomateriais deve conter sinais bioquímicos e mecânicos que ajuda na manutenção celularviabilidade e função. Estes factores adicionais, perfis bioquímicos e mecânicos, pode ter uma influência significativa sobre a função bem sucedida de construções de tecido bioprinted. Ambas as células e a matriz extracelular nativa (ECM) são responsáveis ​​por apresentar uma vasta gama de moléculas de sinalização, tais como factores de crescimento e outras citoquinas a outras células. A combinação destes sinais varia de tecido para tecido, mas pode ser extremamente potente e influente na regulação do comportamento celular e tecidual. 18 Empregando componentes ECM específicos de tecidos a partir de diferentes órgãos e execução como um hidrogel ou como parte de um hidrogel tem sido explorada com sucesso. 19-21 Esta abordagem, que é composta de descelularizante um dado tecido, pulverizando-o, e dissolvendo-o, pode ser utilizado para produzir sinais bioquímicos específicos de tecido a partir de qualquer tecido e pode ser incorporada em 3-D construções de hidrogel 22. Além disso,é amplamente documentado que os tecidos do corpo ocupam uma grande variedade de rigidezes 23 como tal., a capacidade para sintonizar as propriedades mecânicas de biomateriais, tais como o módulo de elasticidade E &#39;ou módulo de cisalhamento G elástica&#39;, é uma ferramenta útil em engenharia de tecidos . Como descrito acima, o controlo de propriedades mecânicas bioink permite biofabrication à base de extrusão usando um gel suave, o que pode, em seguida, ainda manipulado por reticulação secundário, a um ponto mais tarde, altura em que os níveis do módulo de elasticidade pode ser alcançada que coincidir com o tipo de órgão-alvo. Por exemplo, biomateriais pode ser personalizado para corresponder a uma rigidez de 5-10 kPa como um fígado nativo, 23, ou coincidir com uma rigidez de 10-15 kPa como o tecido cardíaco nativo, 24,25, em teoria, aumentar a capacidade destes para funcionar em Organóides um modo semelhante aos seus homólogos tecido nativo. A influência da rigidez do ambiente no fenótipo da célula tem sido explored nos últimos anos, particularmente em relação às células-tronco. Engler et ai. Demonstrou que a elasticidade do substrato auxiliado na condução células estaminais mesenquimais (MSC) no sentido de linhagens com a elasticidade do tecido correspondente ao do substrato. 25 Este conceito tem sido explorada para a diferenciação no músculo, a função cardíaca, fenótipo hepática, a proliferação de células-tronco hematopoiéticas e manutenção do potencial terapêutico das células estaminais. 24,26-29 ser capaz de sintonizar um hidrogel de diferentes módulos de elasticidade é uma característica importante de um biomaterial que vai ser utilizado para biofabricate construções de tecido 30. Descrevemos aqui um protocolo que representa uma abordagem versátil utilizado no nosso laboratório para formular um sistema de hidrogel que pode ser de extrusão bioprinted e personalizado para 1) contêm o perfil bioquímico de um tipo de tecido particular, e 2) imitar o módulo de elasticidade desse tipo de tecido . Ao abordar esses requisitos, pretendemos provide um material que pode recapitular as características físico-químicas e biológicas do tecido in vivo. 31 O sistema composto hidrogel modular aqui descrito tira vantagem de uma abordagem de reticulação multi-para se obter bioinks extrudiveis, e permite uma reticulação secundária para estabilizar e aumenta a rigidez da produtos finais para corresponder a uma gama de tipos de tecidos. personalização bioquímica é cumprida usando componentes da matriz extracelular de tecidos específicos. Como uma demonstração, nós empregamos uma variedade específica de fígado deste sistema hidrogel para bioprint fígado funcional construções organï¿½de. O protocolo descrito usa um personalizado 3-D dispositivo bioprinting. Em geral, este protocolo pode ser adaptado para a maioria das impressoras de extrusão, os parâmetros de impressão específicas variar drasticamente para cada tipo de dispositivo e exigir testes pelo utilizador.

