Name: Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda a fabricar um dispositivo microfluídico gerador de gradientes para biologia celular usando técnicas de microfabricação com PDMS e plasma de oxigênio. Este método permite estudar migração celular direcionada em ambientes controlados.

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A. Microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos <ol><li> O wafer Si é tratada com plasma de oxigênio reativo (5 min de 30W, Harrick Científico, NY). </li><li> Fotorresiste negativo (SU-8 50, Microchem, MA) é spin-revestido a 1000 rpm por 1 min em um wafer de silício. </li><li> O wafer é mole cozido a 65 ° C por 10 min e, posteriormente, a 95 ° C por 30 min em uma placa. </li><li> O wafer é exposto à luz UV (200W) por 3 minutos através de uma máscara de transparência com uma dimensão mínima de 30 mm. </li><li> O wafer é pós cozido a 65 ° C por 1 min e em 95 ° C por 10 min. </li><li> Si molde mestre com 100 canais mm de espessura é desenvolvido usando SU-8 desenvolvedor fotorresiste. </li><li> O wafer contendo microcanais é colocado em um prato de Petri. </li><li> Moldes de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard 184) são fabricados pela mistura de elastômero de silicone e um agente de cura (10:1). </li><li> A mistura PDMS é derramado no molde mestre Si. </li><li> O molde mestre Si é colocada em um dessecador de vácuo para remover as bolhas por 10 min. </li><li> PDMS é curado a 70 ° C por 1 ~ 2 horas. </li><li> Moldes PDMS são descascadas do molde mestre Si. </li></ol> B. configuração Experimental <ol><li> Entrada de celulares, de saída, e infundindo entradas do dispositivo PDMS baseado microfluídicos são perfurados utilizando perfuradores afiados. </li><li> Um dispositivo e uma lâmina de vidro (2 × 3 polegadas) estão irreversivelmente ligados pelo plasma reativas de oxigênio (5 min de 30W, Harrick Científico, NY). </li><li> Tubos de polietileno (PE 20, Becton Dickinon, MD) é inserido na infundindo entradas do dispositivo micro e posteriormente ligado a uma bomba de seringa. </li><li> Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextran (MW = 10kD, 10 mM, Sigma) e buffer (PBS, Invitrogen, CA) são infundidas no dispositivo microfluídicos para confirmar gradientes estáveis ​​dentro do dispositivo fluídico. </li><li> Matriz extracelular (ECM) (ie, fibronectina) é revestido no interior do dispositivo micro por 1 hora em incubadora (37 ° C). </li><li> Células de fibroblastos NIH 3T3 são tripsinizados e dissociado. </li><li> Células dissociadas são carregados para o dispositivo micro (800 m de largura) na densidade de células de 2 × 10 6 células / ml. </li><li> 2 media ml e 50 ng / ml do fator de crescimento epidérmico (EGF) é infundida em um dispositivo micro para gerar gradientes solúveis utilizando uma bomba de seringa (0,05 mL / min). </li><li> Células são monitorados em tempo real a cada 5 minutos usando um microscópio invertido (Nikon TE 2000). </li></ol>

<ol><li>Jeon, N. L., Baskaran, H., Dertinger, S. K. W., Whitesides, G. M., Van de Water, L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotechnol. 20, 826-830 (2002).</li>
<li>Lin, F., Nguyen, C. M., Wang, S. J., Saadi, W., Gross, S. P., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+neutrophil+chemotaxis+is+strongly+influenced+by+mean+IL-8+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Effective neutrophil chemotaxis is strongly influenced by mean IL-8 concentration.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 576-581 (2004).</li>
<li>Chung, B. G., Flanagan, L. A., Rhee, S. W., Schwartz, P. H., Lee, A. P., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neural+stem+cell+growth+and+differentiation+in+a+gradient-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device.</a> Lab Chip. 5, 401-406 (2005).</li>
<li>Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+parallel-gradient+microfluidic+chamber+for+quantitative+analysis+of+breast+cancer+cell+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis.</a> Biomed. Microdevices. 8, 109-118 (2007).</li>
<li>Chung, B. G., Park, J. W., Hu, J. S., Huang, C., Monuki, E. S., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+microfluidic-vacuum+device+for+interfacing+with+conventional+cell+culture+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A hybrid microfluidic-vacuum device for interfacing with conventional cell culture platform.</a> BMC Biotechnol. 7, (2007).</li>
</ol>

