Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

Este protocolo descreve uma metodologia de bioimpressão usando um sistema de depósito robótico automatizado que incorpora pistas de orientação topográfica gravadas com a deposição precisa de uma biotinta de hidrogel contendo células. As células impressas são entregues diretamente aos recursos gravados e são capazes de sentir e orientar com eles.

O objetivo geral dessa técnica de distribuição robótica automatizada é criar uma superfície para orientação topográfica da célula e, em seguida, entregar as células a esses recursos seguindo um padrão programado, permitindo o controle sobre o comportamento e a distribuição da célula. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia biomédica, como como as topologias de superfície podem afetar o comportamento celular, tanto em monocultura quanto em co-cultura. A principal vantagem dessa técnica é que é menos demorado programar e imprimir o padrão de orientação celular em comparação com métodos mais estabelecidos.

Também inclui etapa de entrega de células para dispensação controlada. Tivemos a ideia para esse método quando percebemos que os padrões 2D de células depositadas em hidrogéis poderiam se beneficiar da orientação da superfície. Como tal, desenvolvemos essa técnica para imprimir hidrogéis de uma maneira que correspondesse às características da superfície.

Este protocolo descreve o uso do sistema de distribuição robótica assistido por contrapressão como uma bioimpressora baseada em gravação de superfície e extrusão. Para preparar uma superfície de poliestireno para a gravação e impressão, selecione uma folha de poliestireno de um milímetro de espessura. Lençóis mais grossos se curvarão mais.

Em seguida, trate a folha com plasma de oxigênio. Ajuste o regulador de gás oxigênio para duas barras. Em seguida, ligue a máquina de plasma e ligue a bomba de vácuo.

Prossiga para programar a máquina para 150 watts e 30 centímetros cúbicos padrão por minuto de fluxo de gás oxigênio e exponha a folha a essas condições por 10 minutos. Em seguida, evacue a câmara e sele a porta e inicie o ciclo. Em seguida, mergulhe a folha tratada em soro bovino fetal puro e incube-a a 37 graus Celsius por duas horas com agitação.

Após o tratamento com soro, lave a folha três vezes com 1X PBS e esterilize a folha. Após a lavagem final, deixe a folha em um forno a 37 graus Celsius para secar durante a noite por aproximadamente 12 horas. Primeiro prepare uma caneta de impressão para gravura.

Com muito cuidado, insira uma agulha têxtil de 1,5 milímetro de diâmetro no bico de uma seringa dispensadora até que fique presa e presa. Ao tentar criar um arranjo bioimpresso pela primeira vez, esboce o padrão desejado em papel milimetrado com eixos numerados para gerar as coordenadas x, y. Em seguida, insira as coordenadas do padrão em uma planilha.

Em seguida, no software de impressão, selecione Programa, Adicionar Programa, seguido de Editar, Adicionar Ponto para estabelecer o programa. Em seguida, copie os valores das coordenadas x e y da planilha para o software de distribuição de impressão. Antes de cada corrida, calibre a altura z do robô para definir a posição de contato da caneta.

Primeiro, selecione a opção Robô. Em seguida, clique em Alterar modo e ative a opção Modo de ensino. Isso habilita a função JOG do robô.

Para MOVIMENTAR o robô, primeiro coloque-o em sua posição padrão selecionando Robô, Meca Initialize. Então, Robô, JOG. Em seguida, nos slots x e y, insira a distância em milímetros necessária para colocar a caneta exatamente na origem do padrão.

Em seguida, também em milímetros, insira um valor numérico no slot z para colocar a ponta ou o bico em contato com a superfície sem flexionar ou recuar a superfície. Isso é designado como o valor inicial de z. A profundidade de cada ranhura pode ser variada usando a altura z.

