Name: A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a usar estimulação de corrente contínua catódica e matriz multieletrodo para avaliar atividades tipo convulsão em fatias de cérebro de camundongo. Este método permite analisar vias neurais específicas e efeitos terapêuticos in vitro.

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Agradecemos o apoio técnico do Núcleo de Eletrofisiologia de Circuitos Neurais da Academia Sinica. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência (102-2320-B-001-026-MY3 e 100-2311-B-001-003-MY3) e pelo Programa de Neurociência da Academia Sinica.

Procedimentos que envolvem indivíduos animais foram aprovados pelo Cuidado Institucional Animal e Comité de Utilização, Academia Sinica, Taipei, Taiwan. 1. Preparar Solução Experimental e Equipamentos para multieletrodo gravação matriz <ol><li> Prepare artificial fluido cerebrospinal (aCSF; NaCI 124 mM, KCl 4,4 mM, 1 mM de NaH 2 PO 3, MgSO 2 mM de 4, 2 mM de CaCl2, mM de NaHCO 25, 3, e 10 mM de glucose, borbulhado com 95% de O 2 e 5% de CO 2). </li><li> Usar dois tipos de sondas MEA: 6 x 10 planar MEA e 8 x 8 MEA. O ex capas de sonda da região que compreende o córtex, corpo estriado, e tálamo. A última sonda abrange apenas a região cortical. </li><li> Usar um amplificador de 60 canais com um filtro passa-faixa situada entre 0,1 Hz e 3 kHz a 1.200 amplificação. Aquisição de dados em uma taxa de amostragem de 10 kHz. </li><li> Coloque dois fios de prata AgCl-revestidos no interior da câmara de MEA para DCS. Use o AgClfios de prata -Revestido para produzir campos elétricos que são gerados por um estimulador isolado. </li><li> Coloque um eletrodo de tungstênio (diâmetro, 127 mm, comprimento, 7,62 cm; 8 ° AC ponta cônica, resistência, 5 mohms) para a estimulação do tálamo, e colocar o eletrodo de referência na câmara de MEA. Entregar correntes do eléctrodo de tungsténio usando um estimulador isolado que é controlado por um gerador de impulsos. </li></ol> 2. Cérebro Slice Preparação <ol><li> Utilizar ratos machos C57BL / 6J, 4-8 semanas de idade. Casa os animais em uma sala com ar condicionado (21-23 ° C, 50% de umidade; 12 horas de luz / 12 h / ciclo escuro, luzes acesas às 08:00) com livre acesso a comida e água. </li><li> Tomar uma aliquota de 250 ml da aCSF que foi preparado no passo 1.1, e coloque-o num copo que contém gelo. Ao mesmo tempo, o fornecimento de gás contínua, que é composto por 95% de O2 e 5% de CO 2. </li><li> Cirurgia <ol><li> Anestesiar os animais com 4% de isoflurano em um copoBox para cerca de 3 min. Uma vez que o animal atinge uma profundidade cirúrgico de anestesia (indicado pela falta de uma resposta a pitada tep), coloque-o em uma bandeja rasa que é preenchido com gelo picado e remover a cabeça com uma tesoura. </li><li> Expor o crânio, e retire o músculo remanescente. Em seguida, utilizando fórceps, descascar a superfície dorsal do crânio a partir do cérebro. Aparar os lados do crânio utilizando fórceps. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos com uma solução de etanol a 75%. </li><li> Com uma espátula, cortar os bulbos olfativos e ligações nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro, e remover o cérebro. Após a decapitação, o cérebro rapidamente transferir para um recipiente cheio com aCSF oxigenado gelado. </li></ol></li><li> Preparação da Medial Tálamo (MT) -ACC Cérebro Slice Nota: Prepare fatias que contêm o caminho do MT para ACC 13. <ol><li> Mão-cortar o bloco cérebro com dois cortes sagital 2,0 mm lateral à linha mediana em cada hemisfériopara exibir a anatomia subcortical. Em seguida, faça dois cortes em ângulo. Adicione o primeiro corte transversal paralelo ao tracto fibra visível no corpo estriado. </li><li> Adicione o segundo corte transversal a partir da ligação entre o cerebelo e córtex visual para o ponto médio entre a comissura anterior e trato óptico que são ventral e paralela à via thalamocingulate. </li><li> Fixe o bloco cérebro para uma placa angular (~ 120 °) com adesivo de cianoacrilato, e fazer um corte um pouco acima do ponto de viragem da via. Desdobrar a placa, alise-o e cole-o palco das câmaras de um vibratome. </li><li> Faça fatias de cérebro tálamo-ACC medial (500 mm de espessura) e, em seguida, mergulhe-os em gelada oxigenados fatias aCSF.Transfer para a câmara de gravação, e mantenha a 32 ° C sob perfusão contínua (12 ml / min) com aCSF oxigenado para 1 h. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de Perfusão Câmara para multieletrodo gravação matriz <ol><li> Preparaçãode Perfusão Câmara <ol><li> Coloque uma sonda MEA em um sistema multi-canal e usar dois tubos de polietileno separados para conectar a sonda a uma bomba peristáltica. Utilizar um tubo para guiar o aCSF para a câmara de MEA e o outro tubo para guiar o aCSF para fora da câmara. Finalmente, continuamente perfundir a preparação com água morna (29-30 ° C) aCSF oxigenado (8 mL / min). </li></ol></li><li> Transferir fatia do cérebro para MEA. Mantenha pressionada a fatia do cérebro sobre o MEA com um cotonete molhado. mover cuidadosamente a fatia do cérebro para garantir a ACC é orientada acima dos eletrodos. </li><li> Use kits de âncora fatia e mantêm-downs para pressionar a fatia do cérebro. Esta etapa garante uma boa conexão elétrica entre a fatia e eletrodos. </li></ol> 