Name: A autorradiografia do receptor Protocolo para a visualização localizada da angiotensina II Receptores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprenda a localizar e quantificar receptores de angiotensina II no cérebro de ratos usando autoradiografia de receptores. Este método fornece dados quantitativos e qualitativos sobre a distribuição desses receptores em regiões cerebrais específicas.

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Este trabalho foi apoiado por NIH Grant HL-113905

Todos os procedimentos com animais realizados para este estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Nova Southeastern University de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, 8 th Edition (The National Academies Press, Washington, DC, 2011 ). 1. Preparar as secções de tecido para o receptor A autorradiografia <ol><li> No momento do sacrifício, colheita frescos tecidos cerebrais, e embrulhe em papel alumínio e coloque em um freezer -20 ° C o mais rapidamente possível. Para manter a forma correta, coloque cérebros em um molde cérebro que simula o interior do crânio, embrulhe em papel alumínio e coloque em um - 20 ° C congelador. Após 30 min, os tecidos lugar em um saco de armazenamento vedável congelador e mover-se para um congelador de -80 ° C para armazenamento a longo prazo. <ol><li> Obter os amostra fresca de tecido congelado de interesse a partir do descongelamento -80 ° C congelador, e transferir para um criostato definido para um mínimo de -10 ° C e um máximo de -18 ° C, a fim de evitar. </li&gt; <li> Coloque a amostra sobre o tecido de montagem com um glicol e meio de incorporação à base de resina, apenas a incorporação de uma pequena parte da amostra para o meio. Para cérebro, o cérebro é montado verticalmente para permitir que o corte no plano coronal. </li></ol></li><li> Coloque montar o tecido para o micrótomo dentro do criostato e aperte firmemente no lugar. Assegurar o lado esquerdo e direito do cérebro estão nas mesmas coordenadas ântero-póstero, e que o eixo dorso-ventral do cérebro é atlas perpendicular ao vulgarmente utilizados. </li><li> Iniciar o corte com a espessura desejada (20 uM recomendado) e descongelar montar as secções em lâminas de microscópio numa direcção vertical para ter uma área de superfície maior de espaço na corrediça. Recolha secções em lâminas em conjuntos sequenciais de cinco anos, ou seja, o primeiro conjunto de slides são rotulados 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, e 1-5 (Figura 3). </li><li> Depois de preencher um conjunto de slides com seções, deixar as lâminas secar ao ar durante até 1 hora, em seguida, coloque o SLIdes em uma caixa plástica de slides em um saco de armazenamento congelador auto-selante, e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Receptor autorradiografia CUIDADO: Radioactividade. Use roupas de proteção para lidar com radioatividade. Eliminação é dependia estabelecimento, e deve seguir as orientações para se decompor adequadamente (meia-vida de 60 dias) ou ser pego por uma empresa certificada. <ol><li> Retire o &quot;-1&quot; e &quot;-2&quot; slides de juros a partir do freezer -20 ° C e montar em suportes de slide (Figura 5). Monte os &quot;-1&quot; slides juntos para o tratamento &quot;não específica&quot;, e os &quot;-2&quot; desliza para o tratamento &#39;total&#39;. Frascos &#39;não-específicas &quot;irá conter 10 uM concentrações finais de PD123319 um antagonista 2 R, e do losartan um AT um antagonista de R, em tampão de meio de ensaio (AM5) (Tabela 1), o&quot; total &quot;frascos de ligação irá conter apenas 10 ? M PD123319 em AM5. </li><li> Inverta a corrediçaapertos para colocar as lâminas em frascos Coplin pré-incubação enchidos com 35-40 ml de AM5, e respectivos inibidores durante 30 min à temperatura ambiente. Comece séries subsequentes em seu banho de pré-incubação em intervalos de 4 min. </li><li> Imediatamente transferir lâminas a partir da solução de incubação pré aos utentes incubação de deslizamento, contendo 10 ml de AM5, além de uma concentração pré-determinada de 125I-SI-Ang II (calculada na Figura 4) com os respectivos inibidores, para 60-90 min a sala temperatura. Se houver radioactivo suficiente, 10 lâminas podem ser colocados (back to back) em suportes de slide modificados e incubadas com 125 I-SI-Ang II em frascos Coplin. </li><li> Colocar as lâminas de volta para os suportes de slide (se necessário), mancha, e lavar por agitação suave para 1-2 seg em 400 ml de água destilada em dois recipientes separados. </li><li> Transferir as lâminas sequencialmente em quatro frascos Coplin contendo 35-40 ml de AM5 durante exactamente 1 min cada (como ilustrado na Figura 4 &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Após a última lavagem 1 min, agitar suavemente as seções de 1-2 segundos em quatro mudanças de gelo frio água destilada. </li><li> Seque as lâminas com ar frio (Atenção: o ar quente volatiliza o composto radioactivo) usando