Name: Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Aprenda a técnica de autoradiografia para visualizar sítios de ligação de proteínas em tecidos de camundongo com alta resolução espacial. Este método oferece uma alternativa rápida à imunohistoquímica para análises farmacológicas.

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O trabalho foi financiado pela Fundação Lundbeck (Grant R133-A12270) e a Novo Nordisk Foundation (Grant NNF0C0028664). Os autores agradecer Dr. Aleš Marek para o fornecimento de radioligantes [3H].

Todo animal manipulação foi realizada em conformidade com as diretrizes da Inspetoria de Experimentação Animal dinamarquês.
Nota: O protocolo descrito aqui aborda a preparação do tecido (ou seja, tecido de cérebro de rato), em vitro ensaio eosina em detalhes suficientes para a criação do método em um novo laboratório, a exposição de imagem de placas de fósforo, bem como subsequente análise densitométricos de autoradiograms (Figura 2) com o objetivo de localizar e quantificar radioligantes vinculação em estruturas anatômicas distintas. Para comparação histológica, um protocolo para coloração de cresilo violeta está incluído. Além disso, a determinação de ligação não-específica com um ligante concorrente está incluída dentro do protocolo. Para uma descrição detalhada sobre como determinar Kd, Bmáx ou Keu, consulte anterior publicação4.
1. tecido preparação por Cryosectioning
<ol><li>Eutanásia o mouse por deslocamento cervical e imediatamente dissecar o cérebro usando uma tesoura e pinça. Diretamente a prosseguir para a próxima etapa para evitar danos aos tecidos.</li>
	<li>Snap-congelar o tecido por submersão em pó gelo seco, gasoso CO2 ou isopentano. Transferir diretamente o tecido congelado para um criostato com a temperatura definida como-20 ° C. Alternativamente, armazene o tecido a-80 ° C até o processamento. Nota: Evite descongelar/congelamento repetido para reduzir o dano de tecido.</li>
	<li>Deixe o tecido adaptar à-20 ° C em criostato por 20 min antes de processamento adicional para evitar a ruptura do tecido.</li>
	<li>Cobrir o suporte do tecido com encastre meio fora do criostato e rapidamente Coloque a amostra de tecido congelado na orientação desejada enquanto meio de encastre é ainda líquido. Por exemplo, coloque o cérebro de rato verticalmente no cerebelo para atingir rostrais secções coronais. Transferir o suporte do tecido para o criostato e expor médio encastre a temperaturas abaixo de-10 ° C para endurecimento. Nota: Amostra de tecido frágil deve ser revestida em incorporação médio dentro dos moldes do tecido antes da montagem.</li>
	<li>Posicione o suporte do tecido em micrótomo do criostato. Ajuste a orientação do tecido para evitar seções inclinadas.</li>
	<li>Corte o tecido com a orientação de um atlas estereotáxica18 nas seções da espessura desejada (12 µm recomendado para [3H] rotulados ligantes). Cuidadosamente endireitar e desdobrar a seção com uma escova de tamanho pequeno, se necessário e degelo-monte a seção numa lâmina de microscópio. Sequencialmente, recolha as seções da região de interesse para replicação técnica desejada (por exemplo, 4 seções por slide).</li>
	<li>Permitir que as seções sobre os slides para secar por 1h antes de manusear ainda mais. Nota: Adição de material dessecante para slide caixas minimiza a umidade se acumulam sobre as secções de tecido. Procotol pode ser pausado aqui armazenando seções a longo prazo em caixas de slide a-80 ° C.</li>
</ol>2. in vitro autoradiografia
PRECAUÇÃO: radioatividade. Trabalha em um laboratório certificado de acordo com os regulamentos locais. Utilizar vestuário de protecção. Elimine em conformidade com o decaimento radioativo ou terceirizar para uma empresa certificada.
