Name: Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda bioprinting microfluídico para engenharia de tecidos vascularizados usando construtos tridimensionais. Este método versátil permite criar leitos vasculares para diversos tipos celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores reconhecem o National Cancer Institute da institutos nacionais de saúde via a independência Award (K99CA201603).

Os rato neonatal cardiomyocytes utilizados neste protocolo foram isoladas de ratos Sprague-Dawley de 2 dias de idade seguindo um procedimento bem estabelecido56 aprovado pelo Comité de uso do hospital Brigham e feminino e cuidado institucional do Animal.
1. instrumentação da Bioprinter
<ol>
	<li>Inserir uma agulha menor (por exemplo, 27G, 1 polegada) como o núcleo do centro de uma agulha maior (por exemplo, 18g, ½ polegada) como a bainha para construir a camada dupla, concêntrico microfluidic cabeçote de impressão; Certifique-se que a agulha do núcleo está projetando-se ligeiramente (~ 1mm) mais do que o escudo exterior (Figura 1A). O alinhamento é geralmente ajustado manualmente, mas se necessário espaçadores de tamanhos apropriados podem ser temporalmente imprensados entre as agulhas interior/exterior em ambos a ponta e os lados de barril para auxiliar o alinhamento concêntrico. Selar a junção dos barris com cola epóxi e retire os espaçadores de alinhamento do lado de ponta, quando aplicável.</li>
	<li>Introduza outra agulha (23G) no cano da agulha central na direção inversa.  Em seguida, gerar um buraco do lado do barril da agulha exterior e inserir um conector de metal de tamanho de correspondência para o buraco, seguido de selagem com cola epóxi.</li>
	<li>Conecte as entradas do cabeçote de impressão para uma bomba de seringa de canal duplo para injeção do bioink e a solução de reticulação, individualmente, através de dois tubos de PVC. Monte a extrusora para a cabeça de um bioprinter usando um suporte de plástico feito de poly(methyl methacrylate) (PMMA). Nota: Bioprinter seleção depende de disponibilidade. No nosso caso, nós testamos com sucesso esta configuração em vários bioprinters comercialmente disponíveis. No entanto, qualquer bioprinter que apresenta uma fase de x-y-z motorizada deve, em princípio, permitem a integração deste cabeçote microfluidic.</li>
</ol>
2. Bioprinting a cama Vascular Microfibrous
<ol>
	<li>Fazer o bioink usando uma mistura de alginato (4 w/v%, baixa viscosidade), gelatina de57,methacryloyl (GelMA, w/v% 1-2)58e fotoiniciador Irgacure 2959 (0,2 - 0,5 wt.%) dissolvido em 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] etano sulfônico (HEPES buffer, pH 7,4) contendo 10 vol.% fetal soro bovino (FBS).</li>
	<li>Faça uma solução de 0,3 M CaCl2 em tampão HEPES contendo 10 vol.% FBS como o fluido portador de reticulação.</li>
	<li>Imediatamente antes de bioprinting, dissociar a veia umbilical humana células endoteliais (HUVECs) dos balões usando tratamento por 0.05 w/v% tripsina, por 5-10 min e ressuspender as células no bioink na concentração de 5-10 × 106 células/mL. Pipete a suspensão lentamente de 5 a 10 vezes para assegurar uma distribuição homogénea.</li>
	<li>Inicie a injeção de fluido bioink/reticulação usando uma bomba de seringa dual channel às mesmas taxas de fluxo de 5 µ l/mL. Os fluxos podem ser autorizados a executar continuamente para até 1 min até estabilizar. Posteriormente, inicie o movimento do cabeçote de impressão, controlando o bioprinter a uma velocidade de deposição de aproximadamente 4 mm/s (Figura 1B). Estas velocidades podem precisar bem sintonia com cada nova instalação para assegurar a bioprinting ideal. O processo de bioprinting é normalmente conduzido à temperatura (21-25 ° C), mas esta temperatura pode ser alterada. O processo de bioprinting deverá permitir rápido iônica gelificação do componente alginato e deposição de um andaime de microfibrous (Figura 1B).</li>
	<li>Após o andaime é bioprinted, alcançar a gelificação química por mais photocrosslinking o componente GelMA, em aproximadamente 5-10 mW/cm2 de luz UV (360-480 nm) para 20-30 s (Figura 1C).</li>
	<li>Após o bioprinting e reticulação, lave suavemente o andaime com tampão fosfato salino (PBS) para remover o excesso de CaCl2. O andaime microfibrous HX-carregado em células endoteliais crescimento médio (EGM) em uma incubadora a 37 ° C e 5 vol.% CO2 até 16 dias com meio de cultura mudou pelo menos a cada 2 dias. Monitore as morfologias do HX sob um microscópio durante o período de cultura.</li>
</ol>
3. construir os tecidos vascularizados
<ol>
	<li>Uma vez que o HX migraram para as periferias das microfibras no cadafalso para formar estruturas as lúmen (Figura 1D), recuperar o andaime e delicadamente, coloque-o sobre a superfície de uma superfície hidrofóbica (por exemplo, uma laje de polymethylsiloxane [PDMS]). Use um pedaço de papel de filtro estéril para remover cuidadosamente todo o meio do espaço intersticial de andaime com força capilar.</li>
	<li>Imediatamente adicione uma gota (aproximadamente 20-40 µ l) de suspensão de um tipo de célula secundária (por exemplo, cardiomyocytes) em meio a uma densidade de 1-10 × 106 células/mL no topo do andaime, que deve se infiltrar em todo o espaço intersticial de andaime (Figura 1E). Incube a essa configuração em uma incubadora (37 ° C, 5 vol.% CO2, 95% de humidade relativa) para 0,5 - 2h para permitir que as células aderir para as microfibras individuais. Monitore o tamanho das gotas ao longo do período para garantir que nenhuma evaporação perceptível é observada.</li>
	<li>Lava delicadamente os andaimes por agitação em um banho de PBS para remover quaisquer células não-aderentes e cultura a construção no meio de relevante até o tecido vascularizado desejado é formado.</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Construção de cabeçote de impressão co-axial representa um passo crítico para sucesso microfluidic bioprinting para permitir a entrega simultânea de ambos o bioink do núcleo e o agente de reticulação da bainha. Enquanto no presente protocolo um cabeçote de exemplo foi criado usando uma agulha 27G como o núcleo e uma agulha de 18G como o shell, que seja facilmente estendido para uma variedade de combinações usando diferentes tamanhos de agulhas. No entanto, a alteração dos tamanhos de agulha, que resulta na alteração na q...