quatro secadores de cabelo criados a partir de ângulos diferentes para 4 min (Figura 5), até que todas as seções estão secos, em seguida, coloque sobre uma toalha de papel. </li><li> Mount desliza com os tecidos para cima em um papelão para aposição ao filme de raios-X usando fita dupla face. </li><li> Montar pelo menos um, 125 calibração corrediça iodo padrão para cada cartão (Figura 6). Nota: Os padrões de calibração consiste de pasta de cérebro completamente misturado com 125 Iodo ligado a um composto contendo um anel de fenol, compactado por centrifugação numa seringa de 1 ml de tuberculina, que são criostato segmentado com a mesma espessura como as secções do cérebro e descongelar-montada em microscópio slides. Alternativamente, 125 padrões de calibração em Iresina plástica seccionados a 20 uM de espessura podem ser obtidas comercialmente. A resina plástica nestas normas protege parcialmente o filme da radiação tal que uma equivalência de tecido de ~ 40% devem ser tidos em conta na calibração. </li></ol> 3. Exposição e Desenvolvimento Film <ol><li> Proceder a uma câmara escura com uma cassete de raios-X strap-costas e filmes auto-radiografia. Abrir a cassete e colocar o cartão com corrediças no interior (Figura 6). <ol><li> Desligue as luzes e ligue a luz de segurança. Cuidadosamente abra a caixa de filme de Raios-X, remova um filme, e coloque o lado da película brilhante para cima (com a borda irregular no canto inferior direito) sobre os slides da cassete. Feche cuidadosamente a cassete, e torcer as barras de travamento para selar a luz (Figura 6). Expor as lâminas para vários dias a várias semanas a -20 ° C. </li></ol></li><li> Na câmara escura, abra a gaveta e prossiga com a proc revelação de filmesess. <ol><li> Colocar as lâminas nas bandejas consecutivamente; programador durante 2 min, água contendo 5% de ácido acético glacial durante 30 seg, e fixador durante 5 min. As películas são colocadas no dentro de um tabuleiro com água corrente durante 20 minutos, em seguida, colocados em Photoflo para não mais do que 10 segundos e penduradas. Nota: O tempo de exposição é determinada empiricamente e pode envolver vários filmes com diferentes tempos de exposição: o tempo suficiente para obter sinais mensuráveis ​​de áreas com baixa ligação, mas não tão longo como a saturar o filme de áreas com alta de ligação. Uma vez que as exposições aceitáveis ​​são obtidos, em seguida, avance para a próxima etapa. </li></ol></li></ol> 4. Histologia <ol><li> Preparar a mancha tionina e reagentes de coloração (Tabela 2, Figura 7). <ol><li> Colocar as lâminas &quot;-3&quot; no porta-lâminas, e transferência de forma sequencial começando com água desionizada durante 1 min, em seguida, tionina solução corante durante 10 min seguido de três mergulha deionáguas ized, e uma lavagem de 30 segundos em água deionizada. </li><li> Após a água, coloque o porta-lâminas para lavagens de etanol como segue; 50%, 70% e 90% durante 30 segundos, seguido por duas lavagens de etanol a 100% durante 1 min cada. Por último, coloque o porta-lâminas em xileno por 3 min, em seguida, transferir para uma segunda solução xileno durante 5 min. </li></ol></li><li> Remover uma lâmina de cada vez a partir do último banho de xileno, e cobrir a borda superior da lâmina com uma base de resina em meio de montagem solvente orgânico, e colocar uma lamela de 24 milímetros x 60 milímetros sobre a lâmina. Deixar as lâminas suficientemente seca para ~ 48 horas e, em seguida, digitalizar para o computador a 2.400 dpi em tons de cinza. </li></ol> 5. densitomï¿½rica Análise de Imagem <ol><li> Coloque o lado do filme brilhante para baixo, com a borda irregular no canto inferior esquerdo e digitalizar usando um scanner proprietária capaz de transmitir a informação densidade do filme, sem qualquer distorção no computador sistema de imagem. </li><li> Abra as sys imagem proprietáriasTEM e utilizam as barras de calibração para estabelecer padrões de calibração para a futura análise densitométrica das imagens sobre o filme (Figuras 9 - 12). </li><li> áreas medida de interesse por qualquer estabelecimento de um modelo ou empiricamente, indicando as áreas de interesse. Os dados são recolhidas e separadas baseado no filme, controlo ou de tipo selvagem (seção), e região. Certifique-se incluir densidade (fmol / g), área de digitalização, e uma área de meta total nas medições (Figura 9). <ol><li> Ajuste bares área de digitalização, assegurando que a região de interesse cai entre parâmetros de destacar (Figura 10). </li><li> Exportar dados em uma planilha (Tabela 4). Multiplicar as vezes de densidade da área alvo total, então dividir pela área de leitura, a fim de obter o valor para a ligação do que a área específica. Uma vez que isto é feito para todos os valores medidos, o substrato não-específica estabelecida total e produzir o p de ligação específicaressentir-se. Médias também pode ser realizada por estes valores. </li></ol></li></ol>

