Name: Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a técnica de dispensação robótica automatizada para bioimpressão com orientação topográfica de superfície. Este método permite controlar o comportamento celular usando hidrogéis e padrões gravados, avançando a engenharia biomédica.

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O trabalho apresentado aqui é apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa de Cingapura no âmbito do programa CREATE (NRF-Technion): A Iniciativa de Medicina Regenerativa no Programa de Pesquisa em Terapia de Restauração Cardíaca e pelo Financiamento do Setor Público (PSF) 2012 do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERC) sob a Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR).

NOTA: Este protocolo descreve a utilização de uma contra-pressão assistida sistema de distribuição robótico (Figura 1A) como uma superfície de gravação (Figura 1B) e bioprinter à base de extrusão (Figura 1C) 10. 1. Alteração de uma superfície de poliestireno <ol><li> Use 1 folhas mm de poliestireno desde placas de cultura de tecidos de poliestireno tendem a se curvar para cima no centro, arruinando a consistência altura de ambos gravura e impressão. NOTA: Como as folhas de poliestireno não são modificados para a adesão celular, o tratamento de plasma é realizado. </li><li> Oxigénio tratamento com plasma. <ol><li> Primeiro, selecione uma pressão de 2 bar no regulador do cilindro de oxigênio acoplado à máquina de plasma. Em seguida, desligar a máquina de plasma e a entrada das seguintes condições para o painel de controlo do equipamento: 150 W, 30 sscm de oxigênio, 10 min (para o poder, o fluxo de gás e tempo respectivamente). </li><li> Coloque o substrat poliestirenode e para a câmara de plasma, selar a porta e pressione o botão Iniciar no painel de controle. Embeber o plasma de oxigénio substrato de poliestireno tratado em soro fetal bovino e incubar a 37 ° C durante 2 h antes de lavar três vezes com fosfato 1x solução salina tamponada (PBS). </li></ol></li></ol> 2. Padrões de programação de impressão <ol><li> Usar o Programa para a Primeira Etch a superfície com um estilete ou bisturi. <ol><li> Quando se utiliza um estilete, inserir uma agulha têxtil diâmetro de 1,5 mm (a partir do interior com grande cuidado) para dentro do bocal de uma seringa de distribuição (5 ou 10 ml) até que se torne em cunha e protegidas. Se usando um bisturi, escolher um bisturi rodada manipulados de modo que pode ser fixado no mecanismo de fixação do braço de impressão. NOTA: A caneta grava padrões curvos melhor do que a lâmina de bisturi. </li><li> Quando a primeira tentativa de criar um arranjo bioprinted, esboçar o padrão desejado no papel de gráfico com eixos numerados para gerar as coordenadas XY. Então eunput as coordenadas gravado padrão / bioprinted para o software de planilhas (Figura 2). NOTA: O &quot;padrão desejado&quot; pode ser em muitas formas, tais como linear, em forma de S, ou circular. A escolha depende do modelo experimental necessária, como linear linhas paralelas para a diferenciação das MSCs para cardiomiócitos, como demonstrado aqui. A função de gráfico de dispersão permite a visualização do padrão enredo proposto. </li><li> Abra o / software de distribuição de impressão. Selecione &quot;Programa&gt; Adicionar programa&quot; seguido de &quot;Editar&gt; Adicionar ponto&quot; para configurar o programa. Exportar o x e y valores de coordenadas obtidas a partir da folha de cálculo para a impressão / distribuição de software usando o &quot;Copiar e colar&quot; a função. </li><li> Calibrar a altura de &quot;z&quot; do robô antes de cada execução, a fim de colocar o bico stylus / impressão sobre a superfície. <ol><li> Na cópia do software / distribuição, selecione a opção &quot;Robot&quot;, clique em &quot;Alterar Modo &amp;# 34; e habilitar a opção &quot;Modo de Ensino&quot;. Uma vez selecionado, o software permite a função &quot;Jog&quot; do