4. Geração de campos elétricos pela DCS Nota: A definição da orientação do campo eléctrico baseou-se na direcção do eixo axodendritic no ACC. As orientações de dendríticos e Soma compartimentos foramconfirmada usando Golgi coloração 12. <ol><li> Coloque a AgCl (definida como o ânodo) proximal ao ACC, e colocar o outro eléctrodo (definidos como o cátodo) distai em relação à ACC. Grave a intensidade do campo que é gerada pelas duas orientações de campo (paralelas e perpendiculares às fibras axodendritic ACC) de MEA, e entregar as correntes dos campos eléctricos, utilizando um estimulador. </li><li> Fixar a distância dos eléctrodos de AgCl (cerca de 1,5-2 cm), e ajustar a intensidade de corrente do estimulador para fazer o DCS entre 0,5 e 2 mA. </li></ol> 5. induzidas eletricamente respostas corticais Synaptic Nota: induzir respostas sinápticas no ACC por estimulação eléctrica no MT, em que um gerador de estímulo eléctrico programável produz impulsos de corrente bifásica rectangulares. <ol><li> Repita Seção 3 acima. </li><li> Coloque um eletrodo de tungstênio no MT, e entregar pulsos do estimulador à Thalregião Amic das fatias através de eléctrodos de tungsténio bipolares. </li><li> Use várias intensidades de corrente para determinar o limiar que provoca uma resposta ACC. Aqui, utilizar uma intensidade de ± 150 mA e a duração de 200 ms, o que induziu uma resposta máxima de 80% na maioria dos ACC em fatias. </li><li> Mova o eletrodo de tungstênio ao longo da via thalamocingulate (de MT para corpo caloso) na fatia MT-ACC para obter os perfis de resposta ideais. </li><li> Faça 10-20 varreduras de respostas ACC, e usar o software para automaticamente a média de todos os ACC evocado por estimulação MT. O resultado iss as respostas sinápticas em ACC induzidas a partir de estimulação MT pela MT-ACC via. </li></ol> 6. perda de consciência induzida eletricamente Nota: perda de consciência foi induzida pela aplicação de 4-aminopiridina (4-AP; 250 uM) e bicuculina (5 uM). estudos de controle de tempo anteriores mostraram que as respostas máximas e estáveis ​​apareceu2-3 horas após a aplicação do fármaco 14. <ol><li> Repita Seção 5 acima. </li><li> Adicionar drogas para a solução de perfusão. Use 4-AP (250 uM) e bicuculina (5 uM). Misturar as drogas uniformemente, e continuar a perfusão de 2-3 horas. </li><li> Para facilitar a perda de consciência, a manutenção da bomba de perfusão a uma taxa relativamente rápida de perfusão (8 ml / min), que também pode ajudar a prevenir a acumulação de um gradiente de pH. </li><li> Coloque um eletrodo de tungstênio no MT, e entregar a estimulação elétrica (150 mA, 200 ms de duração) para obter perfis de resposta ACC. </li><li> Faça 10-20 varreduras e calcular a média das respostas. </li><li> Substitua a solução de perfusão com aCSF fresca para lavar as drogas. Repita o passo 6.5. </li></ol> 7. Teste de Efeito da DCS em respostas corticais evocados <ol><li> Repita as secções 3 e 4. Certifique-se que os campos eléctricos uniformes são geradas pela passagem de correntes entre dois fios de prata AgCl revestidas paralelas que são colocados dentro do Mcâmara de EA. Se não houver problemas, a DCS fica entre 0,5 e 2 mA. </li><li> Desligue o DCS, e colocar um eletrodo de tungstênio para estimular o tálamo (± 150 mA, 200 ms de duração). Para obter respostas sinápticas máximas na ACC, fazer 10-20 varreduras e calcular a média das respostas. </li><li> Simultaneamente ligar o DCS (2 mV / mm força DCS) e estimulação do tálamo (350 mA, 200 ms de duração). Avaliar as alterações da amplitude da resposta evocada ACC-estimulação talâmica durante DCS. </li><li> Desligue o DCS, e adicionar 4-AP (250 uM) e bicuculina (5 uM) para a solução de perfusão. Então espere 2-3 hr. Quando as drogas afetam a fatia do cérebro, a fatia produz respostas apreensão corticais. </li><li> Faça 10-20 varreduras de respostas ACC, em seguida, medir a amplitude e duração das respostas apreensão corticais evocados elétricos. </li><li> Após o passo 7.5, ligue simultaneamente no DCS (2 mV / mm DCS força) e estimulação do tálamo (150 mA, 200 duratiem ms). Avaliar as alterações na amplitude e duração das respostas apreensão corticais evocados durante a aplicação DCS. </li><li> Substitua a solução de perfusão com aCSF fresca para lavar as drogas, e repita os passos 7.2 e 7.3. </li><li> Recolher todos os dados de gravação, e agrupar os dados em diferentes condições experimentais. Avaliar a amplitude e a duração das respostas convulsivos corticais sob diferentes condições experimentais. </li></ol> Análise 8. Dados <ol><li> Use software (por exemplo, software cremalheira MC) para calcular a média automaticamente as respostas gravadas, e exportar os dados brutos para uma planilha. Analisar a amplitude e a duração dos dados em bruto e gerar dados de cor. </li><li> Para detectar eventos apreensão oscilatórios, usar o software para medir o valor da linha de base e desvios padrão (SD). Set 3 SD do nível de ruído como o limiar. Amplitudes dos picos durante um evento de oscilação que ultrapassam esse limite são automaticamente detectarEd. </li><li> Realizar a análise estatística utilizando teste t de Student. </li><li> Medições Express e one-way análise de variância (ANOVA) resulta no texto como média ± SE, com n indicando o número de fatias estudou 12. </li></ol>

