Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids
11 de agosto de 2017
Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.
O objetivo geral desta metodologia de bioprintagem microfluídica é gerar um constructo tecidual vascularizado. Este método pode resolver questões fundamentais na biofabricação de tecidos vascularizados. A principal vantagem desta técnica é sua versatilidade na geração de um vaso vascular tridimensional com forma controlada para a engenharia de tecidos vascularizados por meio de um processo secundário de semeadura celular.
Embora este protocolo forneça uma visão sobre a engenharia de tecidos cardíacos vascularizados, ele também pode ser aplicado a muitos outros tipos de tecidos, como fígado, pele e até mesmo cânceres. Indivíduos em geral, novos neste método, podem ter dificuldades porque a configuração da bioimpressora pode não ser simples. Para iniciar este procedimento, construa uma cabeça de impressão microfluídica de camada dupla concêntrica inserindo uma agulha romba menor, que serve como núcleo, no centro de uma agulha romba maior, que serve como revestimento.
Certifique-se de que a agulha central esteja protrudindo da capa externa aproximadamente um milímetro. Em seguida, insira uma agulha de calibre 23 no corpo da agulha central, em sentido contrário. Faça um orifício na lateral do corpo da agulha externa e insira um conector metálico de tamanho correspondente.
Selar com cola epóxi. Montar o extrusor na cabeça de uma bioimpressora, utilizando um suporte de polimetilmetacrilato ou PMMA. Em seguida, para a injeção do bioink e da solução de reticulação por meio de dois tubos de PVC separadamente, conectar as entradas da cabeça de impressão a uma bomba de seringa de dois canais.
Prepare a bionca usando uma mistura de alginato, gelMA e fotoiniciador. Dissolva em tampão HEPES 25 milimolar, contendo 10% de soro bovino fetal ou FBS. Em seguida, prepare uma solução de cloreto de cálcio 0,3 molar em tampão HEPES contendo 10% de FBS para servir como fluido veicular de reticulação.
Pouco antes da bioimpressão, trypsinize células endoteliais de veia umbilical humana ou HUVECs por cinco a 10 minutos. Centrifugue as células a 800 RPM por cinco minutos em um tubo de 15 mililitros. Re-suspenda as células na bio-tinta numa concentração de cinco a 10 vezes 10 à sexta potência de células por mililitro, pipetando lentamente de cinco a 10 vezes.
Em seguida, utilize uma bomba de seringa de duplo canal para iniciar a injeção da bio-tinta contendo HUVECs por um canal e do fluido de reticulação pelo outro canal, a uma taxa de fluxo de cinco microlitros por minuto. Deixe os fluxos correrem continuamente por até um minuto, até que se estabilizem. Após isso, inicie o movimento da cabeça de impressão, mantendo a velocidade de deposição da bioimpressora em aproximadamente quatro milímetros por segundo.
Essa bioimpressão deve resultar em rápida gelificação iônica do componente alginato e deposição de uma estrutura de microfibras. Após a estrutura ter sido impressa, realize a reticulação fotocrusada do componente gelMA com cinco a 10 miliwatts por centímetro quadrado de luz ultravioleta durante 20 a 30 segundos para concluir a gelificação química. Em seguida, remova o excesso de cloreto de cálcio da estrutura lavando-a suavemente com PBS aquecido a 37 graus Celsius.
Cultive este suporte em meio de crescimento de células endoteliais a 37 graus Celsius em 5% de CO₂, por até 16 dias. Troque o meio pelo menos a cada dois dias. Durante o período de cultivo, monitore as HUVECs ao microscópio até que migrem para as periferias das microfibras do suporte e formem estruturas semelhantes a lúmens.
Em seguida, remova cuidadosamente todo o meio do espaço intrasticial do suporte utilizando força capilar com um pedaço de papel filtro estéril. Adicione imediatamente uma gota de suspensão de um segundo tipo celular, como cardiomiócitos, sobre o suporte, permitindo que as células infiltrem todo o espaço intrasticial. Incube então este suporte em uma estufa por 30 minutos a duas horas, permitindo que as células adiram às microfibras individuais.
Remova as células não aderentes lavando suavemente o suporte com PBS. Cultive este suporte em meio apropriado até que o tecido vascularizado desejado seja formado. A bioprintagem microfluídica descrita aqui permite a bioprintagem direta de suportes microfibrilares utilizando bioinks de baixa viscosidade.