Robert Speth licenciou anticorpos para receptores de angiotensina II para um fornecedor comercial e recebe royalties pela venda desses anticorpos. Os outros autores não têm nada a divulgar.

O protocolo descrito identifica a visualização de &quot;total&quot; e &quot;não específica&quot; de ligação do radioligando em secções adjacentes de secções coronais de cérebro de roedor anteriormente colhido e armazenado a -80 ° C, e pode ser facilmente aplicável a virtualmente todos os tecidos que tem anatomicamente resolvido subestruturas que mostram quantidades diferenciais de receptores ou locais de ligação de radioligandos. Os procedimentos descritos no âmbito do protocolo são simples e a análise é fundamental par...

A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte e incapacidade nos Estados Unidos, causando mais de 30% das mortes em os EUA em 2011 1. As estatísticas mais recentes da American Heart Association indicam que mais de uma em cada três pessoas tem uma ou mais tipos de doenças cardiovasculares. pesquisa cardiovascular continua a fazer progressos contra a compreensão desta doença, mas como as gerações começam a envelhecer, é imperativo para continuar esses esforços. O sistema renina-angiotensina (RAS) desempenha um papel central na regulação do sistema cardiovascular, principalmente através da promoção da aterosclerose, a inflamação, a vasoconstrição sistémica, e a activação do sistema nervoso simpático (Figura 1) 2-8. O RAS é um sistema hormonal que é activada quando as células justaglomerulares do rim secretam renina na corrente sanguínea em resposta à diminuição da pressão sanguínea, aumento sympatestimulação hetic, ou diminuição do fluxo de sódio pela mácula densa. A renina metaboliza o angiotensinogénio (sintetizado no fígado) para formar a angiotensina I (Ang I). Ang I é então metabolizado pela enzima conversora de angiotensina (ACE), uma ectoenzima no lado luminal das células endoteliais vasculares, principalmente nos pulmões e rins, para formar angiotensina II (Ang II), o péptido de efector principal do RAS. Ang II é capaz de activar dois subtipos de receptores; o receptor de tipo 1 (AT1 R) e o receptor de tipo 2 (AT 2 R), tanto que regulam o sistema cardiovascular, manter a homeostase de fluidos e eletrólitos e agora são considerados para afetar a função cognitiva e doença neurodegenerativa processa 8,9. A RAS local, específica do cérebro é relatado para sintetizar de forma independente Ang II. No cérebro, o angiotensinogénio proteína precursora é sintetizado de astroglia 10 convertido a Ang I por uma enzima renina-3 como, possivelmente, a pro-renina ligado ao receptor de pro-renina11, e, subsequentemente, convertida em angiotensina II pela enzima conversora de angiotensina que é abundantemente expresso na superfície extracelular de neurónios no cérebro 12. Este intrabrain gerado Ang II é o agonista para o cérebro AT 1 e AT 2 receptores que são isoladas a partir de sangue-carregada de Ang II. Enquanto o NO desempenha um R um importante papel fisiológico, é melhor conhecida pelos seus efeitos patofisiológicos de todo o corpo, que afecta principalmente o sistema cardiovascular e nos rins (figura 2). Quando a Ang II liga-se a AT 1 R, que provoca vasoconstrição; aumento da resistência ao fluxo sanguíneo e aumentar a pressão sanguínea. Além disso, promove a síntese e secreção de aldosterona e vasopressina, levando ao aumento da retenção de sódio e água. Estes efeitos podem também induzir a lesão cerebral isquémica e deficiências cognitivas e está ligada à doença de Parkinson, doença de Alzheimer, e diabetes, bem como a ser recentemente identificado para afectar de aprendizagem e de memória 13-15. Há um ciclo de feedback no RAS em que a AT 1 R nas células justaglomerulares no rim inibe a secreção de renina. Curiosamente, o NO 2 R geralmente contra-regula a acção de pelo 1R, causando vasodilatação, o crescimento de neurites, a regeneração