<ol><li>Schiller, Y., Najjar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+response+to+antiepileptic+drugs%3A+effect+of+past+treatment+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying the response to antiepileptic drugs: effect of past treatment history.</a> Neurology. 70 (1), 54-65 (2008).</li>
<li>Fregni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+clinical+trial+of+cathodal+DC+polarization+in+patients+with+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A controlled clinical trial of cathodal DC polarization in patients with refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 47 (2), 335-342 (2006).</li>
<li>Auvichayapat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+direct+current+stimulation+for+treatment+of+refractory+childhood+focal+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimul%22%5BJournal%5D)">Transcranial direct current stimulation for treatment of refractory childhood focal epilepsy.</a> Brain Stimul. 6 (4), 696-700 (2013).</li>
<li>Chung, M. G., Lo, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+brain+stimulation%3A+the+potential+for+use+in+the+rehabilitation+of+pediatric+acquired+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Noninvasive brain stimulation: the potential for use in the rehabilitation of pediatric acquired brain injury.</a> Arch Phys Med Rehabil. 96 (4 Suppl), S129-S137 (2015).</li>
<li>Del Felice, A., Magalini, A., Masiero, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-oscillatory+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+Modulates+Memory+in+Temporal+Lobe+Epilepsy+by+Altering+Sleep+Spindle+Generators%3A+A+Possible+Rehabilitation+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimul%22%5BJournal%5D)">Slow-oscillatory Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Memory in Temporal Lobe Epilepsy by Altering Sleep Spindle Generators: A Possible Rehabilitation Tool.</a> Brain Stimul. 8 (3), 567-573 (2015).</li>
<li>Garnett, E. O., Malyutina, S., Datta, A., den Ouden, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Use+of+the+Terms+Anodal+and+Cathodal+in+High-Definition+Transcranial+Direct+Current+Stimulation%3A+A+Technical+Note%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">On the Use of the Terms Anodal and Cathodal in High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation: A Technical Note.</a> Neuromodulation. , (2015).</li>
<li>Biraben, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+as+the+main+feature+of+epileptic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Neurosurg.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Fear as the main feature of epileptic seizures.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 70 (2), 186-191 (2001).</li>
<li>Zaatreh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontal+lobe+tumoral+epilepsy%3A+clinical%2C+neurophysiologic+features+and+predictors+of+surgical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Frontal lobe tumoral epilepsy: clinical, neurophysiologic features and predictors of surgical outcome.</a> Epilepsia. 43 (7), 727-733 (2002).</li>
<li>Karim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+truth+about+lying%3A+inhibition+of+the+anterior+prefrontal+cortex+improves+deceptive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">The truth about lying: inhibition of the anterior prefrontal cortex improves deceptive behavior.</a> Cereb. Cortex. 20 (1), 205-213 (2010).</li>
<li>Keeser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+transcranial+direct+current+stimulation+changes+connectivity+of+resting-state+networks+during+fMRI%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal transcranial direct current stimulation changes connectivity of resting-state networks during fMRI.</a> J. Neurosci. 31 (43), 15284-15293 (2011).</li>
<li>Nelson, J. T., McKinley, R. A., Golob, E. J., Warm, J. S., Parasuraman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+vigilance+in+operators+with+prefrontal+cortex+transcranial+direct+current+stimulation+%28tDCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Enhancing vigilance in operators with prefrontal cortex transcranial direct current stimulation (tDCS).</a> Neuroimage. 85 (Pt 3), 909-917 (2014).</li>
<li>Chang, W. P., Lu, H. C., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+direct-current+stimulation+against+cingulate+seizure-like+activity+induced+by+4-aminopyridine+and+bicuculline+in+an+in+vitro+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment with direct-current stimulation against cingulate seizure-like activity induced by 4-aminopyridine and bicuculline in an in vitro mouse model.</a> Exp. Neurol. 265, 180-192 (2015).</li>
<li>Lee, C. M., Chang, W. C., Chang, K. B., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+and+input-specific+short-term+plasticity+in+anterior+cingulate+cortical+neurons+with+intact+thalamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization and input-specific short-term plasticity in anterior cingulate cortical neurons with intact thalamic inputs.</a> Eur. J. Neurosci. 25 (9), 2847-2861 (2007).</li>
<li>Chang, W. P., Shyu, B. C. Involvement of the thalamocingulate pathway in the regulation of cortical seizure activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+WP+%22Recent+Research+Developments+in+Neuroscience%22">Recent Research Developments in Neuroscience</a>. Pandalai, S. G. 4, Research Signpost. Kerala. 1-27 (2013).</li>
<li>Brummer, S. B., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+considerations+for+safe+electrical+stimulation+of+the+nervous+system+with+platinum+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electrochemical considerations for safe electrical stimulation of the nervous system with platinum electrodes.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 24 (1), 59-63 (1977).</li>
<li>Durand, D. M., Bikson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+and+control+of+epileptiform+activity+by+electrical+stimulation%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+IEEE%22%5BJournal%5D)">Suppression and control of epileptiform activity by electrical stimulation: a review.</a> Proc. IEEE. 89 (7), 1065-1082 (2001).</li>
<li>Fritsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+current+stimulation+promotes+BDNF-dependent+synaptic+plasticity%3A+potential+implications+for+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning.</a> Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