<ol><li>Descongele as seções pelo menos 30 min à temperatura ambiente (RT). Rotule os slides com condições experimentais. Use um lápis porque os slides vão ser banhados em álcool etílico durante coloração subsequentes.</li>
	<li>Coloque as lâminas na horizontal em bandejas plásticas. Nota: Slides sobre uma plataforma elevada dentro de bandejas plásticas de posicionamento facilita a sua manipulação.</li>
	<li>Pre-incubate as seções montadas sobre os slides no buffer de ensaio ajustado ao alvo em questão (para protocolo GHB, 50mm KHPO4 tampão pH 6.0 é usado) aplicando cuidadosamente um volume adequado para o slide (700 µ l para roedores secções coronais de 3-4). Nota: Certifique-se que cada seção é completamente coberta com o líquido.<ol>
<li>Cobrir as bandejas de plástico com uma tampa para evitar a evaporação e pre-incubar a temperatura relevante (para o protocolo GHB pre-incubate por 30 min em RT) sob constante suave (20 rpm) agitando um agitador de placa.</li>
		<li>Para a determinação da ligação não-específica, suplemento buffer de ensaio com concentração relevante de rotuladas composto (para o protocolo GHB, 1mm GHB). Nota: Pré-incubação pode não ser necessário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Decantar o líquido de pré-incubação de cada slide e transferir os slides para a bandeja de plástico.</li>
	<li>Para evitar a desidratação, incubar imediatamente as seções com concentração relevante de radioligantes no buffer de ensaio sob condições desejadas (para o protocolo GHB, 1 nM [3H] HOCPCA por 1h no RT) cobrindo as seções completamente com o radioligantes solução (700 µ l para roedores secções coronais de 3-4).<ol>
<li>Incube sob sob constante suave (20 rpm) tremendo de bandejas plásticas com tampa fechada. Nota: A concentração de radioligantes pode ser validada pelo contando uma alíquota em um contador de cintilação líquida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remover a solução de incubação por decantar o líquido e transfira os slides em um rack de slide de microscópio. Seguir para a próxima etapa para evitar a desidratação da seção.</li>
	<li>Lave os slides. Para o protocolo GHB, lave com buffer de ensaio gelada duas vezes para 20 s e em seguida enxaguar duas vezes por mergulhar as lâminas em bandejas cheias com água destilada gelada para remover os sais. Posicione os slides verticalmente em racks para secar pelo menos 1 h no RT ou seque os slides por 5 min com um soprador de definir a temperatura fria. Nota: A lavagem deve ser otimizada, por exemplo, lavagem extensa pode ser úteis para diminuir inespecificas.</li>
	<li>Transferi os slides para um fixador externo contendo paraformaldeído (PFA) em pó para fixação da noite com vapores PFA em RT para proteger a integridade do complexo ligante-alvo. Atenção: O PFA é tóxico. Fixador de Positionthe no exaustor de fumo e evitar o contato de pele/olho com PFA.</li>
	<li>No dia seguinte, transfira os slides para uma caixa de dessecador contendo sílica gel para 3h no RT para eliminar a umidade.</li>
</ol>3. exposição de placas de fósforo e digitalização
<ol><li>Coloca as seções em uma gaveta de placa de imagem blindado radiação com o tecido virado para cima. Para posterior quantificação de radioligantes vinculação, incluem uma microescala [3H] em cada gaveta. Organizar as seções aleatoriamente e expor as seções para comparação directa no mesmo.</li>
	<li>Apaga o fósforo de trítio sensíveis placa imediatamente antes do uso de imagens, a fim de remover sinais acumulados de armazenamento e para eliminar sinais de fundo. Portanto, carregar a placa na máquina da imagem latente do fósforo e expô-la ao visível/infravermelho luz de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Retirar a placa da máquina da imagem latente do fósforo e imediatamente coloque-a sobre as seções na gaveta. Certifique-se de que a fita está completamente fechada. Expor as seções para a placa de imagem de fósforo por 3 dias no RT, protegido da luz.</li>
	<li>Porque a luz apaga sinal da placa de imagem, cuidadosamente Abra a gaveta no escuro e imediatamente transferir a placa de imagem na caixa escura de um Imageador de fósforo ou coloque o tonalizador de fósforo em um quarto escuro. Nota: Certifique-se de anotar o arranjo espacial dos slides durante a exposição, a fim de identificar cada amostra na imagem digital após análise. Portanto, placas de imagem de fósforo também exibem um canto cortado num ângulo bem distinto a fim de identificar a orientação correta da placa na imagem digital.</li>
