Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

O objetivo geral deste procedimento é gerar construtos viáveis contendo células com uma geometria complexa, utilizando uma bioimpressora 3D. Isso é realizado primeiramente isolando células estromais de tecido adiposo humano a partir de cultura. Em seguida, as células são misturadas com bio-tinta de alginato oxidado conjugado com RGD, recém-preparada.

No passo final, a célula LA no biomaterial é extrudida por meio da bioimpressão. Por fim, a microscopia confocal é utilizada para analisar a viabilidade, proliferação e migração das células bioimpressas. A principal vantagem deste procedimento em relação aos procedimentos existentes, como a formação de scaffolds e o semeadura celular, é que com o nosso método, é possível posicionar diretamente as células e agregados celulares exatamente onde precisam estar para formar o tecido.

Quem demonstrará o procedimento hoje será Sarah Grace Dennis, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório. Comece semeando 350.000 células estromais de tecido adiposo humano em um frasco T75 tratado com 15 mililitros de TMEM de baixa glicose para expansão em uma incubadora de cultura celular. Quando a cultura atingir 80% de confluência, remova o meio e lave as células com cinco mililitros de DPBS sem cálcio e magnésio.

Em seguida, incubar as células em cinco mililitros de tripsina e DPBS por dois minutos a 37 graus Celsius; quando as células se desprendem, interromper a reação enzimática com três mililitros de meio de cultura celular e transferir as células para um tubo cônico de 50 mililitros. A seguir, centrifugar as células e ressuspender o pellet em dois mililitros de meio de cultura celular. Depois, contar as células, transferir uma alíquota de 1,3 vezes 10 elevado a 6 células para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar as células novamente.

Suspenda o pellet em um mililitro de bio-tinta recém-preparada, tomando cuidado para distribuir homogeneamente as células por toda a solução aquosa de alginato. Em seguida, carregue as células em uma seringa estéril compatível com impressora de três mililitros e parafuse uma ponteira plástica estéril de 22 gauge. Agora ligue a bioimpressora, cada um dos computadores do dispensador e o banho de água recirculante.

Defina manualmente a temperatura do banho em quatro graus Celsius para o mecanismo de ação e os parâmetros de impressão para cada dispensador no computador correspondente ao dispensador. Defina o volume de dispensação em 230 nanolitros, o número de passos para trás em zero e a taxa de dispensação em 10 microlitros por segundo. Em seguida, abra o software de design e o programa para visualizar a exibição da câmera USB no computador.

Em seguida, insira manualmente as coordenadas para uma matriz de pontos de cinco por cinco com 2,4 milímetros de espaço entre as gotas. Salve o programa e envie-o para o robô. Em seguida, coloque uma placa de Petri contendo gelatina com dióxido de titânio na plataforma da impressora a quatro graus Celsius e feche e trave a porta da câmara.

Usando o controlador lógico programável, inicialize as fontes de luz ultravioleta para esterilizar a câmara. Após 90 segundos, abra a câmara e carregue a seringa contendo a suspensão de células estromais do tecido adiposo humano na pistola um, feche e trave a porta da câmara e use o controlador lógico programável para ligar o sistema de ventilação. Aguarde 30 segundos para que a pressão interna se equilibre e, em seguida, execute o programa contendo o trajeto geométrico e os parâmetros de impressão durante todo o processo de impressão.

Observe a exibição da câmera USB no computador para confirmar uma impressão precisa e uniforme. Para quantificar a viabilidade das estruturas bioprintadas, mergulhe-as em solução de corante recém-preparada. Em seguida, coloque as estruturas na geladeira por 15 minutos no escuro para permitir que o corante fixe.

Em seguida, utilizando uma imagem de microscópio confocal, os constructos corados: se as células aparecerem amarelas ou verdes, classifique-as como vivas; se vermelhas, as células estão mortas. Como esses resultados demonstram, a bioimpressão facilita a deposição de auxílio celular e hidrogéis em locais tridimensionais específicos de forma precisa e consistente, utilizando software computadorizado. O software determina o posicionamento de cada gota e controla muitos dos parâmetros para a dispensação.

Um dos requisitos de uma técnica de bioimpressão bem-sucedida é que as células permaneçam viáveis aqui. Células impressas em tinta bio baseada em alginato, conforme acabou de ser demonstrado, foram analisadas uma hora e oito dias após a impressão, com 98% das células apresentando coloração verde e viabilidade no dia zero e 95% no oitavo dia. Como a coloração vermelha indica, poucas células mortas foram observadas em qualquer dos pontos temporais, confirmando a adequação da tinta alternativa para bioimpressão.

Além disso, a tinta de alginato conjugada com RGD melhora a adesão das células aos constructos impressos, levando a uma maior expansão e proliferação celular, conforme quantificado em três áreas separadas do hidrogel no dia zero e no dia oito. Aqui, foi feita uma comparação da qualidade da conjugação do peptídeo RGD na tinta bioativa ginnet com o uso da tinta bioativa ginnet isolada no oitavo dia. A expansão celular observada na amostra corada com ginnet conjugado com RGD indicou a incorporação bem-sucedida do peptídeo ao ginnet, um fenômeno claramente ausente nas amostras de biotinta não conjugada após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de engenharia de tecidos explorarem a fabricação aditiva como um meio de montar construtos vivos e projetados.