No presente estudo, foram testados os efeitos da duração e orientação da DCS na perda de consciência ACC. Para obter dados estáveis ​​em fatias de cérebro de rato, como para manter a integridade da via-MT ACC e para evitar danos que é fundamental, em especial os passos no qual dois cortes angulares ventral e dorsal de um corte do córtex são feitas. Além disso, o tempo necessário para preparar a fatia de cérebro também pode afectar a actividade da fatia do cérebro, o que deve ser o menor tempo possível, para manter o cér...

A epilepsia é um distúrbio neurológico comum. Trinta por cento dos pacientes com epilepsia sofrem de convulsões resistentes a medicamentos1. A estimulação transcraniana por corrente contínua (ETCC) fornece uma abordagem não invasiva para controlar ou alterar as atividades da rede em grandes áreas do cérebro, como convulsões. Estudos clínicos mostraram que a ETCC trata efetivamente as convulsões intratáveis2 e pode produzir efeitos supressivos de curto e longo prazo nas convulsões3-5. No entanto, o mecanismo terapêutico das ações da ETCC ainda não está claro. O modelo de fatia cerebral apresentado é um método in vitro para investigar como o mecanismo terapêutico das ações da ETCC altera os sintomas de atividades cerebrais semelhantes a convulsões. Assim, para alcançar seus efeitos ideais, parâmetros específicos de estimulação, incluindo orientação, intensidade de campo e duração da estimulação, precisam ser testados em um modelo experimental. Estudos anteriores mostraram que a orientação do campo elétrico é importante para a obtenção de efeitos terapêuticos6. Assim, testar e organizar a orientação dos eletrodos em relação à posição da fatia de cérebro testada é viável.
A epilepsia do lobo frontal e as convulsões do córtex cingulado anterior (ACC) são frequentemente resistentes a medicamentos7,8. Alguns estudos relataram a aplicação da ETCC no córtex cingulado9-11. A ETCC demonstrou afetar a vigilância, a tomada de decisão e a emoção por meio da alteração das atividades do ACC, e pode modular a excitabilidade neuronal e a atividade convulsiva nessa região do cérebro12. Portanto, os efeitos supressores da ETCC nas convulsões do ACC podem ser úteis para o tratamento clínico e a avaliação de tratamentos alternativos.
O presente protocolo descreve a preparação de um eletrodo na câmara de registro para DCS de uma fatia de cérebro e seu efeito no registro da atividade semelhante a uma convulsão com um arranjo de multieletrodos (MEA).

<table><tbody><tr><td><forte>Anestésico:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Halocarbon Products Corporation&nbsp;</td><td>NDC 12164-002-25</td><td>4%</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>aCSF (total:1 L):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glicose</td><td>MERCK</td><td>1.08337.1000</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio</td><td>MERCK</td><td>1.06329.0500</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>MERCK</td><td>1.06404.1000</td><td>124 mM</td></tr> <tr><td>(+) -L-ascorbato, > = 98%</td> <td>SIGMA</td><td>A4034-100G</td><td>0.15 g / 2 c.c</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio, anidro, ReagentPlus</td><td>SIGMA</td><td>M7506-500G</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>MERCK</td><td>1.02382.1000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de sódio monohidratado</td><td>MERCK</td><td>1.06346.1000</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>maio & Baker LTD Dagenham Inglaterra</td><td>MS 7616</td><td>4.4 mM</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Drogas:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Bicuculline</td><td>TOCRIS</td><td>0130</td><td>5 &micro; M em aCSF</td></tr><tr><td>4-Aminopiridina</td><td>TOCRIS</td><td>0940</td><td>250 &micro; M em aCSF</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Preparação da fatia do cérebro:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>Series 1000</td><td>Bloco cortando em 500 &micro; m fatias grossas</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Sistema MEA:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondas de matriz multieletrodo (MEA): 6 x 10 sistemas multicanal MEA planares</td><td></td><td>60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10</td><td>diâmetro do eletrodo, 30 &micro; m; espaçamento entre eletrodos, 500 e micro; m; impedância, 50 k&Omega; a 200 Hz</td></tr><tr><td>Sondas de matriz de múltiplos eletrodos (MEA): 8 x 8 MEA&nbsp;</td><td>Eletrodo piramidal Ayanda Biosystems</td><td>60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8</td>; <td>diâmetro, 40 &micro; m; altura da ponta, 50 &micro; m; espaçamento entre eletrodos, 200 e micro; m; impedância, 1.000 k&Omega; a 200 Hz</td></tr><tr><td>Um amplificador de 60 canais foi usado com um filtro passa-banda ajustado entre 0,1 Hz e 3 KHz a 1.200X de amplificação Sistemas</td><td>Multicanal</td><td>MEA-1060-BC</td><td></td></tr><tr><td>MC Software Rack a uma taxa de amostragem de 10 KHz</td> Software de Sistemas <td></td><td>Multicanal</td><td>para coleta de dados e controle de gravações</td></tr><tr><td>de um gerador de pulsos</td><td>Sistemas Multicanal</td><td>STG 1002</td><td></td></tr><tr><td>kits de ancoragem de fatia e hold-downs</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26H/10; WI64-0250</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica-minipuls3</td><td>Gilsom</td><td>Taxa de</td><td>perfusão MINIPULS3: 8 ml/min</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Sistema de estimulação:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador isolado</td><td>Sistemas A-M</td><td>Modelo 2100</td><td>intensidade de &plusmn; 350 &mu; A , duração de 200 &mu; sec</td></tr><tr><td>Eletrodo de tungstênio</td><td>AM Systems</td><td>575300</td><td>colocado no tálamo</td></tr></tbody></table>

a estimulação de corrente contínua e multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em ratos cérebro slice preparação