robô. </li><li> Para correr, primeiro inicializar o robô para sua posição padrão, selecionando os seguintes comandos a partir da barra de menu; &quot;Robot&gt; Meca Inicializar&quot; e selecione &quot;Robot&gt; Jog&quot;. Introduzir os valores numéricos (em mm) no &quot;slots de X e Y&quot; necessários para colocar a caneta exactamente sobre a origem do padrão. </li><li> Em seguida, a entrada de um valor numérico (em mm) no &quot;slot de Z&quot; para colocar o bico de caneta ou impressão em contato com a superfície, mas não flexível ou recuar a superfície. Este ponto é designado como &quot;Z&quot; valor de partida. NOTA: A profundidade de cada ranhura podem ser variadas facilmente utilizando o Z-altura do sistema. As ranhuras de 40, 80, e 170 ^ M são demonstrados para cortar a superfície de 1 mm de espessura folhas de poliestireno (Figura 4 e Tabela 1). </li></ol></li><li> Selecione o pinstruções rint para cada um dos pontos coordenados, ou seja, &quot;o início da linha Dispensar&quot; para definir o primeiro ponto eo início de impressão, &quot;Linha de Passe&quot; para designar os pontos intermédios e &quot;Fim da Linha Dispensar&quot; para sinalizar para o robô para terminar a Tiragem. </li><li> Comunique-se o programa para o robô, selecionando os comandos acompanhamento a partir da barra de menu superior: &quot;Robot&gt; Enviar C &amp; T de dados&quot;. </li><li> Iniciado o condicionamento run / impressão, alterando o robô para o modo &quot;Run&quot;. Faça isso selecionando &quot;Robot&gt; Modo Mudando&gt; Transferir o modo Run&quot; na barra de menu superior. </li><li> Iniciar o procedimento de impressão, premindo o botão &quot;start&quot; verde na consola dispensador robô. </li></ol></li></ol> 3. Preparação e Impressão de Gelatina Bioink contendo celular <ol><li> Dissolve-se 2% de gelatina em Meio Mínimo Essencial alfa Médio (aMEM) (suplementado com 10% de FBS e 2% de antibiótico / antimycotIC) a 60 ° C durante 2 horas para preparar as soluções bioink. </li><li> Pré-cultura da proteína vermelha fluorescente expressando células-tronco mesenquimais (RFP-MSCs) a 70% de confluência em 10 cm placas de cultura de tecido, utilizando aMEM / 10% FBS. Libertar as células ligadas em suspensão por remoção do meio de revestimento e com uma solução de tripsina-EDTA 1x durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 1000 xg durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 0,5 mL de PBS 1x e contar a densidade de células utilizando um hemocitómetro. </li><li> Depois de deixar a bioink arrefecer até à temperatura ambiente, misturar suavemente num volume suficiente para a suspensão de RFP-MSCs no bioink para atingir uma concentração final de 5 x 10 6 mL -1 células. </li><li> Verter a bioink rolamento de células dentro de uma seringa de impressão com o bocal fechado. Arrefecer a seringa carregada a 4 ° C a fim de atingir uma viscosidade de impressão. </li><li> Colocar a seringa carregada no automatizadosistema de distribuição de robótica e anexar as linhas de pressão de ar. Retire a seringa Luer selo e anexar o bocal de impressão. </li><li> Faça a extrusão do bioinks celularizados em linhas finas usando 0,05 MPa pressão de retorno, a 5 mm / seg velocidade de escrita a partir de uma seringa de 10 ml através de um 27 G agulha / bico (afuniladas recomendado sobre cilíndrica) sobre uma superfície de película de poliestireno, após a deposição pré-programado padrão descrito no passo 2.1 a colocar o bioink celularizado para as ranhuras pré-gravadas. </li><li> Após incubação de 1 h à temperatura ambiente, adicionam-se 10 ml de meio de crescimento (suplementado com 10% FBS e antibióticos) e incuba-se as células durante 24 h (para permitir que as células para detectar e reagir às características gravadas) antes da visualização usando um microscópio de fluorescência invertido a 10X de ampliação. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não ter interesse financeiro conflitante.

