Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar uma abordagem versátil para projetar biotintas de hidrogel que podem ser extrudadas por meio de dispositivos de bioimpressão. As biotintas podem então ser usadas para fabricar construções tridimensionais de tecidos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da bioimpressão, como controlar as propriedades mecânicas necessárias para fornecer um material que possa ser extrudado usando uma bioimpressora.

A principal vantagem desta técnica é que usamos componentes disponíveis comercialmente combinados de forma modular para criar uma biotinta de hidrogel bioimprimível simples e eficaz. As aplicações dessas tecnologias incluem a criação de organoides de tecido 3D que podem ser usados para modelar com precisão os efeitos de drogas, toxinas e doenças. Embora esse método possa fornecer uma estrutura para bioimprimir construções de fígado 3D, ele também pode ser aplicado a outros tipos de tecido, como músculo, pulmão e cólon.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades porque há vários reagentes diferentes usados para criar a biotinta de hidrogel, mas na verdade é bastante simples. Demonstrando o procedimento estará Young-Joon Seol, um pós-doutorado em nossa equipe. Para começar, prepare um resumo de matriz extracelular específico do tecido para ser usado na formulação de hidrogel, conforme descrito em outro lugar.

Em seguida, dissolva um fotoiniciador em água a uma proporção de peso por volume de 0,1% Para formar as biotintas de hidrogel, primeiro dissolva os componentes do material de base dos kits de hidrogel de ácido hialurônico em alíquotas individuais da solução do fotoiniciador de água. Em seguida, combine a solução de ECM, o ácido hialurônico 2% tiolado, a gelatina 2% tiolada, os reticuladores e os meios de cultura de hepatócitos nas proporções mostradas aqui. Para melhorar as propriedades de extrusão da bioink, adicione 1,5 miligramas por mililitro de ácido hialurônico não modificado e 30 miligramas por mililitro de gelatina à mistura.

Em seguida, bata a mistura resultante em alta por dez segundos antes de usar. Antes de testar a biotinta em um dispositivo de bioimpressão, primeiro teste as características de extrusão na bancada do laboratório. Usando uma seringa padrão, coloque uma amostra da biotinta e, em seguida, coloque uma agulha de calibre 20 a 30 na seringa.

Deixe a biotinta reticular e, em seguida, empurre a biotinta através da agulha para obter filamentos de hidrogel extrudados suavemente. Se a formulação for capaz de criar um filamento com poucas ou nenhuma saliência, ela estará pronta para a bioimpressão. Para carregar as preparações de biotinta em uma bioimpressora, pipete as biotintas em cartuchos de impressora esterilizados.

Deixe-os descansar por 30 minutos antes da extrusão, pois a biotinta passará por uma reticulação espontânea dentro do cartucho. Em seguida, carregue o cartucho na configuração de impressão e conecte uma fonte de pressão pneumática ao cartucho. Prepare um padrão simples, como esta grade de sete por sete milímetros de linhas paralelas, para imprimir a fim de avaliar sua compatibilidade de extrusão.

Enquanto a cabeça de impressão se move no plano XY a uma velocidade de aproximadamente 300 milímetros por minuto, aplique uma pressão de 20 quilopascais no cartucho para extrudar a bioink. Se os materiais extrudados forem irregulares ou irregulares, reduza a quantidade de reticulador adicionado para amolecer o material reticulado do estágio um. Uma formulação de bioink devidamente preparada deve extrudar suavemente, permitindo deposição e arquiteturas precisas.

Prepare esferóides hepáticos de células primárias 3D em uma placa de 96 poços usando o método de gota suspensa, conforme descrito no protocolo de texto anexo. Após três dias de cultura, colete os esferóides hepáticos da placa suspensa usando uma pipeta e transfira-os para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Deixe os esferóides assentarem no fundo do tubo cônico por um a dois minutos.

Em seguida, aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta. Transfira 110 a 125 por cento do volume de construção 3D impresso desejado da solução de biotinta de hidrogel recém-preparada para o tubo cônico contendo os esferoides. Em seguida, pipete cuidadosamente os esferoides para cima e para baixo para ressuspendê-los na solução de biotinta de hidrogel.

Uma vez uniformemente suspensa, transferir a solução esferóide para um cartucho de bioimpressora utilizando uma pipeta e deixar a solução passar pela primeira fase de reticulação durante 30 minutos. Após o estágio de reticulação, use um dispositivo de bioimpressão para criar as estruturas de hidrogel desejadas contendo os esferóides primários do fígado. Após cada camada de deposição, exponha a biotinta impressa à luz UV por dois a quatro segundos para iniciar o mecanismo de reticulação secundário.

Isso estabilizará as construções e aumentará a rigidez para o nível desejado. A concentração de alcino PEG na solução é o que controla a densidade geral de reticulação e, portanto, controla principalmente a rigidez da construção final. Após a bioimpressão, foi observada alta viabilidade celular nas construções hepáticas por meio de microscopia confocal.

Em condições ambientais ideais, a viabilidade deve ser superior a 85% Além disso, quando as construções foram coradas para marcadores indicativos de tecido hepático, foram observadas expressões positivas de CYP3A4, uma isoforma do citocromo P450, albumina intracelular, E-caderina, uma proteína epitelial de adesão célula-célula, e DPP4, uma proteína altamente expressa no fígado. Quando os meios de cultura foram testados quanto aos níveis de uréia e albumina, verificou-se que a construção secretou uréia e albumina em níveis constantes ao longo do curso de 14 dias. Isso sugere ainda que as biotintas de hidrogel específicas do tecido ajudam a manter a função das células do fígado.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de duas horas do início ao fim, se for executada corretamente. No entanto, isso geralmente depende do dispositivo de bioimpressão específico empregado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as etapas demonstradas geralmente devem ser adaptadas para serem compatíveis com outros tipos de tecidos ou dispositivos de bioimpressão.

Após este procedimento, outras formulações de biotinta de hidrogel podem ser criadas para apoiar a bioimpressão de outros tipos de tecido. O desenvolvimento dessas tecnologias ajudou a pavimentar o caminho para a criação de plataformas multi-organoides, body-on-a-chip, para a triagem de medicamentos e modelagem de doenças. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como começar a projetar materiais que podem ser usados para bioimpressão de construções de tecidos 3D usando reticulação em várias etapas.

Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso para a visão, e precauções como o uso de óculos de proteção UV devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.