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Catódica transcraniana estimulação de corrente contínua (ETCC) induz efeitos supressores sobre as apreensões resistentes aos medicamentos. Para executar ações efetivas, os parâmetros de estimulação (por exemplo, orientação, força de campo, e duração de estimulação) precisam ser examinadas em preparações fatia ratos cerebrais. Testes e providenciar a orientação do eléctrodo em relação à posição da fatia de cérebro ratinhos são viáveis. O presente método preserva a via thalamocingulate para avaliar o efeito de DCS sobre as actividades do tipo convulsivas córtex cingulado anterior. Os resultados das gravações de matriz multicanal indicou que catódica DCS diminuiu significativamente a amplitude das respostas evocadas por estimulação e a duração de 4-aminopiridina e perda de consciência induzida por bicuculina. Este estudo também descobriu que as aplicações DCS catódica em 15 min causou depressão a longo prazo na via thalamocingulate. O presente estudo investiga os efeitos da DCS em thalamocingulate plasticidade sináptica e atividades agudas apreensão-like. O processo actual pode testar os parâmetros de estimulação óptima incluindo a orientação, intensidade de campo, e a duração de uma estimulação in vitro no modelo de ratinho. Além disso, o método pode avaliar os efeitos da DCS sobre as atividades do tipo convulsivas corticais em ambos os níveis celulares e de rede.

Preparação do Setup Thalamocingulate Fatia e MEA Sistema de Gravação A fatia MT-ACC de ratinhos é uma preparação fatia especial que permite a exploração das propriedades electrofisiológicas da via thalamocingulate. A Figura 1A mostra a maneira na qual a fatia MT-ACC foi preparado. O cérebro de rato foi rapidamente removido e mantido em aCSF oxigenado fresco (Figura 1A, a, b). Para revelar a an...

Estudos mostraram que a estimulação transcraniana catódica por corrente contínua pode produzir efeitos supressivos em convulsões resistentes a medicamentos. Neste estudo, foi desenvolvido um arranjo experimental in vitro no qual a estimulação por corrente contínua e o registro de multieletrodos da atividade semelhante a convulsões foram avaliados na preparação de fatias de cérebro de camundongos. Os parâmetros de estimulação por corrente contínua foram avaliados.