O passo crítico deste procedimento é a entrega bioprinting efectiva das células estaminais enquanto o processo deve permitir a sedimentação de células para as características, de impressão sem bioink espalhando / hemorragia, proporcionam células sem morte celular tensão de cisalhamento e não desencadeiam a diferenciação no sentido linhagem indesejado. Se o alinhamento de células esperado não ocorrer, então a viscosidade bioink deve ser avaliado quanto à sua aptidão para a impressão. É import...

A padronização deliberada de posicionamento de célula permite a formação de culturas que imitam in vivo uma organização celular. Na verdade, a investigação sobre a interacção entre vários tipos de células pode ser assistido por organizar a sua 2,3 colocação espacial. A maioria dos sistemas de padrões dependem de procedimentos de modificação de superfície para promover ou prevenir a adesão celular com a deposição de células passiva subseqüente. Bioprinting oferece controle espacial e temporal sobre distribuições de células 1. Além destas funções, bioprinting foi descrito como sendo um método tecnicamente simples, rápido e de baixo custo para a geração de andaimes geometricamente complexas 4. Ele utiliza software de design de computador e permite a introdução de células para o processo de fabricação 4. Sistemas bioprinting foram classificados com base em seus princípios de trabalho como laser baseados, à base de jato de tinta ou extrusão baseados em 4. Extrusão bioprinting foi descrito como o mais promissor, uma vez que permite a fabricação de construções organizados de tamanhos clinicamente relevantes dentro de um período de tempo realista 4-6. É realizada por qualquer pressão mecânica ou para trás extrusão assistida de um hidrogel bioink rolamento celular. No método aqui apresentado, foi empregue a pressão de retorno. Como mencionado, as células são entregues em um bioink cytocompatible. Tal bioink deve suportar a entrega de células sem produzir esforço de corte deletério, e ser de uma viscosidade suficiente para manter a integridade do traço impressa, sem entrar em colapso ou espalhamento (referido como &quot;tinta de sangria&quot;) 7-10. A interacção das células com a superfície aderente é conhecido para influenciar o comportamento celular. A topografia da superfície pode controlar a forma das células, orientação 11, e ainda o fenótipo. Em particular, a fabricação de sulcos e canais têm demonstrado induzirum esticado, morfologia alongada em vários tipos de células. A adopção desta morfologia foi encontrado para influenciar o fenótipo de células multipotentes e pluripotentes. Por exemplo, quando alinhadas em ranhuras, as células estaminais mesenquimais (MSC) mostram evidências de diferenciação em direcção cardiomiócitos 12,13 e células musculares lisas vasculares adoptar o fenótipo contráctil sobre o sintética 10,14-17. A célula alinhando canais ou ranhuras pode ser gerado numa superfície polimérica por meio de uma série de métodos, por exemplo, gravação iónica reactivo profundo, litografia de feixe de electrões, impressão a laser directo, femtosecond laser, fotolitografia e ataque químico de plasma seco 18. Estas abordagens são frequentemente demorados, exigem aparelhos complexos e podem ser limitante na forma do padrão gerado. Além disso, eles não sincronizar padronização com bioprinting e não permitem celularização imediata. O movimento coordenado controlada de um automatizadoSistema de distribuição pode seguir padrões complexos para a deposição de soluções. Aqui demonstramos como o movimento controlado por microescala pode ser aproveitada para criar canais para orientação de células. Uma caneta ou bisturi afiada está ligado à cabeça de impressão em lugar da seringa e o equipamento de extrusão pode, em seguida, gravar a superfície de polímero sob a orientação do software trama. O método oferece uma versatilidade na concepção padrão e é aplicável a materiais poliméricos normalmente usados ​​em bioengenharia, tais como poliestireno, de PTFE, e policaprolactona. Como um passo subsequente para a decapagem, as células podem ser bioprinted directamente aos sulcos riscados. O bioink gelatina utilizada aqui foi capaz de manter tanto o traço e permitir que as células depositadas para detectar as características gravadas. As células estaminais mesenquimais bioprinted aos sulcos gravados foram demonstrados para alongar ao longo delas em linhas distintas.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Distribuição Robótica</td><td>Janome</td><td>2300N</td><td></td></tr><tr><td>Máquina</td><td>de Plasma Femto Science</td><td>Covance</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td>USB</tr><tr><td>Microscópio Óptico</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td> Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet</td><td>Excel</td><td>Excel</td><td></td></tr><tr><td>Software de Coordenadas de Impressão</td><td>Janome</td><td>JR C-Points</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>de Imagem National Institutes of Health (NIH)</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stylus (Lâmina)</td><td>OLFA</td><td>AK-5</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de impressão de 5 ml</td><td>San-ei Tech</td><td>SH10LL-B</td><td></td></tr><tr><td>30 G agulha de impressão</td><td>San-ei Tech</td><td>SH30-0.25-B</td><td></td></tr><tr><td>1 mm folhas</td><td></td> de poliestireno <td>Comprado localmente</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina salina Tamponada com fosfato</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de pele suína, força do gel 300, Tipo A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM</td><td>Invitrogen</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotc antimicótico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Células-tronco mesenquimais de proteína fluorescente vermelha (RFP-MSCs)</td><td>Cyagen Biosciences Incorporação</td><td>RASMX-01201</td><td></td></tr></tbody></table>

