Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto Drosophila Brains

O objetivo geral deste protocolo é descrever um procedimento simples de dissecação em uma etapa para cérebros adultos de Drosophila, que pode produzir rapidamente cérebros com morfologia bem preservada, adequados para análise de montagem inteira. Este método pode ajudar a responder a perguntas nos campos da neurociência e da genética. Isso inclui mapeamento fino de circuitos cerebrais, estudo dos efeitos de manipulações genéticas de neurônios e caracterização funcional de genes.

A principal vantagem dessa técnica é que ela envolve um procedimento fácil de aprender. Pode facilitar a dissecação de um cérebro de mosca adulta com morfologia bem preservada em menos de 10 segundos. A demonstração em vídeo desse método é crítica, pois controlar o impulso necessário ao liberar a pinça para arrancar o exoesqueleto ao redor da cabeça da mosca requer habilidades e prática.

Essas minúsculas e irritantes moscas-das-frutas nos ensinaram muito sobre os princípios biológicos. Eles também podem nos ajudar a encontrar as causas e as curas para doenças humanas, como a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson. Usando um microscópio de dissecação ajustado para ampliação de 1,2 X, imobilize uma mosca anestesiada e mergulhe-a em solução de dissecção fria com o abdômen voltado para cima.

Mantenha a pinça em um ângulo de 160 a 170 graus em relação à placa de dissecação e, em seguida, exerça uma pequena força no abdômen da mosca. Isso deve imobilizar a mosca, forçar a cabeça para trás de 15 a 25 graus e estender a tromba para cima. Após essa manobra, uma região translúcida e macia da cutícula sob a tromba deve se tornar aparente.

Aumente a ampliação e ajuste o plano focal nesta região. Usando a mão dominante, pegue uma pinça de dissecação e exerça pressão para fechar as pontas. Posicione a pinça perpendicularmente à pinça que prende a mosca.

Perfure as pontas fechadas da pinça através da região translúcida e macia da cutícula, tomando cuidado para não penetrar tão profundamente que toquem o cérebro. Em seguida, rapidamente, mas com firmeza, solte a pinça, de modo que as pontas se abram, arrancando o exoesqueleto da cabeça da mosca. Use o impulso de liberar as pontas da pinça para remover suavemente o exoesqueleto e a maior parte do olho e traqueia associados ao caso da cabeça do tecido cerebral em um movimento.

Um cérebro intacto agora deve ser visível. Usando a pinça, remova cuidadosamente os tecidos acessórios restantes, como o tecido fibroso branco da traqueia, tomando cuidado para não puxar ou danificar o cérebro propriamente dito. Coloque as amostras de cérebro dissecadas com torsos associados em aproximadamente um mililitro de paraformaldeído a 4% no gelo por 40 a 60 minutos.

Remova o paraformaldeído e depois enxágue as amostras com um mililitro de um X PBS, pipetando a solução para cima e para baixo três vezes, tomando cuidado para não aspirar os cérebros. Em seguida, remova o PBS e lave cinco vezes com um mililitro de um X PBT por cinco minutos cada com nutação. Adicionar o anticorpo primário de interesse na diluição adequada.

E então incubar as amostras durante a noite a quatro graus Celsius com nutação. Remover o anticorpo primário e lavar as amostras cinco vezes com um mililitro de um X PBT durante cinco a 10 minutos cada lavagem com nutação. Adicionar anticorpos secundários às amostras lavadas na diluição e no tempo de incubação adequados.

Em seguida, lavar as amostras seis vezes em um mililitro de um X PBT por 10 minutos cada com nutação. Esta etapa é fundamental para remover quaisquer anticorpos secundários não especificamente ligados. Incubar as amostras numa diluição de um a 10 000 miligramas por mililitro de DAPI num mililitro de uma solução X PBT durante 30 a 60 minutos com nutação.

