A estimulação de corrente contínua e Multi-eletrodo de gravação matriz de perda de consciência em Ratos Cérebro Slice Preparação

O objetivo geral deste procedimento experimental é acessar o arranjo de eletrodos na câmara de gravação para estimulação de corrente contínua de uma fatia de cérebro e seu efeito na atividade semelhante a uma convulsão registrada com um conjunto de vários eletrodos. Isso pode ajudar a responder a perguntas-chave na estimulação por corrente contínua, e uma matriz de vários eletrodos registrou atividade semelhante a uma convulsão na fatia do cérebro de camundongo. Uma vantagem dessa técnica é que os efeitos da estimulação por corrente contínua podem ser avaliados na via específica da fatia do cérebro do camundongo.

Demonstrando o procedimento estarão Hsiang Chin e Wei-Jen Chang, técnicos do meu laboratório. Neste procedimento, esterilize todos os instrumentos cirúrgicos com solução de etanol a 75% antes do experimento. Em seguida, exponha o crânio do animal e corte o músculo restante.

Em seguida, retire a superfície dorsal do crânio usando rongeurs e apare as laterais. Posteriormente, usando uma espátula, corte os bulbos olfatórios e as conexões nervosas ao longo da superfície ventral do cérebro antes de removê-lo. Transfira rapidamente o cérebro para um copo cheio de ACSF oxigenado e gelado.

Para preparar cortes contendo a via MT-ACC, faça um corte sagital, 2 mm lateral à linha média em cada hemisfério, para exibir a anatomia subcortical. Em seguida, faça um corte transversal angular paralelo ao trato de fibras visível no estriado. Faça o segundo corte transversal angular da conexão entre o cerebelo e o córtex visual, até o ponto médio entre a comissura anterior e o trato óptico, que são ventrais e paralelos à via cingulada do tálamo.

Depois disso, prenda o bloco cerebral a uma placa angular com um adesivo de cianoacrilato. Faça um corte logo acima do ponto de inflexão do caminho. Depois disso, desdobre a placa, alise-a e cole-a no estágio da câmara de um vibratome.

Posteriormente, corte as fatias do cérebro com 500 micrômetros de espessura e mantenha-as em ACSF oxigenado gelado. Transferir uma fatia para a câmara de registo a 32 graus Celsius com profusão contínua de ACSF oxigenado durante uma hora. Confirme a colocação de uma sonda MEA no sistema multicanal.

Use um tubo para guiar o ACSF para dentro da câmara MEA e o outro tubo para guiar o ACSF para fora da câmara. Perfundir continuamente a preparação com ACSF quente e oxigenado a 30 graus Celsius. Usando um cotonete úmido, transfira uma fatia de cérebro para o MEA.

Mova cuidadosamente a fatia do cérebro para orientar o ACC acima dos eletrodos e, em seguida, estabilize a fatia do cérebro com uma âncora de fatia para garantir uma boa conexão elétrica entre a fatia e os eletrodos. Em seguida, coloque o eletrodo do ânodo proximal ao ACC e o eletrodo catódico distal ao ACC. Registre a intensidade do campo pelas duas orientações de campo do MEA.

Em seguida, forneça as correntes elétricas usando um estimulador. Ajuste a distância entre os dois eletrodos de cloreto de prata para cerca de 1.5 a 2 cm e ajuste a força da corrente do estimulador para tornar o DCS entre 0.5 e 2 miliamperes. Neste procedimento, coloque um eletrodo de tungstênio em MT e forneça pulsos do estimulador para a região talâmica da fatia.

Em seguida, use várias intensidades de corrente para determinar o limite que provoca uma resposta ACC. Mova o eletrodo de tungstênio ao longo da via cingulada do tálamo para obter o perfil de resposta ideal. Registre de 1 a 20 respostas ACC e use o software para calcular automaticamente a média de todas as respostas ACC evocadas pela minha estimulação MT.

Para induzir atividade semelhante a uma convulsão, adicione 250 micromolares 48P e 5 micromolares bicuculina à solução de perfusão e continue a profundir o corte por duas a três horas. Mantenha a bomba a uma taxa de perfusão relativamente rápida, o que pode ajudar a evitar o acúmulo de um gradiente de pH. Em seguida, coloque o eletrodo de tungstênio no MT e forneça estimulação elétrica para obter um perfil de resposta ACC.

Registre de 10 a 20 varreduras e calcule a média das respostas. Depois, substitua a solução de pré-fusão por ACSF fresco para lavar os medicamentos. Neste procedimento, assegure a geração de campos elétricos uniformes, passando correntes entre dois fios de prata revestidos de cloreto de prata paralelos que são colocados dentro da câmara MEA.

Se não houver problemas, o DCS deve ficar entre 0,5 e 2 miliamperes. Em seguida, desligue o DCS e estimule o tálamo com um eletrodo de tungstênio. Para obter respostas sinápticas máximas no ACC, registre de 10 a 20 respostas e, em seguida, calcule-as a média.

Em seguida, ligue o DCS e estimule o tálamo simultaneamente. Avaliar as mudanças de amplitude da resposta evocada do ACC da estimulação talâmica durante a DCS. Agora, desligue o DCS, adicione 250 micromolares 48P e 5 micromolares bicuculinos à solução de perfusão e aguarde 2-3 horas.

Se as drogas afetarem a fatia do cérebro, a fatia deve produzir respostas de convulsão cortical. Posteriormente, colete 10-20 respostas corticais cinguladas anteriores e meça a amplitude e a duração das respostas de convulsão cortical evocadas eletricamente. Ninho, ligue o DCS e estimule o tálamo simultaneamente.

Avalie as mudanças na amplitude e duração das respostas de convulsão cortical evocadas durante a aplicação do DCS. Depois disso, substitua a solução de perfusão por ACSF fresco para lavar os medicamentos. Esta figura mostra diferentes respostas evocadas, que incluem as respostas evocadas de estimulação talâmica no ACC, atividade semelhante a convulsão induzida por drogas e atividade semelhante a convulsão induzida por drogas e estimulação talâmica e atividade semelhante a convulsão induzida por drogas.

Esta figura mostra o efeito de diferentes orientações na DD, como diferentes orientações no campo elétrico, respostas evocadas por estimulação talâmica com DCS e o efeito da DCS catódica na atividade semelhante a convulsões. E nesta figura, 15 minutos de DCS catódica são mostrados que induziram efetivamente depressão de longo prazo e respostas evocadas deprimidas. A duração da convulsão foi significativamente reduzida após 15 minutos de DCS catódica em comparação com nenhuma aplicação de DCS.

mais rápido, isso tecnicamente pode ser feito em quatro horas se for executado corretamente. Após este procedimento, outros assuntos como a estimulação magnética transcraniana podem ser realizados, a fim de responder a perguntas adicionais, como fornecer abordagens não invasivas para controlar as crises de resistência. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da terapia não invasiva explorarem tratamentos de convulsões em modelo animal.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar a estimulação atual para avaliar a atividade semelhante a uma convulsão em fatias cerebrais.