axonal, anti-proliferação e cerebroprotection entre muitos outros 16-20. O NO 2 R também foi identificado como um alvo para anti-hipertensão e, recentemente, drogas anti-câncer 21. Determinar a localização e densidade de receptores de Ang II no prazo de vários tecidos e como eles são influenciados por diversos tratamentos e estados de doença, utilizando auto-radiografia receptor densitometria quantitativa irá ajudar a descobrir o papel que o RAS desempenha nas doenças específicas. Autorradiografia do receptor foi usado há mais de 30 anos como um método eficaz para a indicação da presença de angiotensina II receptores e outros componentes do RAS no cérebro e outros tecidos do rato, murganho, cobaia, cão e ser humano sob uma variedade de condições experimentais 22-34. A importância de localizar receptores de Ang II no cérebro é que se pode aplicar neuroanatomy funcional para as acções de Ang II no cérebro, por exemplo, a presença de pelo um de R no núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) sugere uma função de Ang II no cérebro para estimular a vasopressina, a oxitocina ou libertação da hormona de libertação de corticotropina (CRH), ou a activação do sistema nervoso simpático. Assim, as drogas que bloqueiam a AT 1 R pode diminuir alguns destes efeitos PVN mediadas associados com relação à actividade das RAS cerebrais. Trabalhos em curso sugere que o uso de AT 1 antagonistas R pode diminuir Stress Disorder (PTSD) a libertação induzida pós-traumático de CRH e melhorar os sintomas de PTSD (ferir et al., Submetido para publicação). O PVN, subfornicialórgão (SFO), e na amígdala são conhecidas por regular a homeostase, o apetite / sede, sono, memória, reações emocionais, e são as áreas-alvo deste estudo demonstração. Estas regiões foram examinados através da recolha de secções coronais de cérebro em lâminas de microscópio, e o tratamento das secções com inibidores específicos, juntamente com um ligando radioactivo específico para receptores de Ang II. Neste estudo, todos os materiais e reagentes juntamente com os fornecedores sugeridas são listados, Iodo-125 foi utilizado para radiomarcar um antagonista de angiotensina II receptor, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), que foi depois purificado como o mono 125I -Si Ang II utilizando métodos de HPLC conforme descrito anteriormente 35. O uso desta elevada actividade específica de radioligando permite a visualização de áreas de baixa, moderada e alta densidade de receptor após a exposição das secções radiomarcado a um filme de raios-x. Ao calibrar o filme com os padrões de pasta cerebrais que contenham quantidades conhecidas de iodo-125, a quantidade específicaAng II de ligação ao receptor em uma área pode ser quantificada. Em estudos experimentais, o receptor de Ang II de ligação nos cérebros de sujeitos experimentais pode ser comparada com a no cérebro de indivíduos de controlo. Isto pode indicar se as acções de Ang II são alteradas em resposta a uma condição genética, anormalidade fenotípica, estado de doença ou de tratamento da droga. Este conhecimento pode, então, ser aplicada ao desenvolvimento de terapias para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da RAS. As técnicas alternativas que a identificação de sítios de ligação ao receptor, mas com uma resolução reduzida anatómica, são ensaios que utilizam preparações de membrana de tecidos derivadas de homogenatos de tecidos, as quais são incubadas com o radioligando ao longo de uma gama de concentrações a fim de avaliar a afinidade de ligação de radioligandos como a constante de dissociação (Kd de ligação ) e capacidade de ligação máxima (B max) do tecido de interesse. O protocolo aqui descrito pode ser dividido em 5 dos principais components: Preparando secções de tecido para o receptor autorradiografia; Receptor autorradiografia; Exposição de Cinema e Desenvolvimento; Histologia; Análise de Imagem e densitométrica.

