A autorradiografia do receptor Protocolo para a visualização localizada da angiotensina II Receptores

O objetivo geral deste procedimento é localizar e quantificar anatomicamente a expressão do receptor de angiotensina II em seções cerebrais utilizando autorradiografia de receptor e a identificação histológica de estruturas cerebrais. Este método identifica as regiões do cérebro onde a angiotensina II afeta o comportamento, a função cognitiva e o sistema cardiovascular, fornecendo informações para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de doenças neurodegenerativas e cardiovasculares. As principais vantagens dessa técnica são que ela é quantitativa, qualitativa e permite a identificação de receptores funcionais para a angiotensina II com maior especificidade do que outros métodos.

Este método também pode caracterizar a funcionalidade de outros sistemas receptores hormonais em todo o corpo, como receptores relacionados a drogas de abuso. Imediatamente após a colheita, coloque os tecidos cerebrais em moldes cerebrais que simulam o interior do crânio e embrulhe os moldes em papel alumínio para armazenamento de menos 20 graus Celsius. Após 30 minutos, transfira os lenços para um saco de armazenamento de freezer lacrado e armazene o saco a 80 graus Celsius negativos.

Antes de seccionar, remova suavemente o cérebro do molde cerebral. Para seccionar o tecido cerebral, transfira a amostra de interesse para um criostato entre 10 e 18 graus Celsius negativos. Quando o tecido estiver equilibrado para a nova temperatura, use um meio à base de glicol e resina para incorporar verticalmente uma pequena porção da amostra em uma montagem de tecido para permitir a secção do plano coronal.

Carregue o tecido no micrótomo e aperte firmemente o suporte no lugar, depois comece a cortar o cérebro na espessura desejada e, em seguida, monte as seções nas lâminas do microscópio na orientação vertical para aplicar uma área de superfície maior do tecido à lâmina. Colete as seções em conjuntos sequenciais de cinco. Quando todas as seções tiverem sido coletadas, deixe as lâminas secarem ao ar por até uma hora.

Em seguida, coloque as amostras em uma caixa de plástico deslizante em um saco de freezer autovedante para armazenamento a menos 20 graus Celsius. Para rotular as amostras por rádio, remova a primeira e a segunda lâminas de cada conjunto de cinco e monte em alças de lâmina disponíveis comercialmente ou impressas em 3D. Os slides do traço um são para o grupo de tratamento não específico e os slides do traço dois são para o grupo de tratamento total.

Inverta as lâminas em 35 a 40 mililitros de AM5 à temperatura ambiente mais seus respectivos inibidores nos frascos Coplin de pré-incubação apropriados. A execução de vários conjuntos de slides pode ser esmagadora. Portanto, é extremamente crítico colocar as lâminas nos frascos de pré-incubação em intervalos de quatro minutos para garantir que não haja sobreposição durante a etapa de secagem.

Após 30 minutos, transfira as lâminas para malas diretas de incubação contendo 10 mililitros de AM5 suplementado com a concentração apropriada de I125 SI Angiotensina II e os respectivos inibidores do grupo de tratamento por 60 a 90 minutos em temperatura ambiente. Determinar a concentração exata de 125I SI Ang II é fundamental para permitir que os receptores de angiotensina II sejam comparados de um dia para o outro. No final da incubação, retorne as lâminas para as alças da lâmina, bloqueie as lâminas e gire-as suavemente por um a dois segundos em dois recipientes separados de 400 mililitros de água destilada.

Após a segunda lavagem com água, enxágue as lâminas com quatro lavagens sequenciais de um minuto em 30 a 40 mililitros de AM5. Após a quarta lavagem, agite suavemente as seções por um a dois segundos em quatro trocas de água destilada gelada. Em seguida, use quatro secadores de cabelo em ângulos diferentes para secar as lâminas com ar frio por quatro minutos.

Quando todas as seções estiverem secas, transfira as lâminas para uma toalha de papel. Em seguida, use fita dupla face para montar as lâminas, com o tecido voltado para cima, em um pedaço de papelão para filme de raios-X na posição e incluindo pelo menos uma lâmina padrão de calibração de iodo 125 por grupo. Para expor as seções do filme, em uma sala escura, coloque as lâminas de papelão dentro de uma fita de raio-X e apague as luzes.

