Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids
11 de agosto de 2017
Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.
O objetivo geral desta metodologia de bioimpressão microfluídica é gerar uma construção de tecido vascularizado. Este método pode resolver questões-chave na biofabricação de tecidos vascularizados. A principal vantagem desta técnica é que ela é versátil na geração de uma cuba vascular controlada por forma tridimensional para engenharia de tecidos vascularizados através de um processo de semeadura celular secundária.
Embora este protocolo forneça informações sobre a engenharia de tecidos cardíacos vascularizados, ele também pode ser aplicado a muitos outros tipos de tecido, como fígado, pele e até câncer. Em geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque a configuração da bioimpressora pode não ser simples. Para iniciar este procedimento, construa uma cabeça de impressão microfluídica concêntrica de camada dupla inserindo uma agulha romba menor, servindo como núcleo, no centro da agulha romba maior, servindo como bainha.
Certifique-se de que a agulha central esteja saliente do invólucro externo aproximadamente um milímetro. Depois disso, insira uma agulha de calibre 23 no cano da agulha central na direção inversa. Faça um furo na lateral do cano da agulha externa e insira um conector de metal de tamanho correspondente.
Sele com cola epóxi. Monte a extrusora na cabeça de uma bioimpressora, usando um suporte de polimetilmetacrilato ou PMMA. Em seguida, para a injeção da biotinta e da solução de reticulação através de dois tubos de PVC individualmente, conecte as entradas da cabeça de impressão a uma bomba de seringa de canal duplo.
Faça a biotinta usando uma mistura de alginato, gelMA e fotoiniciador. Dissolvido em tampão HEPES 25 milimolar, contendo 10% de soro fetal bovino ou FBS. Em seguida, faça uma solução de cloreto de cálcio 0,3 molar em tampão HEPES contendo 10% de FBS para servir como fluido transportador de reticulação.
Logo antes da bioimpressão, tripsinize as células endoteliais da veia umbilical humana ou HUVECs por cinco a 10 minutos. Centrifugar as células a 800 RPM durante cinco minutos num tubo de 15 mililitros. Ressuspenda as células na biotinta a uma concentração de cinco a 10 vezes 10 a seis células por mililitro, pipetando lentamente cinco a 10 vezes.
Em seguida, use uma bomba de seringa de canal duplo para iniciar a injeção da biotinta carregada de HUVECs através de um e o fluido de reticulação através do outro canal a uma taxa de fluxo de cinco microlitros por minuto. Permita que os fluxos funcionem continuamente por até um minuto até que se estabilizem. Depois disso, inicie o movimento da cabeça de impressão, mantendo a velocidade de deposição da bioimpressora de aproximadamente quatro milímetros por segundo.
Essa bioimpressão deve resultar em gelificação iônica rápida do componente alginato e deposição de um andaime de microfibra. Depois que o andaime for impresso, reticule o componente gelMA com cinco a 10 miliwatts por centímetro quadrado de luz UV por 20 a 30 segundos para realizar a gelificação química. Em seguida, remova o excesso de cloreto de cálcio do andaime enxaguando-o suavemente com PBS quente a 37 graus Celsius.
Cultive este andaime em meio de crescimento de células endoteliais a 37 graus Celsius em cinco por cento de volume de CO2, por até 16 dias. Troque o meio pelo menos a cada dois dias. Durante o período de cultura, monitore os HUVECs ao microscópio até que migrem para as periferias das microfibras do andaime e formem estruturas semelhantes a lúmens.
Em seguida, remova cuidadosamente todo o meio do espaço intrasticial do andaime com força capilar usando um pedaço de papel de filtro estéril. Adicione instantaneamente uma gota de suspensão de um tipo de célula secundária, como cardiomiócitos, no topo do andaime, permitindo que as células se infiltrem em todo o espaço intrasticial. Depois disso, incube esse andaime em uma incubadora por 30 minutos a duas horas, permitindo que as células adiram às microfibras individuais.