<table><tbody><tr><td>Copos de Plástico de 500 ml</td><td>Fisher</td><td>02-591-30</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm Lamínulas</td><td>Fisher</td><td>22-050-25</td><td></td></tr><tr><td>Filme de Imagem de Autorradiografia 24 mm x 30 cm</td><td>Filme MR Carestream-Biomax</td><td>891-2560</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracina (de Bacillus licheniformis)Folha de</td> Papelão <td>Sigma</td><td>B-0125</td><td></td></tr><tr><td>8 x 11</td><td>Placa de Ilustração Crescente #201</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Coplin</td><td>Fisher Scientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>Secadores de cabelo comerciais</td> Tubos de cultura descartáveis <td>Conair</td><td>Modelo SD6X</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>14-961-26</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sal dissódico, di-hidratado)</td> <td>USB Corporation</td><td>15-699</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>16-100-210&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Substituto do Formulário para Fotógrafos Desenvolvedores D-19</td><td>Formulary, Inc.&nbsp;</td><td>01-0036</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Fisher</td><td>A38 SI-212</td><td></td></tr><tr><td>Histoprep/OCT</td><td>Fisher</td><td>SH75-125D</td><td></td></tr><tr><td>Fixador de Filme</td><td>Kodak</td><td>5160320</td><td></td></tr><tr><td>Foto flo</td><td>Kodak</td><td>1464502</td><td></td></tr><tr><td>Losartan</td><td>Fisher/Tocris</td><td>37-985-0</td><td></td></tr><tr><td>MCID&trade; Core 7.0</td><td>MCID</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Punhos de lâmina Peel-A-Way</td><td>VWR</td><td>48440-003</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>PD123319</td><td>Fisher</td><td>13-615-0</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Premium Carregadas, Lâmina</td> de <td>Microscópio Premiere</td> de Borda Fina <td>9308W</td><td></td></tr><tr><td> 125I Ligantes</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEX- 248</td><td></td></tr><tr><td>125SI-Ang II&nbsp;</td><td>Universidade George Washington</td><td>Radioiodado pelo Dr. Speth</td><td></td></tr><tr><td>Slide Mailers</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Dibásico de Sódio Anidro (Na2PO4)</td><td>Fisher</td><td>RDCS0750500</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio (Anidro)</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Thionin&nbsp;</td><td>de</td> Raio-X Fisher <td>T409-25</td><td></td></tr><tr><td>(10 x 12)</td><td>Spectronics Corporation</td><td>Four Square</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

a autorradiografia do receptor protocolo para a visualização localizada da angiotensina ii receptores

Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors

Este protocolo descreve os padrões de ligação do receptor de angiotensina II (Ang II) no cérebro de rato usando um radioligando específica para os receptores de Ang II para executar o mapeamento do receptor de auto-radiografia. Os espécimes de tecido são colhidas e armazenadas a -80 ° C. A criostato é usado para a secção coronal do tecido (cérebro) e descongelar-montar as secções em lâminas carregadas. As secções de tecido em lâminas são incubadas em 125I-SI-Ang II para marcar radioactivamente receptores de Ang II. Lâminas adjacentes são separados em dois conjuntos: &quot;ligação não específica&quot; (NSP) na presença de uma concentração saturante de receptores de não-marcado radioactivamente Ang II, ou um subtipo AT 1 do receptor de angiotensina II (AT 1 R) antagonista selectivo do receptor Ang II e &#39;ligação total &quot;, sem AT 1 antagonista R. Uma concentração saturante de AT 2 subtipo do receptor Ang II (2R) antagonista (PD123319, 10 uM) também está presente no incubatiem tampão de limitar 125I-SI-Ang II se ligarem ao subtipo AT 1 R. Durante 30 min de pré-incubação à temperatura de ~ 22 ° C, as lâminas NSP são expostas a 10? M e PD123319 losartan, enquanto &#39;ligação total &quot;slides são expostas a 10? M PD123319. As lâminas são então incubadas com 125 I-Si-Ang II, na presença de PD 123319 para &#39;ligação total &quot;, e PD 123319 e de losartan para PEN em tampão de ensaio, seguido de várias lavagens&#39; &#39;em tampão, e água para remover o sal e não- radioligando especificamente ligado. As lâminas são secas com secador por, em seguida, exposto a filme de auto-radiografia usando um filme especializada e cassete. O filme é desenvolvido e as imagens são digitalizadas em um computador para densitometria visual e quantitativa usando um sistema de imagem proprietária e uma planilha. Um conjunto adicional de slides são tionina-coradas para comparações histológicas. A vantagem de utilizar a autorradiografia do receptor é a capacidade de visualizarAng II receptores in situ, dentro de uma secção de uma amostra de tecido, e anatomicamente identificar a região do tecido por comparação desta com uma secção histológica de referência adjacente.

A síntese da via metabólica do sistema renina-angiotensina é mostrado na Figura 1 e o foco directo sobre os subtipos de receptores da angiotensina II (AT 1 R e AT 2 R) está descrita na Figura 2. A Figura 3 mostra a transferência de cérebro coronal secções em lâminas de microscópio, que são executados através de um processo de auto-radiograf ia do receptor utilizando uma concentração pré-determinada de 125I-SIAN...

Aqui apresentamos um protocolo para descrever a localização dos receptores de angiotensina II tipo 1 no cérebro de ratos por autorradiografia quantitativa, densitométrica e in vitro do receptor usando um análogo marcado com iodo-125 da angiotensina II.

A autorradiografia do receptor Protocolo para a visualização localizada da angiotensina II Receptores

This protocol describes receptor binding patterns for Angiotensin II (Ang II) in the rat brain using a radioligand specific for Ang II receptors to ...