técnica automated robotic dispensação de orientação da superfície e bioprinting de células

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Este manuscrito descreve a introdução de características de orientação de células seguindo-se a entrega directa de células para estas funcionalidades de uma bioink hidrogel utilizando um sistema de distribuição robotizado e automatizado. O bioink particular foi selecionado como ele permite que as células para sedimentar direção e sentido os recursos. O sistema de distribuição bioprints células viáveis ​​em bioinks hidrogel usando uma cabeça de impressão de contrapressão assistida. No entanto, através da substituição da cabeça de impressão com um estilete ou bisturi afiado, o sistema de distribuição também pode ser empregada para criar pistas topográficas através de condicionamento de superfície. O movimento caneta pode ser programada em passos de 10 um nos sentidos de X, Y e Z. Os sulcos estampados foram capazes de orientar células-tronco mesenquimais, influenciando-os a adotar uma morfologia alongada em alinhamento com a direção dos sulcos. O padrão pode ser concebido usando o software de plotagem em linhas retas, círculos concêntricos, e ondas senoidais. Em um processo subsequente, fibroe blastos de células estaminais mesenquimais foram suspensos numa bioink gelatina a 2%, para bioprinting num cabeçote de extrusão accionado contrapressão. O bioink rolamento de células foi então impressa utilizando as mesmas coordenadas programadas utilizados para a decapagem. As células bioprinted foram capazes de detectar e reagir às características gravadas como demonstrado pela sua orientação alongada ao longo da direcção das ranhuras gravadas.

Os resultados representativos demonstram que o sistema de dispensa robótico contrapressão assistida pode ser usado como um bioprinter à base de extrusão para a realização de ambos gravura e impressão bioink superfície (Figura 1 A). Ele pode ser usado para a geração de ranhuras gravadas em superfícies de polímeros, e, subsequentemente, para imprimir uma bioink rolamento célula directamente para as características (Figura 1 B e C). <p class="jove_conte...

Este protocolo descreve uma metodologia de bioimpressão usando um sistema de depósito robótico automatizado que incorpora pistas de orientação topográfica gravadas com a deposição precisa de uma biotinta de hidrogel contendo células. As células impressas são entregues diretamente aos recursos gravados e são capazes de sentir e orientar com eles.

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

O objetivo geral dessa técnica automatizada de dispensação robótica é criar uma superfície para orientação topográfica de células e, em seguida, entregar células a essas características seguindo um padrão programado, permitindo o controle sobre o comportamento e a distribuição celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da engenharia biomédica, como a forma pela qual topologias de superfície podem afetar o comportamento celular, tanto em monocultura quanto em co-cultura. A principal vantagem dessa técnica é que ela exige menos tempo para programar e imprimir o padrão de orientação celular em comparação com métodos mais estabelecidos.Ele também inclui a etapa de entrega de células para dispensação controlada. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando percebemos que padrões 2D de células depositadas em hidrogéis poderiam se beneficiar da orientação superficial. Assim, desenvolvemos esta técnica para imprimir hidrogéis de maneira que corresponda às características da superfície.Este protocolo descreve o uso de um sistema robótico de dispensação assistido por pressão reversa como uma bioimpressora baseada em gravação de superfície e extrusão.

automated-robotic-dispensing-technique-for-surface-guidance

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Esta tecnologia de impressão microfluídica 3D imprime matrizes de células em superfícies submersas.  Descrevemos como as matrizes de células são entregues microfluidicamente em células de fluxo 3D em superfícies submersas.  Ao imprimir em superfícies submersas, foram produzidos microarrays celulares que permitem a triagem de medicamentos e a avaliação da citotoxicidade em várias áreas.