Remova as células não aderentes lavando suavemente o andaime com PBS. Cultive este andaime em meio apropriado até que o tecido vascularizado desejado seja formado. A bioimpressão microfluídica descrita aqui permite a bioimpressão direta de andaimes microfibrosos usando biotintas de baixa viscosidade.
Um andaime de seis por seis por seis milímetros quadrados de tamanho < contendo mais de 30 microfibras, pode ser bioimpresso em 10 minutos. As vistas superior e lateral das micrografias do andaime mostram a excelente integridade estrutural durante o processo de bioimpressão. Obtido com a reticulação iônica imediata do componente alginato com cloreto de cálcio.
Após a extrusão microfluídica da biotinta, reticulação iônica e fotoreticulação, os HUVECs mantiveram uma viabilidade relativamente alta. As células proliferaram e migraram da distribuição inicialmente aleatória no dia zero, para as periferias das microfibras no dia 16. Cardiomiócitos de ratos neonatais que foram semeados no andaime amadureceram e povoaram o andaime.
Eles mostraram forte expressão de biomarcadores cardíacos funcionais. Como alfa actinina sarcomérica e conexina 43. A microscopia confocal de um scaffold microfibroso bioimpresso, povoado por cardiomiócitos, revelou a coexistência de HUVECs e cardiomiócitos.
As HUVECs estão presentes principalmente nos limites das microfibras, enquanto os cardiomiócitos circundam o exterior das microfibras. As células foram capazes de manter seus batimentos espontâneos e sincronizados por até nove a 28 dias. Dependendo da fonte da célula e da configuração dos andaimes.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir tecidos vascularizados usando a técnica de bioimpressão microfluídica, bem como a fabricação de cabeçotes de impressão e operações de bioimpressora. A demonstração visual desse método é fundamental, pois a fabricação do cabeçote de impressão e as operações da bioimpressora podem ser complicadas para pessoas que nunca usaram uma antes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tornar as duas agulhas concêntricas na cabeça de impressão e deixar o fluxo se estabilizar antes de iniciar a bioimpressão.
Com o desenvolvimento desta técnica, os pesquisadores no campo da engenharia de tecidos e biofabricação agora têm outra ferramenta capacitadora para gerar construções de tecidos vascularizados para fins de regeneração in vivo ou para modelagem de tecidos in vitro.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma metodologia de bioimpressão microfluídica destinada a gerar construtos de tecido vascularizados. A técnica aborda desafios na biofabricação, permitindo a criação de um leito vascular tridimensional que pode ser povoado com tipos celulares secundários.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biofabricação
- Microfluídica
- Engenharia de Tecidos
Fundo
- A engenharia de tecidos vascularizados é crucial para o desenvolvimento de organoides.
- Os métodos atuais enfrentam limitações na criação de estruturas de tecido complexas.
- A bioimpressão microfluídica oferece uma abordagem versátil para superar esses desafios.
- Esta técnica pode ser adaptada para vários tipos de tecido, incluindo tecidos cardíacos, hepáticos e cutâneos.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um protocolo para criar construtos de tecido vascularizados.
- Melhorar a compreensão das técnicas de biofabricação.
- Fornecer uma base para futuras aplicações na engenharia de tecidos.
Métodos Utilizados
- Construção de uma cabeça de impressão microfluídica concêntrica de dupla camada.
- Utilização de uma agulha cega menor como núcleo dentro de uma agulha cega maior.
- Semeadura de tipos celulares secundários na estrutura microfibrosa.
- Aplicação do método a vários tipos de tecido além dos tecidos cardíacos.
Principais Resultados
- O protocolo gera com sucesso um construto de tecido vascularizado.
- Demonstrou versatilidade na criação de diferentes tipos de tecido.
- Forneceu insights sobre a engenharia de estruturas de tecido complexas.
- Identificou potenciais desafios para novatos no processo de bioimpressão.
Conclusões
- O método de bioimpressão microfluídica é eficaz para engenharia de tecidos vascularizados.