	<li>Escaneie a placa com a maior resolução possível obter uma imagem digital.</li>
</ol>4. opcional: Cresilo coloração violeta de seções do tecido
<ol><li>Preparar a solução de cresilo violeta 1% através da mistura de 5 g de acetato de cresilo violeta em 500 mL de água desionizada (dH2O) até dissolver (aproximadamente 2h). Filtrar por papel de filtro usando um funil em uma nova garrafa de 500 mL. Ajuste o pH a 3,5-3,8.</li>
	<li>Posição o slide coloração definida sob a coifa. Prepare as bandejas com as seguintes soluções em bandejas de polipropileno brancas (exceto para-xileno): r. 50% ethanol/50% dH2O b. 70% ethanol/30% dH2O c. 100% de etanol m. 100% de etanol e. O 100% dH2 f. 1% violeta de cresilo g. 0.07% de ácido acético (Adicionar 175 µ l de ácido acético a 250 mL de dH2O). h. 100% xileno em bandejas resistentes a solventes verdes i. 100% xileno em bandejas resistentes a solventes verdes</li>
	<li>Transferir os slides para a coifa e colocá-los em um rack de slide.</li>
	<li>Dissolva os lipídios através de crescente série graduada de etanol em dH2O a 100% de etanol (bandeja a-d) mergulhando os slides por 1 min.</li>
	<li>Hidratar os espécimes para dH2O através de decrescente concentrações de etanol (bandeja um-d em ordem inversa, seguido de bandeja e) mergulhando os slides por 1 min.</li>
	<li>Mergulhe as amostras em solução de cresilo violeta por 10 min.</li>
	<li>Lave os espécimes em 0.07% de ácido acético, levantando os slides acima e para baixo suavemente durante 4-8 s lavar os slides mergulhando na dH2O por 1 min.</li>
	<li>Desidratar os espécimes por imersão dos slides por 30 s em crescente concentração de etanol (bandeja a-d).</li>
	<li>Transferi as amostras através de duas bandejas de 100% de xileno (bandeja h e i) para saciar o etanol.</li>
	<li>Hidratar os espécimes para dH2O através de decrescente concentrações de etanol (bandeja um-d em ordem inversa, seguido de bandeja e) mergulhando os slides por 1 min.</li>
	<li>Remova as lâminas de solução salina com fórceps. Adicionar algumas gotas de solvente orgânico, montagem de mídia por slide e adicionar uma lamínula 24 x 60 mm na parte superior para proteger espécimes. Remova as bolhas de ar entre a amostra e a lamela pressionando suavemente no sentido do lamela. Nota: Mantenha as lâminas restantes em xilol durante a montagem para impedir a secagem.</li>
	<li>Seca os slides durante a noite em uma coifa no RT</li>
	<li>Obter uma imagem de amostra com um microscópio e objectivo de X 1,25.</li>
</ol>5. densitométricos análise de imagem Digital
<ol><li>Medir densidades ópticas relativas (hastes) de cada calibração padrão da microescala [3H] com um software de análise de imagem.<ol>
<li>Selecione uma área de igual tamanho para cada ponto da microescala [3H] usando uma ferramenta para criação de região de item de menu determinação da região. Atribua um número a cada área selecionada, clicando no número sob o rótulode item de menu.</li>
		<li>Exportar os valores de OD para cada ponto de calibração padrão clicando em arquivo | E xportar | relatório 2D região. Transferência de valores de haste para uma planilha e normalizar pelo tamanho da área selecionada. Realize a regressão linear para obter uma curva padrão para uma análise mais aprofundada densitométricos. Nota: Certifique-se de que as áreas selecionadas são rotuladas, para identificar os correspondentes valores ROD e amostras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar a quantificação de autoradiograms usando o proprietário software de imagem, selecionando a região de interesse (ROI) usando uma ferramenta de criação de região em cada seção e medindo suas ODs. Selecione a mesma região em cada seção, criando um modelo para a região de interesse, que é copiado e ajustado manualmente para pequenas variações na anatomia do cérebro para cada autoradiogram. Identifica a anatomia do ROI por comparação de autoradiograms com um cérebro atlas18. Quando vários tratamentos são comparados, efectuar a análise cegos e randomizados para evitar seleção tendenciosa de ROIs.</li>
	<li>Exportar valores ROD e tamanhos de áreas selecionadas em uma planilha clicando arquivo | E xportar | relatório 2D região.</li>
	<li>Divida a haste medida do ROI selecionados por sua área para obter a densidade por área específica.</li>