Acenda a luz de segurança e abra cuidadosamente uma caixa de filme de raio-X. Coloque um filme, com o lado brilhante para cima com a borda irregular no canto inferior direito em cima dos slides no. Em seguida, feche cuidadosamente o com as barras de travamento torcidas para vedar a luz e armazene o a menos 20 graus Celsius.

Após o período de exposição adequado, transferir a película para a solução reveladora durante dois minutos, seguidos de 30 segundos em banho de paragem, água bidestilada com ácido acético e, em seguida, cinco minutos em solução de fixação. Lave o filme em uma bandeja com água corrente por 20 minutos. Transfira-o para um surfectante por aproximadamente 10 segundos e pendure o filme para secar.

Para análise histológica das seções do tecido cerebral, descongele o traço três seções em um rack de slides. Em seguida, lave as seções em água desionizada por um minuto, seguido de uma incubação de 10 minutos em solução de coloração de tionina e três mergulhos em um recipiente de água desionizada. Mergulhe as lâminas para uma lavagem adicional com água desionizada de 30 segundos.

Em seguida, lave as lâminas em lavagens sequenciais com etanol, conforme indicado. Após a última lavagem com etanol a 100%, lave as lâminas em dois recipientes de xileno por três e cinco minutos consecutivos. No final da segunda lavagem com xileno, cubra a borda superior de uma lâmina de cada vez com uma base de resina, meio de montagem de solvente inorgânico.

Monte lamínulas de cobertura de 24 por 60 milímetros nas lâminas e deixe-as secar por 48 horas. Em seguida, digitalize os slides e filme no computador em escala de cinza de 2400 DPI. Para analisar o filme por densitometria, após a varredura, delinear empiricamente as áreas de interesse em cada filme.

Esta é a imagem pseudocolorida gerada após a abertura do filme digitalizado no programa de análise de imagem. Inclua a densidade, a área de varredura e a área alvo total nas medições. Ajuste as barras da área de varredura para garantir que cada região de interesse esteja entre os parâmetros do realce.

Em seguida, exporte os dados para uma planilha para determinar a associação específica presente para cada amostra. As unidades padrão de calibração para quantificação são determinadas com base na data em que o ensaio foi realizado. Após a digitalização dos filmes, os valores de calibração são usados para gerar uma curva baseada nas concentrações variáveis de padrões de iodo 125 para esse filme específico.

A calibração e os valores padrão são registrados em triplicado para precisão. As distinções entre a ligação não específica e os grupos totais, bem como os rótulos de tecidos, são estabelecidas atribuindo cada conjunto de dados aos subgrupos apropriados. Um valor limite mais alto deve ser definido ajustando os parâmetros de vermelho para preto, enquanto o valor limite mais baixo deve ser definido próximo a zero para permitir uma medição mais precisa de toda a área de interesse digitalizada.

Por exemplo, aqui as áreas finais medidas do núcleo paraventricular do hipotálamo nos grupos de ligação total versus não específicos são comparadas a uma seção corada com tionina para confirmação anatômica. A ligação não específica é a quantidade de radioligante ligado a receptores não angiotensina na presença de uma concentração saturada de ligante do receptor de angiotensina I não radioativo, enquanto a ligação total é a quantidade de radioligante ligado na ausência de ligante não radioativo do receptor de angiotensina I. Os valores de ligação não específicos podem então ser subtraídos dos valores de ligação totais para obter os valores de ligação específicos para os receptores de angiotensina I.

Uma vez dominada, a etapa de autorradiografia do receptor pode ser concluída em cerca de quatro horas, enquanto a etapa de revelação do filme leva cerca de 30 minutos por filme. Ao realizar este procedimento, é importante controlar o tempo para garantir que todas as lâminas sejam incubadas, enxaguadas e secas exatamente pela mesma duração. Após este procedimento, estudos adicionais da morfologia cerebral podem ser realizados para avaliar as mudanças no tamanho das regiões que exibem a expressão do receptor de angiotensina II.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam a farmacologia do receptor determinar como diferentes regiões do cérebro são afetadas por vários neuro-hormônios, neurotransmissores e drogas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar com sucesso um ensaio de autorradiografia de receptor, lâminas coradas histologicamente e avaliar autorradiogramas para localizar receptores em regiões cerebrais específicas. Lembre-se de que trabalhar com radioatividade pode ser perigoso e precauções como blindagem, contenção, monitoramento de exposição e descarte adequados devem sempre ser tomadas para evitar contaminação radioativa.