A impressão Submerso de células em uma superfície modificada Usando um contínuo fluxo Microspotter

Um protocolo para impressão robótica de esferoides de células cancerígenas em um formato de placa de 96 poços de alto rendimento usando um sistema aquoso de duas fases é apresentado.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar livremente suspensos, fibras micron / sub-micron escala de polímeros e estruturas "web-like" gerados via procedimento automatizado escrita direta por meio de um sistema de distribuição de 3 eixos.

Prescrito 3-D Direto Escrita de Suspenso Micron / Sub-micron estruturas de fibras Escala através de um sistema distribuidor Robotic

Uma bioimpressora cartesiana foi projetada e fabricada para permitir a deposição de vários materiais em geometrias precisas e reprodutíveis, ao mesmo tempo em que permite o controle de fatores ambientais. Utilizando a bioimpressora tridimensional, construções complexas e viáveis podem ser impressas e facilmente reproduzidas.

Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

Este protocolo descreve a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais. Os remendos cardíacos bioprinted 3D apresentam integração mecânica de esferóides componentes e são altamente promissores na regeneração do tecido cardíaco e como modelos 3D de doenças cardíacas.

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Análogos de cartilagem e pele foram bioprinted usando um bioink de nanocellulose-alginato com base. Os bioinks era compartimentados antes da impressão através de uma unidade de mistura passiva de passo único. As construções foram demonstradas para ser uniformemente compartimentado, têm alta viabilidade e exibem favoráveis marcadores de diferenciação.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

O protocolo descreve a geração de spheróides de alto rendimento para bioimpressão usando a análise multi-paramétrica de sua oxigenação e morte celular em um microscópio padrão de fluorescência. Essa abordagem pode ser aplicada para controlar a viabilidade dos esferoides e realizar a padronização, o que é importante na modelagem do tecido 3D, microambiente tumoral e biofabricação (micro)tecido bem sucedida.

Biofabricção assistida por microscopia de oxigênio acessível de esferoides multicelulares

Aqui, descrevemos a produção em larga escala de esferoides esferoides de células-tronco derivados de adiposos (ASC) usando um sistema automatizado de pipetização para semear a suspensão celular, garantindo assim a homogeneidade do tamanho e forma de spheroid. Estes esferoides ASC podem ser usados como blocos de construção para abordagens de bioimpressão 3D.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

O processamento de cisalhamento durante a formação de hidrogel resulta na produção de suspensões de microgel que se reestruturam rapidamente, mas rapidamente após a remoção das forças de cisalhamento. Tais materiais têm sido utilizados como matriz de suporte para bioimpressão de estruturas complexas carregadas de células. Aqui, são descritos os métodos utilizados para a fabricação do leito de suporte e das biotintas compatíveis.

Géis fluidos de agarose formados por processamento de cisalhamento durante gelificação para bioimpressão 3D em suspensão

Os extratos de membrana basal solúvel são as matrizes biológicas mais amplamente utilizadas na pesquisa do câncer, mas seu comportamento reológico complexo dificulta sua bioimpressão com sistemas de bioimpressão disponíveis comercialmente. Este trabalho apresenta uma estratégia de bioimpressão customizada para produzir construções matriciais puras com boa fidelidade de forma em camadas únicas e múltiplas.

Projeto e validação de uma bioimpressora de extrusão volumétrica para bioimpressão de extrato de membrana basal solúvel para pesquisa translacional

Aprenda a técnica de dispensação robótica automatizada para bioimpressão com orientação topográfica de superfície. Este método permite controlar o comportamento celular usando hidrogéis e padrões gravados, avançando a engenharia biomédica.

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

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