- Esta abordagem pode facilitar avanços na pesquisa de organoides.
- Estudos futuros podem expandir sua aplicação para outros tipos de tecidos e condições.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Microfluidic bioprinting enables the engineering of vascularized tissue constructs with high structural fidelity, addressing a critical bottleneck in preclinical model development. By generating perfusable microvascular networks within hydrogel scaffolds, this method supports the creation of more physiologically relevant tissue models for drug screening and mechanistic studies. The approach enhances predictive confidence in early discovery by providing a tunable platform to study cell-cell interactions, tissue maturation, and functional responses under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial-pericyte or stromal cell interactions within a defined vascular niche to validate therapeutic targets involved in angiogenesis or vascular permeability.
- Operational Value: Provides a reproducible, microfluidically controlled system for generating vascularized scaffolds with consistent microfiber architecture and lumen formation.
- Predictive Value: Supports assessment of compound effects on vascular integrity and cell migration in a human-relevant, 3D microenvironment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized microfibrous scaffolds with encapsulated endothelial cells that form lumen-like structures, enabling quantitative assessment of vascular network formation over time.
- Operational Value: Compatible with dual-channel syringe pump bioprinting, allowing precise control over bioink and crosslinking fluid delivery for high-throughput scaffold fabrication.
- Assay Readiness: Produces scaffolds with >30 microfibers in a 6x6x6 mm volume within 10 minutes, supporting scalable preparation for downstream secondary cell seeding and compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables secondary seeding of cardiomyocytes or other parenchymal cells into the interstitial space, facilitating the study of vascularized tissue maturation and synchronized contractile function.
- Translational Continuity: Supports long-term culture (>16 days) with monitoring of cell migration, lumen formation, and biomarker expression (e.g., sarcomeric alpha actinin, connexin 43) to model tissue-level responses.
- Risk Mitigation: Allows evaluation of cell viability, proliferation, and functional maturation under perfusion-like conditions, reducing attrition due to poor vascular engraftment in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing a vascularized platform that bridges simple monocultures and complex in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on vascular-dependent pathways by enabling controlled co-culture of endothelial and parenchymal cells in a defined 3D geometry.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with reproducible microstructure and endothelialization, suitable for evaluating compound effects on vascular stability and tissue organization.
- Analytics: Enables quantitative readouts via confocal microscopy of cell distribution, lumen formation, and biomarker co-localization to assess tissue quality and functional maturation.
- Translational Research: Models vascularized tissue development from early endothelial network formation to secondary cell integration, supporting preclinical validation of vascular-targeted or regenerative candidates.
- Enterprise Reuse: The microfluidic printhead design and bioink system (GelMA-alginate with ionic/photocrosslinking) represent a reusable platform adaptable to multiple tissue types (cardiac, liver, skin) and secondary cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by generating vascularized tissues with perfusable lumen-like structures and sustained cellular function (e.g., synchronized beating up to 28 days).
- Operational Value: Enables standardization of scaffold fabrication through microfluidic flow control, reducing variability in microfiber diameter, crosslinking efficiency, and cell distribution.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early insight into vascular compatibility and tissue-level responses, reducing late-stage failure due to inadequate vascularization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on their effects in a human-relevant, vascularized tissue model that recapitulates key structural and functional hallmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, including concentric needle assembly and epoxy sealing to prevent leakage.
- Dependent on dual-channel syringe pump systems and UV photocrosslinking equipment for precise bioink delivery and GelMA stabilization.
- Necessitates optimization of cell concentration (5–10×10⁶ HUVECs/mL) and flow rates (5 µL/min) to ensure cell viability and uniform encapsulation during printing.
- Requires aseptic handling and sterile filter paper for medium removal during secondary cell seeding to avoid contamination and ensure proper infiltration.
- Limited by the need for post-printing rinsing to remove excess calcium chloride, which adds a manual step that must be standardized across batches.
