Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

O objetivo geral desta metodologia de bioimpressão microfluídica é gerar uma construção de tecido vascularizado. Este método pode resolver questões-chave na biofabricação de tecidos vascularizados. A principal vantagem desta técnica é que ela é versátil na geração de uma cuba vascular controlada por forma tridimensional para engenharia de tecidos vascularizados através de um processo de semeadura celular secundária.

Embora este protocolo forneça informações sobre a engenharia de tecidos cardíacos vascularizados, ele também pode ser aplicado a muitos outros tipos de tecido, como fígado, pele e até câncer. Em geral, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque a configuração da bioimpressora pode não ser simples. Para iniciar este procedimento, construa uma cabeça de impressão microfluídica concêntrica de camada dupla inserindo uma agulha romba menor, servindo como núcleo, no centro da agulha romba maior, servindo como bainha.

Certifique-se de que a agulha central esteja saliente do invólucro externo aproximadamente um milímetro. Depois disso, insira uma agulha de calibre 23 no cano da agulha central na direção inversa. Faça um furo na lateral do cano da agulha externa e insira um conector de metal de tamanho correspondente.

Sele com cola epóxi. Monte a extrusora na cabeça de uma bioimpressora, usando um suporte de polimetilmetacrilato ou PMMA. Em seguida, para a injeção da biotinta e da solução de reticulação através de dois tubos de PVC individualmente, conecte as entradas da cabeça de impressão a uma bomba de seringa de canal duplo.

Faça a biotinta usando uma mistura de alginato, gelMA e fotoiniciador. Dissolvido em tampão HEPES 25 milimolar, contendo 10% de soro fetal bovino ou FBS. Em seguida, faça uma solução de cloreto de cálcio 0,3 molar em tampão HEPES contendo 10% de FBS para servir como fluido transportador de reticulação.

Logo antes da bioimpressão, tripsinize as células endoteliais da veia umbilical humana ou HUVECs por cinco a 10 minutos. Centrifugar as células a 800 RPM durante cinco minutos num tubo de 15 mililitros. Ressuspenda as células na biotinta a uma concentração de cinco a 10 vezes 10 a seis células por mililitro, pipetando lentamente cinco a 10 vezes.

Em seguida, use uma bomba de seringa de canal duplo para iniciar a injeção da biotinta carregada de HUVECs através de um e o fluido de reticulação através do outro canal a uma taxa de fluxo de cinco microlitros por minuto. Permita que os fluxos funcionem continuamente por até um minuto até que se estabilizem. Depois disso, inicie o movimento da cabeça de impressão, mantendo a velocidade de deposição da bioimpressora de aproximadamente quatro milímetros por segundo.

Essa bioimpressão deve resultar em gelificação iônica rápida do componente alginato e deposição de um andaime de microfibra. Depois que o andaime for impresso, reticule o componente gelMA com cinco a 10 miliwatts por centímetro quadrado de luz UV por 20 a 30 segundos para realizar a gelificação química. Em seguida, remova o excesso de cloreto de cálcio do andaime enxaguando-o suavemente com PBS quente a 37 graus Celsius.

Cultive este andaime em meio de crescimento de células endoteliais a 37 graus Celsius em cinco por cento de volume de CO2, por até 16 dias. Troque o meio pelo menos a cada dois dias. Durante o período de cultura, monitore os HUVECs ao microscópio até que migrem para as periferias das microfibras do andaime e formem estruturas semelhantes a lúmens.

Em seguida, remova cuidadosamente todo o meio do espaço intrasticial do andaime com força capilar usando um pedaço de papel de filtro estéril. Adicione instantaneamente uma gota de suspensão de um tipo de célula secundária, como cardiomiócitos, no topo do andaime, permitindo que as células se infiltrem em todo o espaço intrasticial. Depois disso, incube esse andaime em uma incubadora por 30 minutos a duas horas, permitindo que as células adiram às microfibras individuais.

Remova as células não aderentes lavando suavemente o andaime com PBS. Cultive este andaime em meio apropriado até que o tecido vascularizado desejado seja formado. A bioimpressão microfluídica descrita aqui permite a bioimpressão direta de andaimes microfibrosos usando biotintas de baixa viscosidade.

Um andaime de seis por seis por seis milímetros quadrados de tamanho < contendo mais de 30 microfibras, pode ser bioimpresso em 10 minutos. As vistas superior e lateral das micrografias do andaime mostram a excelente integridade estrutural durante o processo de bioimpressão. Obtido com a reticulação iônica imediata do componente alginato com cloreto de cálcio.

Após a extrusão microfluídica da biotinta, reticulação iônica e fotoreticulação, os HUVECs mantiveram uma viabilidade relativamente alta. As células proliferaram e migraram da distribuição inicialmente aleatória no dia zero, para as periferias das microfibras no dia 16. Cardiomiócitos de ratos neonatais que foram semeados no andaime amadureceram e povoaram o andaime.

Eles mostraram forte expressão de biomarcadores cardíacos funcionais. Como alfa actinina sarcomérica e conexina 43. A microscopia confocal de um scaffold microfibroso bioimpresso, povoado por cardiomiócitos, revelou a coexistência de HUVECs e cardiomiócitos.

As HUVECs estão presentes principalmente nos limites das microfibras, enquanto os cardiomiócitos circundam o exterior das microfibras. As células foram capazes de manter seus batimentos espontâneos e sincronizados por até nove a 28 dias. Dependendo da fonte da célula e da configuração dos andaimes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir tecidos vascularizados usando a técnica de bioimpressão microfluídica, bem como a fabricação de cabeçotes de impressão e operações de bioimpressora. A demonstração visual desse método é fundamental, pois a fabricação do cabeçote de impressão e as operações da bioimpressora podem ser complicadas para pessoas que nunca usaram uma antes. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tornar as duas agulhas concêntricas na cabeça de impressão e deixar o fluxo se estabilizar antes de iniciar a bioimpressão.

Com o desenvolvimento desta técnica, os pesquisadores no campo da engenharia de tecidos e biofabricação agora têm outra ferramenta capacitadora para gerar construções de tecidos vascularizados para fins de regeneração in vivo ou para modelagem de tecidos in vitro.