Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto

O objetivo geral deste protocolo é descrever um procedimento simples de dissecação em um único passo para cérebros de Drosophila adulta, que pode produzir rapidamente cérebros com morfologia bem preservada, adequados para análise em montagem inteira. Este método pode ajudar a responder perguntas nas áreas de neurociência e genética, incluindo mapeamento detalhado das circuitarias cerebrais, estudo dos efeitos de manipulações genéticas em neurônios e caracterização funcional de genes.

A principal vantagem desta técnica é que envolve um procedimento fácil de aprender. Ela pode facilitar a dissecação de um cérebro de drosófila adulta com morfologia bem preservada em menos de 10 segundos. A demonstração em vídeo deste método é essencial, pois controlar o momento necessário ao soltar a pinça para rasgar o exoesqueleto que envolve a cabeça da mosca exige habilidade e prática.

Essas pequenas e irritantes moscas-das-frutas nos ensinaram muito sobre os princípios biológicos. Elas também podem nos ajudar a descobrir as causas e os tratamentos para doenças humanas, como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson. Usando um microscópio estereoscópico ajustado para ampliação de 1,2 X, imobilize uma mosca anestesiada e mergulhe-a em solução fria de dissecação com o abdômen voltado para cima.

Mantenha a pinça em um ângulo de 160 a 170 graus em relação à placa de dissecação e, em seguida, aplique uma pequena força sobre o abdômen da mosca. Isso deve imobilizar a mosca, forçar a cabeça para trás em 15 a 25 graus e estender o probóscide para cima. Após essa manobra, uma região macia e translúcida da cutícula localizada sob o probóscide deve tornar-se aparente.

Aumente a ampliação e ajuste o plano focal para esta região. Usando a mão dominante, pegue um par de pinças de dissecação e exerça pressão para fechar as pontas. Posicione as pinças perpendicularmente às pinças que estão imobilizando a mosca.

Fure as pontas fechadas da pinça através da região macia e translúcida da cutícula, tomando cuidado para não penetrar tão profundamente a ponto de tocar o cérebro. Em seguida, solte rapidamente, mas com firmeza, a pinça, de modo que as pontas se abram, rasgando a exosqueleto da cabeça da mosca. Utilize o movimento gerado ao soltar as pontas da pinça para remover suavemente o exosqueleto e a maior parte da cápsula da cabeça, incluindo olhos e traqueia, do tecido cerebral em um único movimento.

Um cérebro intacto deve agora estar visível. Usando a pinça, remova cuidadosamente os tecidos acessórios remanescentes, como o tecido fibroso branco da traqueia, tomando cuidado para não puxar ou danificar o cérebro propriamente dito. Coloque as amostras de cérebro dissecadas com os troncos associados em aproximadamente um mililitro de paraformaldeído a 4% sobre gelo por 40 a 60 minutos.

Remova o paraformaldeído e, em seguida, enxágue as amostras com um mililitro de PBS 1X pipetando a solução para cima e para baixo três vezes, tomando cuidado para não aspirar os cérebros. Em seguida, remova o PBS e lave cinco vezes com um mililitro de PBT 1X durante cinco minutos cada, com agitação suave. Adicione o anticorpo primário de interesse na diluição apropriada.

Em seguida, incubar as amostras durante a noite a quatro graus Celsius com agitação suave. Remover o anticorpo primário e lavar as amostras cinco vezes com um mililitro de PBT 1X, durante cinco a 10 minutos cada lavagem, com agitação suave. Adicionar o anticorpo secundário às amostras lavadas na diluição e tempo de incubação apropriados.

Em seguida, lave as amostras seis vezes em um mililitro de PBT 1X durante 10 minutos cada, com agitação suave. Este passo é essencial para remover quaisquer anticorpos secundários ligados de forma não específica. Incube as amostras em uma diluição de 1:10.000 de um miligrama por mililitro de DAPI em um mililitro de solução de PBT 1X por 30 a 60 minutos com agitação suave.