A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é acessar o arranjo dos eletrodos na câmara de gravação para estimulação com corrente contínua de um corte cerebral e seu efeito sobre a atividade semelhante a convulsões registrada com uma matriz de múltiplos eletrodos. Isso pode ajudar melhor a responder perguntas-chave sobre a stimulação com corrente contínua e a atividade semelhante a convulsões registrada por matriz de múltiplos eletrodos em cortes cerebrais de camundongo. Uma vantagem desta técnica é que os efeitos da estimulação com corrente contínua podem ser avaliados na via específica do corte cerebral de camundongo.Quem demonstrará o procedimento será Hsiang Chin e Wei-Jen Chang, técnicos do meu laboratório. Neste procedimento, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com solução de etanol 75% antes do experimento. Em seguida, exponha o crânio do animal e remova os músculos residuais.Em seguida, remova a superfície dorsal do crânio utilizando rongeurs e corte as laterais. Posteriormente, com uma espátula, corte os bulbos olfativos e as conexões nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro antes de removê-lo. Transfira rapidamente o cérebro para um béquer contendo ACSF gelado e oxigenado.Para preparar fatias contendo a via MT-ACC, faça um corte sagital, 2 mm lateral à linha média em cada hemisfério, para expor a anatomia subcortical. Em seguida, faça um corte transversal angulado paralelo ao trato de fibras visível no estriado. Faça o segundo corte transversal angulado a partir da conexão entre o cerebelo e o córtex visual até o ponto médio entre a comissura anterior e o trato óptico, que estão ventrais e paralelos à via cingulada do tálamo.Em seguida, fixe o bloco cerebral a uma placa angular com um adesivo de cianoacrilato. Faça um corte logo acima do ponto de curvatura do trajeto. Depois disso, desdobre a placa, aplainando-a, e cole-a na platina da câmara de um vibrátomo.Posteriormente, seccione as fatias cerebrais com espessura de 500 micrômetros e mantenha-as em ACSF oxigenado e gelado. Transfira uma fatia para a câmara de registro a 32 graus Celsius com perfusão contínua de ACSF oxigenado por uma hora. Confirme a colocação de uma sonda MEA no sistema multicanal.Use um tubo para direcionar o ACSF para dentro da câmara do MEA e o outro tubo para direcionar o ACSF para fora da câmara. Perfuse continuamente o preparado com ACSF aquecido e oxigenado a 30 graus Celsius. Usando um cotonete úmido, transfira uma fatia de cérebro para o MEA.Mova cuidadosamente a fatia cerebral para posicionar a ACC acima dos eletrodos e, em seguida, estabilize a fatia cerebral com um suporte para fatias, garantindo uma boa conexão elétrica entre a fatia e os eletrodos. Depois disso, posicione o eletrodo anódico próximo à ACC e o eletrodo catódico distante da ACC. Registre a intensidade do campo com base nas duas orientações do campo da MEA.Em seguida, aplique as correntes elétricas utilizando um estimulador. Ajuste a distância entre os dois eletrodos de cloreto de prata para cerca de 1,5 a 2 cm e regule a intensidade da corrente do estimulador para manter a DCS entre 0,5 e 2 miliampères. Neste procedimento, posicione um eletrodo de tungstênio no MT e aplique pulsos do estimulador à região tálamica da fatia.Em seguida, utilize diversas intensidades de corrente para determinar o limiar que provoca uma resposta no córtex cingulado anterior (ACC). Desloque o eletrodo de tungstênio ao longo da via tálamo-cingulada para obter o perfil de resposta ideal. Registre 1-20 respostas do ACC e use o software para automaticamente calcular a média de todas as respostas do ACC evocadas pela estimulação do MT.Para induzir atividade semelhante a convulsões, adicione 