Metas de engenharia de tecido para gerar substitutos de tecido funcional que podem ser usados para substituir, restaurar ou aumentar os feridos ou doentes no corpo humano1,2,3,4, muitas vezes através de uma combinação de tipos de células desejada e moléculas bioativas5,6biomateriais7,8,9,10. Mais recentemente, as tecnologias de engenharia de tecido também cada vez mais adoptaram para gerar em vitro tecidos e órgãos modelos que imitam as funções importantes de suas contrapartes na vivo , para aplicações tais como desenvolvimento de drogas, em substituição a célula planar simplificada convencional culturas11,12,13,14,15,16,17,18,19. Em ambas as situações, a capacidade de recapitular a microarquitetura complexa e estrutura hierárquica dos tecidos humanos é fundamental para ativar a funcionalidade dos tecidos projetados10, e em particular, maneiras de integrar uma rede vascular para os tecidos projetados são da demanda desde vascularização apresenta um dos maiores desafios ao campo21,20,22,23.
Até à data, uma variedade de abordagens têm sido desenvolvidas nesse sentido na tentativa de construir estruturas de vaso sanguíneo em construções de engenharia de tecidos, com vários graus de sucesso8. Por exemplo, auto-montagem de células endoteliais permite a geração de redes microvascular24; entrega de fatores de crescimento angiogênico induz neovascularização sustentado25,,26; uso de células progenitoras vascular e pericitos facilita o crescimento de células endoteliais e montagem24,27; projetar o andaime Propriedades permite a modulação precisa da vascularização28,,29; e tecnologia de células de folha permite a manipulação conveniente de camadas vasculares30. No entanto, estas estratégias não dotam a capacidade de controlar a padronização espacial da vasculatura, muitas vezes levando a distribuição aleatória dos vasos sanguíneos dentro de uma construção da engenharia de tecidos e, portanto, limitado a reprodutibilidade. Durante os últimos anos bioprinting tem emergido como uma classe de tecnologias para a solução de um grande desafio, devido a sua versatilidade incomparável de depositar os padrões de tecido complexo em alta fidelidade e reprodutibilidade em um modo automático ou semi-automático31,32,33capacitantes. Sacrificial bioprinting34,35,36,37,38, incorporado bioprinting39,40,41e estrutura oca bioprinting/biofabrication42,,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 tem tudo o que demonstrou a viabilidade de geração de tecidos vasculares ou vascularizados.
Como alternativa, uma estratégia de bioprinting microfluidic para fabricar andaimes microfibrous foram recentemente desenvolvidos, onde bioink um híbrido composto de alginato e gelatina methacryloyl (GelMA) foi entregue através do núcleo de uma cabeça de impressão concêntrica e uma solução de cloreto de cálcio (CaCl2) foi realizado o fluxo da bainha externa do cabeçote de impressão54,55. A co-extrusão dos dois fluxos permitidas reticulação física imediata do componente alginato para permitir formação de microfibra, enquanto photocrosslinking subsequente assegurada estabilização permanente do cadafalso multi camada microfibrous. Digno de nota, células endoteliais, encapsuladas nas microfibras de bioprinted foram encontradas a proliferar e migrar para as periferias das microfibras assumindo lúmen-como estruturas que imitava a cama vascular54,55. Estes bioprinted, camas vasculares endotelializadas poderiam ser posteriormente preenchidas com desejado tipos de células secundárias mais construir tecidos vascularizados55. Assim, este protocolo fornece um procedimento detalhado de uma estratégia deste tipo microfluidic bioprinting habilitado pelo design concêntrico do bocal, que garante a fabricação conveniente dos tecidos vascularizados para potenciais aplicações em engenharia de tecidos e modelagem de organoides.

