Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

O objetivo geral deste procedimento é gerar construções viáveis carregadas de células com uma geometria complexa usando uma bioimpressão 3D. Isso é feito isolando primeiro as células estromais do tecido adiposo humano da cultura. Em seguida, as células são misturadas com tinta biológica de alginato conjugado RGD oxidado recém-preparado.

Na etapa final, a célula LA no biomaterial é extrudada por bioimpressão. Em última análise, a microscopia confocal é usada para analisar a viabilidade, proliferação e migração das células bioimpressas. A principal vantagem deste procedimento sobre os procedimentos existentes, como a formação de andaimes e a semeadura de células, é que, com nosso procedimento, você pode colocar diretamente as células e agregados celulares exatamente onde eles precisam estar para formar o tecido.

Demonstrando o procedimento Hoje estará Sarah Grace Dennis, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece semeando 350.000 células estromais de tecido adiposo humano em um frasco T 75 tratado em 15 mililitros de TMEM com baixa glicose para expansão em uma incubadora de cultura de células. Quando a cultura atingir 80%co fluência, remova o meio e enxágue as células em cinco mililitros de DPBS sem cálcio e magnésio.

Em seguida, incubar as células em cinco mililitros de tripsina e DPBS por dois minutos a 37 graus Celsius quando as células se separarem, interromper a reação enzimática com três mililitros de meio de cultura celular e transferir as células para um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio de cultura celular. Em seguida, conte as células, transfira uma alíquota de 1,3 vezes 10 das seis células para um tubo cônico de 15 mililitros e gire as células novamente.

Suspenda o pellet em um mililitro de tinta biológica recém-preparada, tendo o cuidado de distribuir homogeneamente as células por toda a solução aquosa de alginato. Em seguida, carregue as células em uma seringa de três mililitros compatível com impressora estéril e aparafuse uma ponta de plástico estéril de calibre 22. Agora ligue a bioimpressão, cada um dos computadores dispensadores e o banho-maria de recirculação.

Defina manualmente a temperatura do banho para quatro graus Celsius para o mecanismo de ação e os parâmetros de impressão para cada dispensador no computador dispensador correspondente. Defina o volume de dispensação para 230 nanolitros, o número de passos para trás para zero e a taxa do dispensário para 10 microlitros por segundo. Em seguida, abra o software de design e o programa para visualizar a tela da câmera USB no computador.

Em seguida, insira manualmente as coordenadas de uma matriz de cinco por cinco pontos com 2,4 milímetros de espaço entre as gotas. Salve o programa e envie o programa para o robô. Em seguida, coloque uma placa de gelatina de dióxido de titânio contendo placa de Petri no estágio da impressora de quatro graus Celsius e feche e tranque a porta da câmara.

Usando o controlador lógico programável, inicializou as fontes de luz ultravioleta para esterilizar a câmara. Após 90 segundos, abra a câmara e carregue a seringa contendo a suspensão de células estromais do tecido adiposo humano na pistola um e tranque a porta da câmara e use o controlador lógico programável para ligar o sistema de ventilador. Aguarde 30 segundos para que a pressão interna se equilibre e, em seguida, execute o programa que contém o caminho geométrico e os parâmetros de impressão durante todo o processo de impressão.

Observe a exibição da câmera USB no computador para confirmar uma impressão precisa e uniforme. Para quantificar a viabilidade das construções bioimpressas, mergulhe-as em solução de coloração recém-preparada. Em seguida, coloque as construções na geladeira por 15 minutos no escuro para permitir que a mancha endureça.

Em seguida, usando uma imagem de microscópio confocal, as construções coradas se as células aparecerem amarelas ou verdes, classificá-las como vivas se vermelhas, as células estão mortas. Como esses resultados demonstram, a bioimpressão facilita a deposição de ajuda celular e hidrogéis em locais tridimensionais específicos com precisão e consistência usando software computadorizado. O software de computador determina a colocação de cada gota e controla muitos dos parâmetros para dispensação.

Um dos requisitos de uma técnica de bioimpressão bem-sucedida é que as células permaneçam viáveis aqui. As células impressas em biotinta algínica, como acabamos de demonstrar, foram analisadas uma hora e oito dias após a impressão, com 98% das células parecendo verdes e viáveis no dia zero e 95% no oitavo dia. Como a coloração vermelha indica, poucas células mortas foram observadas em ambos os momentos, confirmando a adequação da tinta alternativa para bioimpressão.

Além disso, a tinta de algina conjugada RGD aumenta a ligação das células às construções impressas, levando a uma melhor disseminação e proliferação celular, conforme quantificado em três áreas separadas do hidrogel em zero e oito. Aqui, uma comparação da qualidade da conjugação do peptídeo RGD na tinta ginnet bio foi comparada com o uso da tinta Ginnet bio sozinha no oitavo dia. A disseminação celular observada na amostra corada com ginnet conjugado RGD indicou a incorporação bem-sucedida do peptídeo no ginnet, um fenômeno que estava visivelmente ausente nas amostras de bioimpressão não conjugada após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da engenharia de tecidos explorarem a manufatura aditiva como um meio de montar construções de engenharia viva.