<table><tbody><tr><td>Ácido hialurônico</td><td>Sigma</td><td>53747</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G6144</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroxi-4&prime;-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona</td><td>Sigma</td><td>410896 Kit de</td><td></td></tr><tr><td>hidrogel de ácido hialurônico e gelatina (HyStem-HP)</td><td>ESI-BIO</td><td>GS315</td><td>O kit contém os componentes Heprasil (ácido hialurônico tiolado e heparinizado), Gelin-S (tiolado gelatina) e Extralink (PEGDA)</td></tr><tr><td>PEG 8-Arm Alkyne, 10&nbsp; kDa</td><td>Creative PEGWorks</td><td>PSB-887</td><td></td></tr><tr><td>Hepatócitos humanos primários</td><td>Triangle Research Labs</td><td>HUCPM6</td><td></td></tr><tr><td>Células estreladas primárias do fígado humano</td><td>ScienCell</td><td>5300</td><td></td></tr><tr><td>Células primárias de Kupffer humanas</td><td>Life Technologies</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>Hepatócito Basal Media (HBM)</td><td>Lonza</td><td>CC-3199</td><td></td></tr><tr><td>Hepatócito Media Kit de Suplemento</td><td>Lonza</td><td>CC-3198</td><td>HCM SingleQuot Kits (contém ácido ascórbico, 0.5&nbsp; Ml; Albumina de Soro Bovino [Livre de Ácidos Graxos], 10&nbsp; Ml; sulfato de gentamicina/anfotericina B, 0,5&nbsp; Ml; hidrocortisona 21-hemisuccinato, 0,5&nbsp; Ml; insulina, 0,5&nbsp; Ml; fator de crescimento epidérmico recombinante humano, 0,5&nbsp; Ml; transferência, 0,5&nbsp; ml)</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Outros fabricantes estão ok.</td></tr><tr><td>Hidróxido de amônio</td><td>Fischer Scientific</td><td>A669</td><td>Outros fabricantes estão ok.</td></tr><tr><td>Tecido fresco de cadáver suíno</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Moinho congelador</td><td>qualquer</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Bioimpressora</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>A bioimpressora aqui descrita foi construída internamente. Em geral, outros dispositivos são adequados, desde que suportem a impressão baseada em extrusão controlada por computador de materiais de hidrogel.</td></tr><tr><td>Placa de cultura de células suspensa</td><td>InSphero</td><td>CS-06-001 Plataforma de</td><td>cultura 3D InSphero GravityPlus</td></tr></tbody></table>

bioprinting celularizado constrói usando um específico do tecido hidrogel bioink

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

A bioimpressão surgiu como uma abordagem versátil de biofabricação para a criação de construções de órgãos de engenharia de tecidos. Essas construções têm uso potencial como substitutos de órgãos para implantação em pacientes e também, quando criadas em uma escala de tamanho menor, como "organoides" modelo que podem ser usados em sistemas in vitro para triagem de drogas e toxicologia.
Apesar do desenvolvimento de uma ampla variedade de dispositivos de bioimpressão, a aplicação da tecnologia de bioimpressão pode ser limitada pela disponibilidade de materiais que agilizam os procedimentos de bioimpressão e apoiam a viabilidade e a função celular, fornecendo pistas específicas do tecido. Aqui descrevemos um sistema versátil de ácido hialurônico (HA) e hidrogel à base de gelatina composto por um protocolo de reticulação de 2 estágios multireticulador, que pode fornecer sinais bioquímicos específicos do tecido e imitar as propriedades mecânicas dos tecidos in vivo. 
Fatores bioquímicos são fornecidos pela incorporação de materiais de matriz extracelular derivados de tecidos, que incluem fatores de crescimento potentes. As propriedades mecânicas do tecido são combinações controladas de reticuladores baseados em PEG com pesos moleculares variados, geometrias (lineares ou multibraço) e grupos funcionais para produzir biotintas extrudáveis e valores finais de rigidez ao cisalhamento de construção em uma ampla faixa (100 Pa a 20 kPa). Usando esses parâmetros, biotintas de hidrogel foram usadas para bioimprimir esferoides hepáticos primários em uma biotinta específica do fígado para criar construções hepáticas in vitro com alta viabilidade celular e produção funcional mensurável de albumina e ureia. Esta metodologia fornece uma estrutura geral que pode ser adaptada para futura personalização de hidrogéis para biofabricação de uma ampla gama de tipos de construção de tecido.

Quando os processos acima descritos são seguidos correctamente, hidrogeles devem conter um perfil bioquímico específico para o tipo de tecido alvo, 20 para permitir um elevado grau de controlo sobre bioprinting e módulo de elasticidade final, e 34 suportam células viáveis ​​funcionais em construções de tecido. hidrogel Personalização Para melhor fígado nativo mímico, o bioink hidro...

Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar uma abordagem versátil para o desenvolvimento de bioinks em hidrogel que possam ser extrudidos por meio de dispositivos de bioimpressão. Os bioinks podem então ser utilizados para fabricar construtos tridimensionais de tecidos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de bioimpressão, como a forma de controlar as propriedades mecânicas necessárias para fornecer um material que possa ser extrudido usando um bioimpressor.A principal vantagem desta técnica é que utilizamos componentes comercialmente disponíveis combinados de forma modular para criar um bioink de hidrogel simples e eficaz, passível de bioprintagem. As aplicações dessas tecnologias incluem a criação de organoides tridimensionais que podem ser usados para modelar com precisão os efeitos de fármacos, toxinas e doenças. Embora este método possa fornecer uma estrutura para a bioprintagem de construtos hepáticos tridimensionais, ele também pode ser aplicado a outros tipos de tecidos, como músculo, pulmão e cólon.De modo geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque são utilizados diversos reagentes diferentes para criar a bioink em hidrogel, mas o processo é na verdade bastante simples. O procedimento será demonstrado por Young-Joon Seol, um pós-doutorando da nossa equipe. Para começar, prepare um digesto de matriz extracelular específico para o tecido, a ser usado na formulação do hidrogel, conforme descrito em outro lugar.Em seguida, dissolva um fotoiniciador em água numa proporção de peso por volume de 0,1%. Para formar as bioinks de hidrogel, primeiro dissolva os componentes da matriz básica dos kits de hidrogel de ácido hialurônico em alíquotas individuais da solução aquosa de fotoiniciador. Depois, combine a solução de matriz extracelular, o ácido hialurônico tiolado 2%, a gelatina tiolada 2%, os agentes de reticulação e o meio de cultura de hepatócitos nas proporções indicadas aqui. Para melhorar as propriedades de extrusão da bioink, adicione 1,5 miligramas por mililitro de ácido hialurônico não modificado e 30 miligramas por mililitro de gelatina à mistura.Em seguida, agite a mistura resultante em vórtex em alta velocidade por dez segundos antes do uso. Antes de testar o bioink em um dispositivo de bioprintagem, teste primeiramente as características de extrusão na bancada do laboratório. Utilizando uma seringa padrão, retire uma amostra do bioink e, em seguida, acople uma agulha de 20 a 30 gauge na seringa.Permita que o bioink sofra reticulação e, em seguida, empurre o bioink através da agulha para obter filamentos de hidrogel extrudidos suavemente. Se a formulação for capaz de criar um filamento com poucas ou nenhuma saliência, então está pronta para a bioprintagem. Para carregar as preparações de bioink em uma bioprintadora, pipete o bioink para dentro de cartuchos esterilizados da impressora.Deixe-os repousar por 30 minutos antes da extrusão, pois a bio-tinta sofrerá cruzamento espontâneo de estágio um dentro da cartela. Em seguida, carregue a cartela na configuração de impressão e conecte uma fonte de pressão pneumática à cartela. Prepare um padrão simples, como esta grade de sete por sete milímetros com linhas paralelas, para imprimir, a fim de avaliar sua compatibilidade com a extrusão.Enquanto o cabeçote de impressão se move no plano XY a uma velocidade de aproximadamente 300 milímetros por minuto, aplique uma pressão de 20 quilopascal ao cartucho para extrusão do bioink. Se os materiais extrusados apresentarem grumos ou irregularidades, reduza a quantidade do agente de reticulação adicionado, com o objetivo de suavizar o material reticulado na etapa um. Uma formulação de bioink adequadamente preparada deve ser extrusada de forma homogênea, permitindo deposição precisa e arquiteturas bem definidas.Prepare esferoides hepáticos de células primárias tridimensionais em uma placa de 96 poços utilizando o método da gota suspensa, conforme descrito no protocolo de texto complementar. Após três dias em cultura, colete os esferoides hepáticos da placa de gota suspensa usando uma pipeta e transfira-os para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Deixe os esferoides sedimentarem no fundo do tubo cônico por um a dois minutos.Em seguida, aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta. Transfira de 110 a 125 por cento do volume desejado do constructo impresso em 3D da solução de bioink hidrogel recém-preparada para o tubo cônico contendo os esferoides. Em seguida, pipete os esferoides suavemente para cima e para baixo para re-suspenderlos na solução de bioink hidrogel.Uma vez suspensas uniformemente, transfira a solução de esferoides para uma cartela de bioprintagem usando uma pipeta e deixe a solução passar pela primeira etapa de reticulação por 30 minutos. Após essa etapa de reticulação, utilize um dispositivo de bioprintagem para criar as estruturas desejadas de hidrogel contendo os esferoides hepáticos primários. Após cada camada depositada, exponha a bio-tinta impressa à luz UV por dois a quatro segundos para iniciar o mecanismo secundário de reticulação.Isso estabilizará as estruturas e aumentará a rigidez ao nível desejado. A concentração de alquino de PEG na solução é o que controla a densidade geral de reticulação e, portanto, controla principalmente a rigidez da estrutura final. Após a bioimpressão, observou-se alta viabilidade celular nas estruturas hepáticas utilizando microscopia confocal.Em condições ambientais ideais, a viabilidade deve ser superior a 85%. Além disso, quando os constructos foram corados para marcadores indicativos de tecido hepático, observou-se expressão positiva de CYP3A4, uma isoforma do citocromo P450, albumina intracelular, E-caderina, uma proteína de adesão célula-célula epitelial, e DPP4, uma proteína altamente expressa no fígado. Quando o meio de cultura foi analisado quanto aos níveis de ureia e albumina, verificou-se que o constructo secretou tanto ureia quanto albumina em níveis constantes ao longo do período de 14 dias. Isso reforça a ideia de que as biotintas de hidrogel específicas para tecidos auxiliam na manutenção da função das células hepáticas.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de duas horas do início ao fim, se realizada corretamente. No entanto, isso geralmente depende do dispositivo de bioimpressão específico que é empregado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os passos demonstrados muitas vezes precisam ser adaptados para serem compatíveis com outros tipos de tecidos ou dispositivos de bioimpressão.Após este procedimento, outras formulações de bioinks de hidrogel podem ser criadas para suportar a bioimpressão de outros tipos de tecidos. O desenvolvimento dessas tecnologias ajudou a abrir caminho para a criação de plataformas de órgãos múltiplos, tipo corpo-em-um-chip, para triagem de fármacos e modelagem de doenças. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como começar a projetar materiais que possam ser usados para a bioimpressão de estruturas de tecidos tridimensionais utilizando reticulação em múltiplas etapas.Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso para a visão, e precauções como o uso de óculos de proteção contra UV devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