Células expostas a gradientes de concentração estável de EGF em um dispositivo micro migraram para concentrações mais elevadas. A orientação direcional de migração celular, índice quimiotático, motilidade das células migrando foram investigadas pela análise de células de rastreamento. Portanto, esta plataforma de geração de gradiente microfluídicos poderia ser útil para estudar metástase de câncer, a embriogênese, e orientação axônio.

<table><tbody><tr><td>Dextran-FITC</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td>Dextrana conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (10 kD)</td></tr><tr><td>hr-EGF</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13247-051</td><td>Fator de crescimento epidérmico recombinante humano</td></tr><tr><td>PDMS</td><td></td><td>K.R. Anderson Co.</td><td>2065622</td><td>Polímero de (dimetilsiloxano) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8,6 lb)</td></tr><tr><td>Fotolito negativo</td><td></td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 50</td><td></td></tr><tr><td>Wafer de silício</td><td></td><td></td><td></td><td>Wafer de silício, 4 polegadas</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>PE 20</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH 3T3</td><td>linha celular</td><td></td><td></td><td>células fibroblásticas</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>TE 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

um dispositivo de geração de gradient microfluídicos de biologia celular

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

A fabricação e operação de um dispositivo de geração de gradiente microfluídicos para estudar o comportamento celular é descrito. Uma plataforma microfluídica é uma ferramenta que permite experimental, precisamente porque pode manipular fluxos de líquidos, permitem alto rendimento experiências, e gerar gradientes de concentração estável solúvel. Comparado com os geradores gradiente convencional, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) com base em dispositivos microfluídicos pode gerar gradientes de concentração de fatores de crescimento estável, com perfis bem definidos. Aqui, nós desenvolvemos simples gradiente de geração de dispositivos microfluídicos com três entradas distintas. Três microcanais combinados em um microcanal de gerar gradientes de concentração. A estabilidade ea forma de gradientes de fator de crescimento foram confirmados por fluoresceína isothyiocyanate (FITC)-dextran com peso molecular semelhante ao fator de crescimento epidérmico (EGF). Usando este dispositivo micro, foi demonstrado que fibroblastos expostos a gradientes de concentração de EGF migraram para concentrações mais elevadas. A orientação direcional de migração celular e motilidade das células migrando foram quantitativamente avaliados por análise de células de rastreamento. Assim, este dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser útil para estudar e analisar o comportamento das células migratórias.

Nós descrevemos um protocolo para a microfabricação do dispositivo de geração de gradiente microfluídicos que pode gerar gradientes espaciais e temporais bem definidos em microambiente. Nesta abordagem, o dispositivo de geração de gradiente microfluídicos pode ser usado para estudar a migração celular dirigido, a embriogênese, cicatrização de feridas, e metástase de câncer.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

A fabricação e a operação de um dispositivo microfluídico gerador de gradiente para o estudo do comportamento celular são descritas. Uma plataforma microfluídica é um...