Por fim, lave as amostras adicionando um mililitro de PBS 1X e, em seguida, pipetando a solução para cima e para baixo três vezes. Coloque uma lamínula sobre uma lâmina de montagem. Usando uma pipeta com a ponta cortada, transfira os cérebros na solução de PBS 1X para a lamínula.

Em seguida, utilizando pinças, separe os cérebros dos corpos. Use uma ponteira fina para remover o líquido ao redor do tecido cerebral. E então, adicione de 20 a 40 microlitros de meio de montagem antidesvanecimento.

Espalhe suavemente os cérebros, deslocando o meio viscoso para fora. Começando por um lado, abaixe suavemente uma segunda lamínula sobre as amostras, tomando cuidado para minimizar o contato do cérebro com bolhas. Deixe as lamínulas assentarem e, em seguida, remova qualquer líquido em excesso da borda das lamínulas usando um lenço de laboratório.

Use um pequeno pedaço de fita adesiva para prender temporariamente o par de lamínulas à lâmina de montagem. Para obter imagens das amostras, utilize um microscópio composto fluorescente ou confocal. Essas imagens mostram vistas anterior e posterior do mesmo Drosophila adulto.

Os núcleos celulares foram visualizados por coloração com DAPI e os neurônios foram marcados utilizando um marcador pan-neuronal e anticorpos anti-ELAV. Neurônios dopaminérgicos, ou DA, foram revelados pela coloração com anticorpo anti-TH. Níveis semelhantes de intensidade foram observados entre ambos os lados do cérebro para todos os canais de imagem.

Vistas ampliadas da região anterior e posterior do cérebro permitem a análise detalhada dos aglomerados de neurônios DA. O aglomerado medial anterior pareado pode ser observado nas imagens anteriores, enquanto os aglomerados mediais posteriores pareados e os aglomerados laterais posteriores pareados são visíveis no lado posterior do cérebro. A quantificação desses neurônios revelou que moscas machos da linhagem w1118 com três dias de idade possuem tipicamente 27 neurônios DA no aglomerado PPM em todo o cérebro, 16 no aglomerado PPL por hemisfério e cinco no aglomerado PAL por hemisfério.

Foi observado uma média de 97 neurônios dopaminérgicos em cada um dos aglomerados PAM. A reconstrução 3D dos aglomerados PAL e PAM também mostrou que os neurônios dopaminérgicos no aglomerado PAM têm tamanhos relativamente menores e coloração TH mais fraca do que aqueles em outros aglomerados, como o PAL. Cada vez mais estudos estão se concentrando nos cérebros de moscas adultas para dissecar vias moleculares e circuitos neuronais subjacentes a funções cerebrais superiores, e para modelar doenças cerebrais humanas.

Em estudos baseados no cérebro como este, será necessário preparar com eficiência amostras cerebrais com morfologia bem preservada. Isso pode ser especialmente importante em telas em larga escala baseadas no cérebro. Tive pela primeira vez a ideia deste método ao ter dificuldade para segurar moscas com a pinça.

Em vez de pinças com pontas afiadas, que a maioria dos pesquisadores de Drosophila utiliza, Shebna experimentou pinças de ponta romba e constatou que era mais fácil dissecar os cérebros. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em menos de 10 segundos, se executada corretamente. Certo dia, dissecuei cerca de 100 cérebros de seis genótipos diferentes para um único experimento.

Embora este procedimento de dissecação possa parecer simples, é importante praticá-lo primeiro com moscas descartáveis. O pesquisador também pode ter dificuldade para posicionar a pinça sem danificar o cérebro da mosca. Os cérebros dissecados podem ser utilizados em outros estudos, como RNA, hibridização in situ e extração de amostras de proteína e RNA a partir do tecido cerebral.

Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de dissecar cérebros de moscas com morfologia bem preservada. Prevemos que melhorias podem ser desenvolvidas para tornar este procedimento mais simples e rápido. Isso potencialmente poderá se tornar automatizado no futuro para estudos em larga escala.

Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído e pinças de dissecação afiadas pode ser perigoso. Tome precauções, como o uso de luvas, ao manipular soluções fixadoras, e, assim que a dissecação for concluída, tampe imediatamente as pinças antes de guardá-las.