250 micromolar de 48P e 5 micromolar de bicuculina à solução de perfusão e continue a perfundir a fatia por duas a três horas. Mantenha a bomba em uma taxa de perfusão relativamente rápida, o que pode ajudar a prevenir a formação de um gradiente de pH. Em seguida, posicione o eletrodo de tungstênio no MT e aplique estimulação elétrica para obter um perfil de resposta do ACC.Registre 10 a 20 varreduras e faça a média das respostas. Em seguida, substitua a solução de pré-fusão por ACSF fresco para lavar os fármacos. Neste procedimento, garanta a geração de campos elétricos uniformes, fazendo passar correntes entre dois fios de prata revestidos com cloreto de prata colocados dentro da câmara MEA.Se não houver problemas, o DCS deve permanecer entre 0,5 e 2 miliampères. Em seguida, desligue o DCS e estimule o tálamo com um eletrodo de tungstênio. Para obter respostas sinápticas máximas no CCA, registre 10 a 20 respostas e depois faça a média delas.Em seguida, ligue o DCS e estimule o tálamo simultaneamente. Avalie as alterações na amplitude da resposta do córtex cingulado anterior (ACC) evocada pela estimulação talâmica durante o DCS. Agora, desligue o DCS, adicione 250 micromolar de 48P e 5 micromolar de bicuculina à solução de perfusão e aguarde 2 a 3 horas.Se as drogas afetarem o corte cerebral, o corte deverá produzir respostas de convulsão cortical. Em seguida, colete 10 a 20 respostas corticais do giro do cíngulo anterior e meça a amplitude e a duração das respostas de convulsão cortical evocadas eletricamente. Depois, ligue a DCS e estimule o tálamo simultaneamente.Avalie as alterações na amplitude e duração das respostas corticais evocadas de crises epilépticas durante a aplicação de DCS. Em seguida, substitua a solução de perfusão por ACSF fresco para lavar os fármacos. Esta figura mostra diferentes respostas evocadas, que incluem as respostas evocadas pela estimulação talâmica no ACC, atividade semelhante a crises induzida por fármacos e a atividade semelhante a crises induzida tanto pela estimulação talâmica quanto por fármacos.Esta figura mostra o efeito de diferentes orientações na DCS, como diferentes orientações no campo elétrico, respostas evocadas pela estimulação talâmica com DCS e o efeito da DCS catódica na atividade semelhante a convulsão. Nesta figura, 15 minutos de DCS catódica demonstraram induzir efetivamente uma depressão de longa duração e reduzir as respostas evocadas. A duração da convulsão foi significativamente reduzida após 15 minutos de DCS catódica em comparação com a ausência de aplicação de DCS.mais rápido, isso tecnicamente pode ser feito em quatro horas se for realizado corretamente. Após este procedimento, outros procedimentos, como a estimulação magnética transcraniana, podem ser realizados, a fim de responder a questões adicionais, como oferecer abordagens não invasivas para o controle de crises resistentes. Após esse desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de terapia não invasiva explorarem tratamentos para crises em modelos animais.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar a estimulação elétrica para avaliar atividade semelhante a convulsões em fatias cerebrais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve um protocolo para implantar uma sonda de silício linear de várias hastes no cérebro do camundongo para medir os potenciais de campo local. O procedimento envolve prender a sonda a uma unidade estereotáxica, posicioná-la com precisão sobre a região alvo do cérebro, inseri-la no cérebro e prendê-la com cimento dentário. Após a implantação, o conjunto é protegido com um invólucro. Após a recuperação, a configuração permite registrar potenciais de campo locais, fornecendo...