Meu nome é Jiang. Sou pesquisador pós-doutorando em Harvard e no MIT Health, Ciência e Tecnologia. E meu nome é Amir Manchi e sou aluno de graduação no laboratório do professor ha SANE, em Harvard, MIT, divisão de Ciências da Saúde e Tecnologia.Este slide mostra o processo esquemático de como fabricar o dispositivo: primeiro, aplica-se 50 SUA de revestimento por centrifugação sobre o vapor de silicone e, em seguida, coloca-se uma máscara adicional sobre o vapor de silicone. Após isso, realiza-se a exposição UV e o desenvolvimento. Finalmente, é possível obter e colocar esses contatos sobre o vapor de silicone. Depois disso, pode-se simplesmente moldar o PDMS, seguido de rastejamento e aquecimento, e fazer um pequeno furo. Em seguida, pode-se unir o dispositivo de PDMS ao vidro de quartzo utilizando plasma de oxigênio.Ok, estamos agora na sala de microfabricação dentro do laboratório e vamos começar produzindo algumas camadas de PDMS. Quando me refiro a PDMS, o termo científico real é polidimetilsiloxano, e é um polímero orgânico. É o polímero orgânico à base de silício mais amplamente utilizado.Na verdade, é uma mistura de duas coisas diferentes: uma base de elastômero de silicone

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Biologia

Nós descrevemos um protocolo para a fabricação de dispositivos microfluídicos que pode permitir a captura de células e cultura. Nesta abordagem padronizada microestruturas, tais como sulcos dentro de canais microfluídicos são usados ​​para criar regiões de cisalhamento de baixa tensão dentro do qual célula pode encaixar.

Um dispositivo micro com padrões Groove para estudar o comportamento celular

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Apresenta-se um método simples para a produção de dispositivos microfluídicos capazes de aplicar semelhantes condições dinâmicas de múltiplas linhagens distintas, sem a necessidade de uma sala de limpeza ou de litografia suave.

Um dispositivo micro para o Estudo múltiplas linhagens distintas

Um método para a montagem de gradientes de adesivo e solúvel em uma câmara de microscopia para estudos de migração de células vivas é descrito. O ambiente artificial combina superfícies antivegetativas e faixas adesivas com gradientes de solução e, portanto, permite que se determine a importância relativa das pistas de orientação.

Criando Gradientes adesivas e solúvel para a migração celular Imaging com Microscopia de Fluorescência

Este artigo apresenta uma abordagem simples para fornecer não-contínuo gradientes cepas estáticas em um hidrogel de célula-carregado concêntrico para regular o alinhamento da célula para a engenharia de tecidos.

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

O controle de gradientes químicos e de oxigênio é essencial para culturas de células. Este artigo relata um dispositivo microfluídico de polidimetilsiloxano-policarbonato (PDMS-PC) capaz de gerar de forma confiável combinações de gradientes químicos e de oxigênio para estudos de migração celular, que podem ser praticamente utilizados em laboratórios biológicos sem instrumentação sofisticada.

Polidimetilsiloxano-policarbonato microfluídicos para celular Estudos Migratórios Sob Perpendicular Chemical e gradientes de oxigênio

Nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta, a tecnologia do "acelerador evolução", que fornece uma plataforma controlável para estudos quantitativos em tempo real a longo prazo da dinâmica do cancro dentro das condições ambientais bem definidas no único-Cell Nível. Espera-se que esta tecnologia funcione como um modelo in vitro para pesquisa fundamental ou desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.

Geração de gradientes heterogêneos de drogas em populações de câncer em um acelerador de evolução Microfluídico para observação em tempo real

Migração de células coletivas em desenvolvimento, cicatrização de feridas e metástase oncológica é muitas vezes guiada pelos gradientes de fatores de crescimento ou moléculas de sinalização. Descrito aqui é um sistema experimental que combina microscopia de tração com um sistema microfluídico e uma demonstração de como quantificar a mecânica da migração coletiva gradiente bioquímico.

Microscopia de tração integrada com Microfluidics para migração coletiva Chemotactic

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Desenvolvimento de uma abordagem baseada em microfluídica para investigar a mecânica de polímeros de microtúbulos

Aprenda a fabricar um dispositivo microfluídico gerador de gradientes para biologia celular usando técnicas de microfabricação com PDMS e plasma de oxigênio. Este método permite estudar migração celular direcionada em ambientes controlados.

Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

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