	<li>Medir a haste do fundo da placa e exportar valores correspondentes de ROD e tamanho da área em uma planilha. Subtrai o sinal do fundo de cada valor de haste de cada ROI.</li>
	<li>Média as hastes de repetições de técnicas, ou seja, seção Replica usando tecido do mesmo animal.</li>
	<li>Usar a curva padrão para converter as hastes em unidades de radioligantes binding, i. e., equivalentes de tecido nCi/mg (TE). Nota: O termo TE é usado porque as normas são geradas com materiais simulando tecido.</li>
	<li>Expressam ligação pela conversão do ICN/mg para nmol/mg TE de acordo com a atividade específica do radioligantes (equação 1). <img alt="Fórmula de cálculo de ligação de ligantes, equação que descreve nmol/mg TE, relevante para o estudo bioquímico." src="/files/ftp_upload/58879/58879eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation">(1)</li>
	<li>Para obter valores de ligação específica, subtrai inespecificas de ligação total.</li>
	<li>Média a vinculação de cada biológico replicar usando a média de técnicos Replica de cada animal (obtido na etapa 5.6).</li>
</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

A qualidade de um ensaio de eosina mais frequentemente é determinada pela sensibilidade do radioligantes. Um grande fator que contribui é o radioisótopo selecionado, que é dado pela disponibilidade de ligantes conhecidos ou pela viabilidade de técnicas específicas de rotulagem para produzir ligantes com atividade específica apropriada (ou seja, a quantidade de radioatividade por mole de unidade de um radioligantes)23e com quantidades limitadas de degradação química. Um grande número de ra...

Autoradiografia é um método que fornece imagens de decaimento radioativo. A técnica é usada rotineiramente para estudar a distribuição de tecido de uma proteína de interesse em vitro com base em uma interação farmacológica específica entre um composto marcadas com radioisótopos e seu destino. Isto fornece informação directa sobre a seletividade do ligante para o alvo. Em vitro autoradiografia pode também ser utilizada para a determinação quantitativa dos parâmetros de ligação farmacológica de radioligands, tais como a constante de dissociação (Kd) e a densidade dos sítios de ligação (Bmáx), bem como para a determinação a constante de inibição (Ki) de concorrentes ligantes1,2. Comparado aos tradicionais homogenate radioligantes vinculação, autoradiografia tem a vantagem de ser capaz de visualizar a anatomia espacial e dando detalhes sucintas de padrões de expressão regional3. O método de autoradiografia, portanto, é uma alternativa relevante de imunocitoquímica, especialmente na ausência de um anticorpo validado. Autoradiografia é facilmente implementada em um laboratório de radioisótopos padrão dado a disponibilidade de um radioligantes adequado com a necessária especificidade farmacológica, acesso a um criostato micrótomo para a preparação de cortes de tecido e uma imagem adequada dispositivo que é capaz de analisar a distribuição de radioatividade nas seções respectivas tecido. Nomeadamente, um critério importante de seleção para o radioligantes é uma quantidade limitada de ligação a sites não-alvo. Isto pode ser para outras proteínas, membranas ou materiais como plástico ou filtros e é coletivamente conhecido como inespecificas. Geralmente, inespecificas é não saturável, mas podem ser saturável se envolve uma proteína específica de fora do alvo. A melhor forma de validar a verdadeira ligação específica é comparar aos tecidos falta o alvo, por exemplo, geneticamente projetado tecido (nocaute)4.
Aqui, a metodologia é ilustrada com a eosina caracterização do sítio de ligação de alta afinidade para ácido γ-hidroxibutírico (GHB) o cérebro de mamíferos. Compreender a interação farmacológica entre o GHB e o seu sítio de ligação é de relevância como o GHB é uma droga ambos clinicamente útil no tratamento da narcolepsia e alcoolismo5, mas, também, um constituinte natural do cérebro de mamíferos e um recreio Droga,6. Locais de alta afinidade GHB obrigatórios foram primeiro descritos usando vinculação de GHB [3H] de cérebro de rato homogenate7. Ao longo dos anos, mais estudos autoradiografia com [3H] GHB e o análogo [3H] NCS-382 mostrou uma alta densidade de binding sites em regiões prosencéfalo de rato8,9,10, rato9 , cérebro de macaco/humano e1112de porco. No entanto, a identidade molecular e a relevância funcional exata desses sites de ligação permaneceram indescritíveis.