Registrando a atividade elétrica cerebral em camundongos que se comportam usando sondas de silício linear de haste múltipla

Este protocolo envolve o uso de um conjunto de microeletrodos (MEA) para registrar a atividade elétrica em uma fatia do cérebro exposta a uma droga indutora de convulsões. O procedimento inclui posicionar a fatia do cérebro em uma câmara de gravação MEA, aplicar estimulação elétrica para induzir convulsões artificiais e analisar os sinais resultantes.

Monitoramento da atividade elétrica neural induzida por convulsões em fatias cerebrais usando matrizes de microeletrodos

Neste vídeo, são investigados os efeitos da estimulação transcraniana por corrente contínua (ETCC) em fatias cerebrais contendo o córtex cingulado anterior (ACC) e as regiões do tálamo, usando um arranjo de múltiplos eletrodos (MEA) para medir sinais elétricos. Ao fornecer pulsos elétricos e infundir drogas indutoras de convulsões, o estudo investiga a resposta do ACC às convulsões.

Monitorando o córtex cerebral com uma matriz de vários eletrodos em resposta a agentes indutores de convulsões

O vídeo demonstra um estudo para avaliar o impacto da estimulação por corrente contínua (DCS) em ataques epilépticos em fatias de cérebro de camundongos. As fatias cerebrais contendo as regiões conectadas do tálamo medial (MT) e do córtex cingulado anterior (ACC) são colocadas em uma matriz de multieletrodos (MEA). Estímulos elétricos para o MT e drogas indutoras de convulsões são aplicados para induzir crises epilépticas no ACC. O DCS é então aplicado para avaliar seu impacto nas convulsões...

Impacto da estimulação por corrente contínua em crises epilépticas evocadas em fatias de cérebro de camundongos

Este vídeo demonstra a indução de eventos ictais em fatias corticais coronais de um camundongo transgênico expressando canais catiônicos ativados por luz em neurônios piramidais excitatórios corticais. A fatia é colocada em uma câmara de registro e um eletrodo de registro é inserido na camada cortical superficial. Após a perfusão com uma droga indutora de convulsões que bloqueia os canais de potássio, os neurônios tornam-se hiperexcitáveis e geram eventos ictais espontâneos. Para gerar eventos...

Geração de eventos ictais espontâneos e sob demanda em fatias corticais de cérebro de camundongo

Nós aqui descrevem como realizar gravações de matriz multi-eletrodo de tecido cortical epiléptico humano. Ressecção do tecido epiléptico, preparação e fatia de matriz multi-eletrodo gravações de eventos interictais e ictais são demonstrados em detalhes.

Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.

Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos

Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

O protocolo apresentado descreve o transporte e a preparação de tecido hipocampal humano ressecado com o objetivo final de usar fatias cerebrais vitais como uma ferramenta de avaliação pré-clínico para potenciais substâncias antiepilépticas.

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de sistemas complementares de matriz de microeletrodos de alta densidade de semicondutores de óxido metálico (CMOS-HD-MEAs) para registrar a atividade semelhante a convulsões de fatias cerebrais ex vivo .

Atividade semelhante a convulsões de alta qualidade de fatias cerebrais agudas usando um sistema complementar de matriz de microeletrodos de alta densidade com semicondutor de óxido metálico

Aprenda a usar estimulação de corrente contínua catódica e matriz multieletrodo para avaliar atividades tipo convulsão em fatias de cérebro de camundongo. Este método permite analisar vias neurais específicas e efeitos terapêuticos in vitro.

A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação (Vídeo) | JoVE Journal

A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação

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