Uma estrutura de seis por seis por seis milímetros quadrados, contendo mais de 30 microfibras, pode ser bioprintada em menos de 10 minutos. As vistas superior e lateral de micrografias da estrutura mostram a excelente integridade estrutural durante o processo de bioprintagem. Isso é obtido pela reticulação iônica imediata do componente alginato com cloreto de cálcio.
Após a extrusão microfluídica do bioink, a reticulação iônica e a reticulação fotocravessada, as HUVECs mantiveram uma viabilidade relativamente alta. As células proliferaram e migraram a partir da distribuição inicialmente aleatória no dia zero até as periferias das microfibras no dia 16. Os cardiomiócitos de rato neonatal semeados sobre o suporte maduraram e colonizaram o suporte.
Eles mostraram forte expressão de biomarcadores cardíacos funcionais, como a alfa-actinina sarcomérica e a conexina 43. A microscopia confocal de um andamio microfibrilar bioprintado, colonizado por cardiomiócitos, revelou a coexistência de HUVECs e cardiomiócitos.
As HUVECs estão principalmente presentes nas bordas das microfibras, enquanto os cardiomiócitos envolvem a parte externa das microfibras. As células foram capazes de manter suas contrações espontâneas e sincronizadas por até nove a 28 dias. Dependendo da fonte celular e da configuração dos andamios.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir tecidos vascularizados utilizando a técnica de bioprintagem microfluídica, bem como da fabricação da cabeça de impressão e do funcionamento da bioprintadora. A demonstração visual deste método é essencial, pois a fabricação da cabeça de impressão e o funcionamento da bioprintadora podem ser difíceis para pessoas que nunca utilizaram esse equipamento anteriormente. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de posicionar as duas agulhas de forma concêntrica na cabeça de impressão e aguardar a estabilização do fluxo antes de iniciar a bioprintagem.
Com o desenvolvimento desta técnica, pesquisadores na área de engenharia de tecidos e biofabricação agora possuem outra ferramenta viabilizadora para gerar construtos teciduais vascularizados, seja para fins de regeneração in vivo ou para modelagem de tecidos in vitro.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma metodologia de bioprintagem microfluídica voltada para a geração de construtos teciduais vascularizados. A técnica aborda desafios na biofabricação ao permitir a criação de um leito vascular tridimensional que pode ser povoado com tipos celulares secundários.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Biofabricação
- Microssistemas
- Engenharia de Tecidos
Antecedentes
- A engenharia de tecidos vascularizados é fundamental para o desenvolvimento de organoides.
- Os métodos atuais enfrentam limitações na criação de estruturas teciduais complexas.
- A bioprintagem microfluídica oferece uma abordagem versátil para superar esses desafios.
- Essa técnica pode ser adaptada para diversos tipos de tecidos, incluindo tecidos cardíaco, hepático e cutâneo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para a criação de construtos teciduais vascularizados.
- Aprimorar a compreensão das técnicas de biofabricação.
- Fornecer uma base para aplicações futuras na engenharia de tecidos.
Métodos Utilizados
- Construção de uma cabeça de impressão microfluídica concêntrica de dupla camada.
- Utilização de uma agulha romba menor como núcleo dentro de uma agulha romba maior.
- Implante de tipos celulares secundários na estrutura microfibrilar.
- Aplicação do método a diversos tipos de tecidos além dos tecidos cardíacos.
Resultados Principais
- O protocolo gera com sucesso um constructo tecidual vascularizado.
- Demonstrou versatilidade na criação de diferentes tipos de tecidos.
- Forneceram insights sobre a engenharia de estruturas teciduais complexas.
- Identificaram desafios potenciais para iniciantes no processo de bioprintagem.
Conclusões
- O método de bioprintagem microfluídica é eficaz para a engenharia de tecidos vascularizados.
- Essa abordagem pode facilitar avanços na pesquisa de organoides.
- Estudos futuros podem expandir sua aplicação para outros tipos e condições de tecidos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A bioprintagem microfluídica permite a engenharia de construtos teciduais vascularizados com alta fidelidade estrutural, abordando um gargalo crítico no desenvolvimento de modelos pré-clínicos. Ao gerar redes microvasculares perfusíveis dentro de esqueletos de hidrogel, este método apoia a criação de modelos teciduais mais fisiologicamente relevantes para triagem de fármacos e estudos mecanicistas. A abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, fornecendo uma plataforma ajustável para estudar interações célula-célula, maturação tecidual e respostas funcionais sob condições controladas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as interações entre células endoteliais e pericitos ou células estromais dentro de um nicho vascular definido, a fim de validar alvos terapêuticos envolvidos na angiogênese ou na permeabilidade vascular.