bioprinting-cellularized-constructs-using-tissue-specific-hydrogel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

Uma bioimpressora cartesiana foi projetada e fabricada para permitir a deposição de vários materiais em geometrias precisas e reprodutíveis, ao mesmo tempo em que permite o controle de fatores ambientais. Utilizando a bioimpressora tridimensional, construções complexas e viáveis podem ser impressas e facilmente reproduzidas.

Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

Este protocolo descreve uma metodologia de bioimpressão usando um sistema de depósito robótico automatizado que incorpora pistas de orientação topográfica gravadas com a deposição precisa de uma biotinta de hidrogel contendo células. As células impressas são entregues diretamente aos recursos gravados e são capazes de sentir e orientar com eles.

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Análogos de cartilagem e pele foram bioprinted usando um bioink de nanocellulose-alginato com base. Os bioinks era compartimentados antes da impressão através de uma unidade de mistura passiva de passo único. As construções foram demonstradas para ser uniformemente compartimentado, têm alta viabilidade e exibem favoráveis marcadores de diferenciação.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

Apresentado aqui é um método para a bioimpressão 3D de gelatina methacriloyl.

Protocolos de bioimpressão 3D de bioinks baseados em hidrogel de gelatina

Aqui, desenvolvemos uma nova estratégia modificada multicamadas para bioinks semelhantes a líquidos (gelatina methacryloyl com baixa viscosidade) para evitar a sedimentação de células encapsuladas.

Usando bioink de hidrogel multicamadas em bioimpressão tridimensional para distribuição celular homogênea

Este protocolo destaca um método para avaliar rapidamente a biocompatibilidade de uma nanocelulose cristalina (CNC)/agarose tinta biomaterial de hidrogel composto com células de mastro derivadas da medula óssea em termos de viabilidade celular e expressão fenotípica dos receptores de superfície celular, Kit (CD117) e receptor IgE de alta afinidade (FcεRI).

Fabricação de uma nanocelulose cristalina incorporada tinta biomaterial agarose para cultura de célula de mastro derivada da medula óssea

Este protocolo descreve uma técnica de impressão 3D para fabricar estruturas semelhantes a ossos, depositando uma tinta de fosfato de cálcio em um suporte granular à base de gelatina. Os análogos ósseos impressos são depositados em forma livre, com flexibilidade para a colheita direta da impressão ou reticulação dentro de uma matriz celular viva para construções multifásicas.

Bioimpressão Cerâmica Omnidirecional em Suspensões Carregadas de Células para a Geração de Análogos Ósseos

Aprenda a desenvolver bioinks de hidrogel tecido-específicos para bioprinting 3D usando componentes modulares comerciais. Este método permite fabricar construtos teciduais funcionais para modelagem de doenças e testes de drogas in vitro.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

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