O objetivo geral deste procedimento é localizar anatomicamente e quantificar a expressão do Receptor de Angiotensina II em cortes cerebrais, utilizando a Auto-radiografia de Receptores e a identificação histológica das estruturas cerebrais. Este método identifica as regiões cerebrais onde a Angiotensina II afeta o comportamento, a função cognitiva e o sistema cardiovascular, fornecendo subsídios para o desenvolvimento de terapias inovadoras no tratamento de doenças neurodegenerativas e cardiovasculares. As principais vantagens desta técnica são seu caráter quantitativo e qualitativo, além de permitir a identificação de receptores funcionais para a Angiotensina II com maior especificidade do que outros métodos.Este método também pode caracterizar a funcionalidade de outros sistemas de receptores hormonais em todo o corpo, como receptores relacionados a drogas de abuso. Imediatamente após a coleta, coloque os tecidos cerebrais em moldes cerebrais que simulam o interior do crânio e envolva os moldes em folha de alumínio para armazenamento a menos 20 graus celsius. Após 30 minutos, transfira os tecidos para um saco hermético para armazenamento em freezer e armazene o saco a menos 80 graus celsius.Antes do corte, remova suavemente o cérebro do molde cerebral. Para seccionar o tecido cerebral, transfira a amostra de interesse para um criostato ajustado entre menos 10 e menos 18 graus celsius. Quando o tecido atingir equilíbrio térmico com a nova temperatura, utilize um meio à base de glicol e resina para embutir verticalmente uma pequena porção da amostra em um suporte de tecido, permitindo o corte no plano coronal.Coloque o tecido no micr&oacute;tomo e aperte firmemente o suporte no lugar, ent&atilde;o inicie o corte do c&eacute;rebro na espessura desejada, montando em seguida as sec&ccedil;&otilde;es em l&acirc;minas de microsc&oacute;pio em orienta&ccedil;&atilde;o vertical para aplicar uma maior &aacute;rea de superf&iacute;cie do tecido na l&acirc;mina. Colete as sec&ccedil;&otilde;es em conjuntos sequenciais de cinco. Quando todas as sec&ccedil;&otilde;es tiverem sido coletadas, deixe as l&acirc;minas secarem ao ar por at&eacute; uma hora.Em seguida, coloque as amostras em uma caixa de lâminas de plástico dentro de um saco congelável com fechamento hermético para armazenamento a menos 20 graus celsius. Para marcar as amostras com radiação, remova a primeira e a segunda lâmina de cada conjunto de cinco e monte-as em pinças para lâminas disponíveis comercialmente ou fabricadas por impressão 3D. As lâminas traço um são para o grupo de tratamento não específico e as lâminas traço dois são para o grupo de tratamento total.Inverta as lâminas em 35 a 40 mililitros de AM5 à temperatura ambiente mais seus respectivos inibidores nos frascos Coplin de pré-incubação apropriados. Realizar múltiplos conjuntos de lâminas pode ser complicado. Portanto, é extremamente importante colocar as lâminas nos frascos de pré-incubação em intervalos de quatro minutos para garantir que não haja sobreposição durante a etapa de secagem.Após 30 minutos, transfira as lâminas para envelopes de incubação contendo 10 mililitros de AM5 suplementado com a concentração apropriada de I125 SI Angiotensina II e os inibidores do respectivo grupo de tratamento, durante 60 a 90 minutos à temperatura ambiente. A determinação da concentração exata de 125I SI Ang II é fundamental para permitir a comparação dos receptores de Angiotensina II de um dia para o outro. Ao final da incubação, devolva as lâminas aos suportes, bloqueie-as e agite-as suavemente por um a dois segundos em dois recipientes separados contendo 400 mililitros de água destilada.Após a segunda lavagem com água, enxágue as lâminas com quatro lavagens sequenciais de um minuto em 30 a 40 mililitros de AM5. Após a quarta lavagem, agite suavemente as seções por um a dois segundos em quatro mudanças de água destilada gelada. Em seguida, use quatro secadores de cabelo posicionados em ângulos diferentes para secar as lâminas com ar frio durante quatro minutos.Quando todas as seções estiverem secas, transfira as lâminas para uma toalha de papel. Em seguida, use fita adesiva dupla face para montar as lâminas, com o lado do tecido voltado para cima, sobre um pedaço de papelão para filme de raios-X, posicionando-as de forma a incluir pelo menos uma lâmina padrão de calibração de iodo 125 por grupo. Para expor as seções ao filme, em um ambiente escuro, coloque as lâminas de papelão dentro de uma cassete de raios-X com fundo de tela e desligue as luzes.Ligue a luz segura e abra cuidadosamente uma caixa de filme de raios-X. Coloque um filme, com o lado brilhante voltado para cima e a borda dentada na parte inferior direita, sobre as lâminas dentro da cassete. Em seguida, feche cuidadosamente a cassete com as barras de travamento giradas