<table><tbody><tr><td>Sal de sódio de ácido algínico de algas marrons</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0682</td><td>BioReagent, cultura de células vegetais testado, baixa viscosidade, pó</td></tr><tr><td>Gelatina tipo A de pele suína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>Força de gel 300</td></tr><tr><td>Irgacure 2959 (2-Hidroxi-4'-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896</td><td>98%</td></tr><tr><td>Tampão HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>1 M, pH 7.0 - 7.6, filtrado estéril, BioReagente, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10438026</td><td>Regiões qualificadas, inativadas por calor, aprovadas pelo USDA</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>BioXtra, &ge; 99,0%</td></tr> de <tr><td>solução salina tamponada com fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7,4</td></tr><tr><td>Células endoteliais da veia umbilical humana</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001</td><td>Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)</td></tr><tr><td>Células endoteliais da veia umbilical humana que expressam GFP</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td>Células endoteliais da veia umbilical humana que expressam GFP (GFPHUVECs)</td></tr><tr><td>Meio de crescimento de células endoteliais</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12430054</td><td>Alta glicose, kit de</td></tr><tr><td>elastômero de silicone HEPES Sylgard 184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5KG</td><td>Transparente 0,5 kg Kit</td></tr><tr><td>Sistema de lâmpada de cura UV</td><td>Excelitas Technologies OmniCure</td><td>S2000</td><td>Sistema de cura por luz UV com sensor UV inteligente</td></tr></tbody></table>

vascularizado de microfluidic bioprinting para a engenharia de tecidos e organoids

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engenharia de tecido vascularizado constrói e organoids tem sido historicamente desafiador. Aqui descrevemos um romance método baseado na microfluidic bioprinting para gerar um andaime com multicamadas entrelaçamento microfibras de hidrogel. Para alcançar o liso, bioprinting, uma cabeça de impressão do núcleo-bainha microfluidic contendo uma formulação bioink composto extrudada de fluxo do núcleo e a solução de reticulação levado pelo fluxo da bainha, foi projetada e montada sobre o bioprinter. Misturando a gelatina methacryloyl (GelMA) com alginato, selecione de um polissacarídeo que sofre instantânea reticulação iônica na presença de íons divalentes, seguidos por um photocrosslinking secundário do componente GelMA para conseguir a estabilização permanente, um andaime de microfibrous pode ser obtido usando esta estratégia bioprinting. Importante, as células endoteliais encapsuladas dentro as microfibras de bioprinted podem formar as lúmen-como estruturas assemelhando-se a vasculatura ao longo da cultura por 16 dias. O andaime microfibrous endotelializados pode ser mais usado como um leito vascular para construir um tecido vascularizado através de semeadura subsequentes do tipo celular secundária para o espaço intersticial das microfibras. Bioprinting microfluidic fornece uma estratégia generalizada em conveniente engenharia de tecidos vascularizados em alta fidelidade.

A estratégia de bioprinting microfluidic permite a extrusão direta bioprinting de andaimes microfibrous usando baixa viscosidade bioinks54,55. Conforme ilustrado na Figura 2A, um andaime com um tamanho de 6 × 6 × 6 mm3 contendo &#62; 30 camadas de microfibras poderiam ser bioprinted dentro de 10 min. A reticulação iônica imediata do componente alginato com CaCl2 ...

Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

O objetivo geral desta metodologia de bioprintagem microfluídica é gerar um constructo tecidual vascularizado. Este método pode resolver questões fundamentais na biofabricação de tecidos vascularizados. A principal vantagem desta técnica é sua versatilidade na geração de um vaso vascular tridimensional com forma controlada para a engenharia de tecidos vascularizados por meio de um processo secundário de semeadura celular.Embora este protocolo forne&ccedil;a uma vis&atilde;o sobre a engenharia de tecidos card&iacute;acos vascularizados, ele tamb&eacute;m pode ser aplicado a muitos outros tipos de tecidos, como f&iacute;gado, pele e at&eacute; mesmo c&acirc;nceres. Indiv&iacute;duos em geral, novos neste m&eacute;todo, podem ter dificuldades porque a configura&ccedil;&atilde;o da bioimpressora pode n&atilde;o ser simples. Para iniciar este procedimento, construa uma cabe&ccedil;a de impress&atilde;o microflu&iacute;dica de camada dupla conc&ecirc;ntrica inserindo uma agulha romba menor, que serve como n&uacute;cleo, no centro de uma agulha romba maior, que serve como revestimento.Certifique-se de que a agulha central esteja protrudindo da capa externa aproximadamente um milímetro. Em seguida, insira uma agulha de calibre 23 no corpo da agulha central, em sentido contrário. Faça um orifício na later

microfluidic-bioprinting-for-engineering-vascularized-tissues

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Uma bioimpressora cartesiana foi projetada e fabricada para permitir a deposição de vários materiais em geometrias precisas e reprodutíveis, ao mesmo tempo em que permite o controle de fatores ambientais. Utilizando a bioimpressora tridimensional, construções complexas e viáveis podem ser impressas e facilmente reproduzidas.

Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Este manuscrito apresenta um método de moldagem por injeção para engenheiro microvasos que recapitulam propriedades fisiológicas de endotélio. O processo baseado em microfluídico cria redes vasculares 3D patente com condições tailorable, tais como fluxo, composição celular, geometria e gradientes bioquímicos. O processo de fabricação e exemplos de aplicações potenciais são descritos.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

Este protocolo descreve uma metodologia de bioimpressão usando um sistema de depósito robótico automatizado que incorpora pistas de orientação topográfica gravadas com a deposição precisa de uma biotinta de hidrogel contendo células. As células impressas são entregues diretamente aos recursos gravados e são capazes de sentir e orientar com eles.

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

Este protocolo descreve a implementação da degradação de hidrogel baseada em laser guiada por imagem para fabricar redes microfluídicas biomiméticas derivadas de vasculares incorporadas em hidrogéis de poli(etilenoglicol) diacrilato (PEGDA). Esses sistemas microfluídicos biomiméticos podem ser úteis para aplicações de engenharia de tecidos, geração de modelos de doenças in vitro e fabricação de dispositivos avançados "on-a-chip".

guiado por imagem, fabricação à base de laser de Redes microfluídicos Vascular derivadas

O protocolo descreve como engenheiro uma rede vascular perfusable em um esferoide. Microambiente ao redor do spheroid é concebido para induzir a angiogênese e conectar o spheroid para os microcanais em um dispositivo microfluidic. O método permite a perfusão do spheroid, que é uma técnica muito aguardada em culturas tridimensionais.

Perfusable rede Vascular com um modelo de tecido em um dispositivo Microfluidic

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

Apresentado aqui é um simples de usar, Core/Shell, tridimensional bioprinting set-up para uma etapa de fabricação de andaimes ocas, adequado para a engenharia de tecidos vasculares e outras estruturas tubulares.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

O objetivo deste protocolo é bioimprimir diretamente as células epiteliais mamárias como esferoides multicelulares em redes endoteliais pré-formadas para criar rapidamente modelos de cocultura 3D de mama endotelial que podem ser usados para estudos de triagem de medicamentos.

Bioimpressão direta de esferoides de mama multicelular 3D em redes endoteliais

Retalhos projetados requerem uma rede vascular funcional incorporada. Neste protocolo, apresentamos um método de fabricação de um retalho de tecido impresso em 3D contendo uma rede vascular hierárquica e suas anastomosas microcirúrgicas diretas para a artéria femoral de rato.

Fabricação de retalhos vasculares projetados usando tecnologias de impressão 3D

Apresentamos um protocolo para produção de alto rendimento de canais vasculares com tamanhos flexíveis e padrões desejados em uma placa padrão de seis poços usando a tecnologia de bioimpressão 3D, conhecida como vasos em uma placa (VOP). Esta plataforma tem o potencial de avançar no desenvolvimento de terapêuticas para os distúrbios associados ao endotélio comprometido.

Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

Aprenda bioprinting microfluídico para engenharia de tecidos vascularizados usando construtos tridimensionais. Este método versátil permite criar leitos vasculares para diversos tipos celulares.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Explorar mais vídeos