- Valor Operacional: Oferece um sistema reprodutível e controlado por microfluídica para gerar scaffolds vascularizados com arquitetura de microfibras e formação de lúmen consistentes.
- Valor Preditivo: Permite a avaliação dos efeitos de compostos sobre a integridade vascular e a migração celular em um microambiente tridimensional relevante para o ser humano.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera scaffolds microfibrilares padronizados com células endoteliais encapsuladas que formam estruturas semelhantes a lúmens, permitindo a avaliação quantitativa da formação de redes vasculares ao longo do tempo.
- Valor Operacional: Compatível com bioprintagem por bomba de seringa de dois canais, permitindo controle preciso na entrega do bioink e do fluido de reticulação para fabricação de scaffolds em alto rendimento.
- Prontidão para Ensaios: Produz scaffolds com mais de 30 microfibras em um volume de 6x6x6 mm dentro de 10 minutos, apoiando a preparação escalonável para semeadura secundária de células e triagem de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Permite o resemeamento de cardiomiócitos ou outras células parenquimatosas no espaço intersticial, facilitando o estudo da maturação do tecido vascularizado e da função contrátil sincronizada.
- Continuidade Tradutiva: Permite o cultivo de longo prazo (>16 dias) com monitoramento da migração celular, formação de lúmen e expressão de biomarcadores (por exemplo, alfa-actinina sarcomérica, conexina 43) para modelar respostas em nível tecidual.
- Mitigação de Riscos: Permite a avaliação da viabilidade celular, proliferação e maturação funcional em condições semelhantes à perfusão, reduzindo a perda celular devido ao fraco enxerto vascular em estágios posteriores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto líder, fornecendo uma plataforma vascularizada que intermedia culturas monoclonais simples e modelos complexos in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias dependentes de vasos sanguíneos ao permitir o co-cultivo controlado de células endoteliais e parênquimas em uma geometria tridimensional definida.
- Triagem: Fornece suportes prontos para ensaios com microestrutura reprodutível e endotelialização, adequados para avaliar os efeitos de compostos na estabilidade vascular e na organização tecidual.
- Análises: Permite leituras quantitativas por meio de microscopia confocal da distribuição celular, formação de lúmen e co-localização de biomarcadores para avaliar a qualidade tecidual e a maturação funcional.
- Pesquisa Translacional: Modela o desenvolvimento de tecidos vascularizados, desde a formação inicial da rede endotelial até a integração de células secundárias, apoiando a validação pré-clínica de candidatos voltados para vasos sanguíneos ou regenerativos.
- Reutilização Empresarial: O design do cabeçote microfluídico e o sistema de bio-tinta (GelMA-alginate com reticulação iônica/fotocrível) representam uma plataforma reutilizável adaptável a múltiplos tipos de tecidos (cardíaco, hepático, cutâneo) e tipos de células secundárias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao gerar tecidos vascularizados com estruturas semelhantes a lúmens perfuráveis e função celular sustentada (por exemplo, batimento sincronizado por até 28 dias).
- Valor Operacional: Permite a padronização da fabricação de scaffolds por meio do controle de fluxo microfluídico, reduzindo a variabilidade no diâmetro das microfibras, eficiência de reticulação e distribuição celular.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer insights precoces sobre compatibilidade vascular e respostas em nível tecidual, reduzindo falhas em estágios avançados devido à vascularização inadequada.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em seus efeitos em um modelo de tecido vascularizado, relevante para humanos, que recapitula marcos estruturais e funcionais essenciais.
Considerações de Implementação
- Exige experiência na fabricação de dispositivos microfluídicos, incluindo montagem de agulhas concêntricas e vedação com epóxi para prevenir vazamentos.
- Depende de sistemas de bomba de seringa de dois canais e equipamentos de fotopolimerização por UV para entrega precisa do bioink e estabilização do GelMA.
- Necessita otimização da concentração celular (5–10×10⁶ HUVECs/mL) e das taxas de fluxo (5 µL/min) para garantir viabilidade celular e encapsulamento uniforme durante a impressão.
- Requer manipulação asséptica e papel filtro estéril para remoção do meio durante o semeadura secundária de células, evitando contaminação e assegurando adequada infiltração.
- É limitado pela necessidade de lavagem pós-impressão para remover o excesso de cloreto de cálcio, o que adiciona uma etapa manual que deve ser padronizada entre os lotes.