para vedar a entrada de luz e armazene a cassete a menos 20 graus Celsius.Após o período de exposição apropriado, transfira o filme para a solução reveladora por dois minutos, seguido por 30 segundos em banho de parada, água destilada duplamente com ácido acético, e então cinco minutos em solução fixadora. Lave o filme em uma bandeja com água corrente por 20 minutos. Transfira-o para um surfactante por aproximadamente 10 segundos e pendure o filme para secar.Para análise histológica de cortes de tecido cerebral, descongele os três cortes em uma gradinha de lâminas. Em seguida, lave os cortes em água deionizada por um minuto, seguido por uma incubação de 10 minutos em solução de coloração com tionina e três mergulhos em um recipiente com água deionizada. Mergulhe as lâminas por mais 30 segundos em água deionizada para uma lavagem adicional.Em seguida, lave as lâminas com lavagens sequenciais de etanol conforme indicado. Após a última lavagem com etanol a 100%, lave as lâminas em dois recipientes de xilol por três e cinco minutos consecutivos. Ao final da segunda lavagem com xilol, cubra a borda superior de uma lâmina por vez com uma base de resina, meio de montagem com solvente inorgânico.Monte lamínulas de 24 por 60 milímetros sobre as lâminas e deixe as lâminas secarem por 48 horas. Em seguida, digitalize as lâminas e os filmes no computador com 2400 DPI em escala de cinza. Para analisar o filme por densitometria, após a digitalização, delimite empiricamente as áreas de interesse em cada filme.Esta é a imagem em cores falsas gerada após a abertura do filme digitalizado no programa de análise de imagem. Inclua na medição a densidade, a área de digitalização e a área total do alvo. Ajuste as barras da área de digitalização para garantir que cada região de interesse esteja compreendida nos parâmetros do realce.Em seguida, exporte os dados para uma planilha para determinar a ligação específica presente em cada amostra. As unidades padrão de calibração para quantificação são determinadas com base na data em que o ensaio foi realizado. Após escanear os filmes, os valores de calibração são utilizados para gerar uma curva com base nas concentrações variadas dos padrões de iodo 125 para aquele filme específico.Os valores de calibração e padrão são registrados em triplicata para garantir precisão. As distinções entre as ligações não específicas e os grupos totais, bem como as marcações dos tecidos, são estabelecidas atribuindo cada conjunto de dados aos subgrupos apropriados. Um valor de limite superior deve ser definido ajustando os parâmetros do vermelho para o preto, enquanto o valor de limite inferior deve ser definido próximo a zero para permitir uma medição mais precisa de toda a área escaneada de interesse.Por exemplo, aqui as áreas finais medidas do núcleo paraventricular do hipotálamo nos grupos de ligação total versus ligação não específica são comparadas a uma seção corada com tionina para confirmação anatômica. A ligação não específica é a quantidade de radioligante ligado a receptores não relacionados aos receptores de angiotensina na presença de uma concentração saturante de ligante não radioativo do receptor de angiotensina I, enquanto a ligação total é a quantidade de radioligante ligado na ausência de ligante não radioativo do receptor de angiotensina I. Os valores de ligação não específica podem então ser subtraídos dos valores de ligação total para obter os valores de ligação específica para os receptores de angiotensina I.Uma vez dominada, a etapa de autoradiografia de receptores pode ser concluída em cerca de quatro horas, enquanto a revelação do filme leva cerca de 30 minutos por filme. Durante a realização deste procedimento, é importante controlar o tempo para garantir que todas as lâminas sejam incubadas, lavadas e secas exatamente pela mesma duração. Após este procedimento, podem ser realizados estudos adicionais da morfologia cerebral para avaliar as alterações no tamanho das regiões que exibem expressão do Receptor de Angiotensina II.Essa técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam a farmacologia de receptores determinarem como diferentes regiões cerebrais são afetadas por várias neurohormonas, neurotransmissores e drogas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar com sucesso um ensaio de auto-radiografia de receptores, preparar lâminas coradas histologicamente e avaliar auto-radiogramas para localizar receptores em regiões cerebrais específicas. Lembre-se de que trabalhar com radioatividade pode ser perigoso e precauções, como blindagem adequada, contenção, monitoramento de exposição e descarte apropriado, devem sempre ser tomadas para evitar contaminação radioativa.

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Neuroscience

Neurociência

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