Por exemplo, as ranhuras cortadas podem ter 40, 80 ou 170 mícrons de profundidade. É preciso concentração e observação cuidadosa para encontrar um ponto de contato de modo que não haja flexão da caneta ou recuo perceptível na superfície. Para garantir o sucesso, recomendamos preparar várias folhas e executar o programa em diferentes alturas z para encontrar a posição inicial ideal.

O próximo passo é definir a instrução de impressão para cada um dos pontos de coordenadas. Use Início da distribuição de linha para definir o primeiro ponto e iniciar a impressão. Use Line Passing para designar os pontos intermediários e, finalmente, use End of Line Dispense para sinalizar ao robô para encerrar a impressão.

Para comunicar o programa ao robô, selecione Robô, Enviar dados C&T. Em seguida, inicie a execução selecionando Robô, Alterando o modo, Alternar modo de execução e alternando a configuração para Executar. Por fim, inicie a impressão.

Para fazer o bioink, dissolva 2% de gelatina em Alpha MEM suplementado com 10% de FBS e 2% de antibiótico antimicótico. Coloque o meio a 60 graus Celsius por duas horas para permitir que a gelatina se dissolva no meio. Cultive as células para a biotinta a 70% de confluência em placas de 10 centímetros.

Quaisquer células que respondam aos recursos de orientação de superfície podem ser usadas e devem expressar um rótulo fluorescente para que possam ser vistas durante o processo de incorporação. Solte as células anexadas na suspensão removendo o meio, lavando as células com PBS e revestindo as células com uma solução 1X Tripsina-EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius. Depois de neutralizar a tripsina com meio, recolher as células em suspensão e pellet-las a 1.000 g durante cinco minutos.

Descreva o sobrenadante e ressuspenda as células em 0,5 mililitros de meio. Depois de medir a densidade celular, misture a suspensão na solução de bioink resfriada para fazer uma solução com cinco milhões de células por milímetro. Em seguida, despeje a biotinta contendo células em uma seringa de impressão preparada bloqueada por uma tampa de isca.

Resfrie a seringa carregada a quatro graus Celsius para obter uma viscosidade imprimível. Em seguida, retire a seringa carregada e refrigerada, remova a tampa da seringa e coloque o bico de impressão. Em seguida, conecte a seringa carregada no sistema de distribuição e conecte-a às linhas de pressão de ar.

Para imprimir a biotinta no padrão pré-projetado, as bordas e linhas precisam ser distintas. A impressão precisa é realmente obtida otimizando a contrapressão do dispensador e do medidor de agulha do bico de impressão. Defina a contrapressão do dispensador para 0,05 megapascals para uma seringa de 10 mililitros com uma agulha cônica de calibre 34.

Em seguida, no software, defina a velocidade de gravação para cinco milímetros por segundo em uma superfície de filme de poliestireno. Agora, seguindo o padrão programado, deposite a biotinta celularizada nas ranhuras pré-gravadas. Depois de depositar as células, deixe a folha incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.

Mais tarde, cubra o andaime de células impressas no meio de crescimento apropriado e incube as células por 24 horas para que as células se fixem antes de novas experimentações. As células-tronco semeadas por bioimpressão dentro da biotinta eventualmente sedimentaram na superfície e foram detectadas e alongadas ao longo de uma direção das linhas discretamente gravadas. Células semeadas em meio de cultura sem bioimpressão alinhadas na direção das características também.

No entanto, eles também cobriram toda a superfície, portanto, a biotinta restringiu as células ao traço impresso. Quando semeadas em folhas sem as feições gravadas, as células não mostraram orientação ou alinhamento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gravar com precisão as ranhuras na folha de poliestireno e, em seguida, bioimprimir com precisão as células nas ranhuras.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em aproximadamente duas a três horas. É muito útil para pesquisadores no campo da bioengenharia expor as interações da superfície celular em modelos onde a anisotropia e o posicionamento celular são necessários. Não se esqueça que a biotinta contém células vivas e é muito importante usar uma técnica estéril ao imprimir as folhas.