Por fim, enxágue as amostras adicionando um mililitro de um X PBS e, em seguida, pipetando a solução para cima e para baixo três vezes. Coloque uma lamínula em uma corrediça de montagem. Usando uma pipeta com ponta cortada, transfira os cérebros em uma solução X PBS para a lamínula.

Em seguida, usando uma pinça, separe os cérebros dos corpos. Use uma ponta de pipeta fina para remover o líquido ao redor do tecido cerebral. E então, adicione 20 a 40 microlitros de meio de montagem anti-desbotamento.

Espalhe suavemente os cérebros, enquanto desloca o meio viscoso para fora. Começando de um lado, abaixe suavemente uma segunda lamínula sobre as amostras, tomando cuidado para minimizar o contato do cérebro com as bolhas. Deixe as tiras assentarem e, em seguida, remova o excesso de líquido da borda das tiras usando um lenço de laboratório.

Use um pequeno pedaço de fita adesiva para prender temporariamente o par de lamínulas à corrediça de montagem. Para obter imagens das amostras, use um microscópio composto fluorescente ou confocal. Essas imagens mostram vistas anterior e posterior da mesma Drosophila adulta.

Os núcleos celulares foram visualizados pela coloração DAPI e os neurônios foram marcados usando um marcador pan-neuronal e anticorpos anti-ELAV. Os neurônios dopaminérgicos, ou DA, foram revelados pela coloração do anticorpo anti-TH. Níveis semelhantes de intensidade foram observados entre os dois lados do cérebro para todos os canais de imagem.

Vistas ampliadas da parte anterior e posterior do cérebro permitem um exame detalhado dos aglomerados neuronais DA. O cluster medial anterior emparelhado pode ser visto nas imagens anteriores, e os clusters medial posterior e lateral posterior emparelhado no lado posterior do cérebro. A quantificação desses neurônios revelou que as moscas machos w1118 de três dias normalmente têm 27 neurônios DA no cluster PPM em todo o cérebro, 16 no cluster PPL por hemisfério e cinco no cluster PAL por hemisfério

Uma média de 97 neurônios DA foi observada em cada um dos clusters PAM clusters. 3D reconstrução dos clusters PAL e PAM também mostrou que os neurônios DA no cluster PAM têm tamanhos relativamente pequenos e coloração TH mais fraca do que aqueles nos outros clusters, como o PAL. Cada vez mais, mais estudos estão se concentrando em cérebros de moscas adultas para dissecar vias moleculares e circuitos neuronais subjacentes a funções cerebrais superiores e para modelar doenças cerebrais humanas.

Em tais estudos baseados no cérebro, será necessário preparar eficientemente amostras cerebrais com morfologia bem preservada. Isso pode ser especialmente importante em telas baseadas no cérebro em grande escala. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando lutava para segurar as moscas no fórceps.

Em vez de fórceps com pontas afiadas que a maioria dos pesquisadores de Drosophila usa, Shebna tentou fórceps de ponta romba e descobriu que era mais fácil dissecar os cérebros. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 10 segundos se for executada corretamente. Uma vez, dissequei cerca de 100 cérebros de seis genótipos diferentes para um experimento em apenas um dia.

Embora esse procedimento de dissecação possa parecer simples, é importante praticá-lo primeiro com moscas dispensáveis. O investigador também pode ter dificuldade em posicionar a pinça sem destruir o cérebro da mosca. Os cérebros dissecados podem ser usados para outros estudos, como RNA, hibridização in situ e extração de proteína e amostra de RNA do tecido cerebral.

Depois de assistir a este vídeo, você poderá dissecar cérebros de moscas com morfologia bem preservada. Prevemos que melhorias podem ser desenvolvidas para tornar esse procedimento mais simples e rápido. Isso pode se tornar automatizado no futuro para estudos em larga escala.

Não se esqueça de que trabalhar com o paraformaldeído e a pinça de dissecação afiada pode ser perigoso. Tome precauções, como usar luvas, ao manusear soluções fixadoras e, quando a dissecção estiver concluída, tampe imediatamente a pinça antes de colocá-la de lado.