Com a intenção de caracterizar ainda mais os sítios de ligação e para facilitar os estudos sobre o papel fisiológico de GHB, foram desenvolvidos vários radioligands, incorporando diferentes isótopos dotados com afinidades diferentes ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA e [125eu] BnOPh-GHB)13,14,15,16(revisto em17) (Figura 1). A combinação de radioligands de alta afinidade seletiva e uma densidade muito alta de tecido de binding sites permitiram a produção de imagens de alta qualidade usando o fósforo de imagem técnica9,11. Juntamente com um resumo dos pontos na criação de uma experiência de eosina e uma ilustração para exemplificar detalhes práticos, a seção de discussão enfatizará i) a escolha do radionuclídeo, ii) a escolha das condições de ensaio e iii) a utilização de fósforo placas de imagem contra a película de raio x. O objetivo geral deste trabalho é fornecer detalhes técnicos, metodológicos e científicos sobre a técnica de autoradiografia para informar sobre a distribuição tecidual e análise farmacológica de alvos de proteína.

<table><tbody><tr><td>Etanol absoluto</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BAS-TR2040 Placa de imagem</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28956481</td><td>20x40 cm - Sensível ao trítio</td></tr><tr><td>Acetato de violeta Cresyl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>DPX (meio de montagem não aquoso para microscopia)</td><td>Merck Millipore</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus lâminas</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>lâminas de microscópio</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Conjunto de coloração manual de lâminas</td><td>Sakura Finetek Dinamarca ApS</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tritium Standard em Glas</td><td>Produtos químicos radiomarcados americanos, Inc.</td><td>ART 0123</td><td></td></tr><tr><td>Substituto de xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5597</td><td></td></tr></tbody></table>

autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Em vitro autoradiografia pretende visualizar a distribuição anatômica de uma proteína de interesse em tecido de animais experimentais, bem como os seres humanos. O método baseia-se a vinculação específica de um radioligantes ao seu alvo biológico. Portanto, seções congeladas do tecido são incubadas com radioligantes solução, e a ligação para o destino é posteriormente localizada por detecção de decaimento radioativo, por exemplo, usando filme fotossensível ou imagem de placas de fósforo. Autoradiograms Digitas resultantes exibem notável resolução espacial, que permite a quantificação e localização da ligação de radioligantes em estruturas anatômicas distintas. Além disso, quantificação permite a caracterização farmacológica de afinidade de ligante através de constantes de dissociação (Kd), constantes de inibição (Keu), bem como a densidade dos sítios de ligação (Bmáx) em tecidos selecionados. Assim, o método fornece informações sobre localização de alvo e seletividade de ligante. Aqui, a técnica é exemplificada com eosina caracterização do ácido de alta afinidade γ-hidroxibutírico (GHB) vinculação sites no tecido do cérebro de mamíferos, com ênfase especial em considerações metodológicas sobre o ensaio parâmetros, a escolha do radioligantes e o método de deteção.

Usando o protocolo descrito, a distribuição anatômica dos sites alta afinidade de ligação GHB foi visualizada com o análogo GHB marcadas com radioisótopos [3H] HOCPCA no cérebro de rato, que foi cortado em secções coronais, sagitais e horizontais (Figura 3 ). Observaram-se altos níveis de vinculação no hipocampo e córtex, ligação inferior no corpo estriado e não foi detectados no cerebelo, correspondente aos padrões de expressão relatada anterior d...

O método de autoradiografia é rotineiramente usado para estudar a ligação de radioligands para cortes de tecido para determinação da farmacologia qualitativa ou quantitativa.

Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Autordiografia é uma técnica poderosa e simples para estudar a distribuição de sítios de ligação proteica em tecidos usando radiolig e para o alvo. Também é uma alternativa adequada à imunohistoquímica. Esta técnica visualiza a expressão proteica com resolução espacial através de imagens digitais que é mais rápida do que a exposição cinematográfica tradicional.Também pode ser usado para análise farmacológica de alvos proteicos. O método envolve tecidos de camundongos montados em vidro, mas podem ser estendidos a outras espécies ou até mesmo a células cultivadas em deslizamentos de tampas. Demonstrando que o procedimento será de Nane Griem-Krey, uma estudante de doutorado no meu laboratório.Para começar, submergir o tecido em gelo seco em pó para congelá-lo. Transfira o tecido congelado diretamente para um criostat que é definido para menos 20 graus Celsius. Deixe o tecido aclimatar a menos 20 graus Celsius no criostat por 20 minutos.Em seguida, cubra o suporte tecidual com o meio de incorporação fora do criostat e coloque rapidamente a amostra de tecido congelado na orientação desejada enquanto o meio de incorporação ainda é líquido. Transfira o suporte tecidual de volta para o criostat e exponha o meio de incorporação a temperaturas abaixo de menos 10 graus Celsius para endurecimento. Posicione o suporte tecidual no microtome do criostat.Ajuste a orientação do tecido para evitar seções inclinadas. Corte o tecido com a orientação de um atlas estereotaxico em seções de espessura desejada e desdobre a seção com uma pequena escova, se necessário. Descongele a seção em um slide de microscópio.Em seguida, recolhem sequencialmente as seções da região de interesse para a repetição técnica desejada. Deixe as seções nos slides secarem por uma hora antes de manusear mais. Em um laboratório de radioatividade certificado, use um lápis para rotular os slides com as condições experimentais.Coloque os slides horizontalmente em bandejas de plástico. Aplique cuidadosamente um volume apropriado de tampão SA ajustado ao alvo em questão às seções montadas nos slides. Certifique-se de que cada seção está completamente coberta.Para a determinação de vinculação não específica, suplemente o tampão SA com uma concentração relevante de composto não rotulado. Em seguida, cubra as bandejas com tampas para evitar a evaporação. Pré-incubar a uma temperatura relevante por 30 minutos em um agitador de placas definido a 20 rpm.Em seguida, despeje o líquido de pré-incubação de cada slide e transfira os slides de volta para a bandeja de plástico. Cubra imediatamente as seções completamente com a concentração relevante de radiolig e no buffer SA. Para a determinação de vinculação não específica, complemente radiolig e solução com uma concentração relevante de composto não rotulado.Cubra as bandejas com tampas e incubar sob as condições desejadas com agitação suave constante a 20 rpm. Depois disso, despeje a solução de incubação e transfira os slides para um rack de slides de microscópio. Lave imediatamente os slides.Para o protocolo GHB, lave duas vezes com o tampão SA gelado por 20 segundos e enxágue duas vezes mergulhando o rack de slides em bandejas cheias de água gelada e destilada. Posicione os slides verticalmente em racks e o ar seque por pelo menos uma hora. Em seguida, transfira os slides para um fixador contendo paraformaldeído para fixação durante a noite à temperatura ambiente.No dia seguinte, transfira os slides para uma caixa de desiccator contendo gel de sílica à temperatura ambiente. Deixe os slides na caixa do desiccator por três horas para eliminar a umidade. Primeiro, coloque as seções em uma fita de placa de imagem protegida por radiação com o tecido virado para cima.Inclua uma microescala radioativa em cada para quantificação subsequente de radiolig e vinculação. Imediatamente antes do uso, carregue a placa de imagem de fósforo sensível ao trítio na máquina de imagem fosfora e exponha-a à luz infravermelha visível de acordo com as instruções do fabricante para apagá-la. Em seguida, remova a placa de imagem da máquina de imagem fosfora e coloque-a imediatamente sobre as seções do.Certifique-se de que o está completamente fechado. Exponha as seções à placa de imagem fosfora para o tempo de exposição otimizado à temperatura ambiente enquanto estiver protegido da luz. Após a exposição, abra cuidadosamente o no escuro e transfira imediatamente a placa de imagem para a caixa escura de um imager fosforo.Escaneie a placa na mais alta resolução possível para obter uma imagem digital. Para começar, abra um programa de análise de imagem apropriado. Determine as densidades ópticas relativas para cada padrão de calibração selecionando a determinação da região do item do menu.Selecione a ferramenta para criação de região e use-a para selecionar uma área de tamanho igual para cada ponto da microescala radioativa. Atribua um número a cada área selecionada clicando no número no rótulo do item do menu. Clique em Exportação de Arquivos e, em seguida, Relatório de Região 2D para exportar os valores OD para cada ponto do padrão de calibração.No software de imagem proprietário, use uma ferramenta de criação de região para selecionar a região de interesse em cada seção e medir seus ODs para começar a realizar a quantificação dos autoradiogramas. Selecione a mesma região em cada seção criando um modelo para a região de interesse e copie e ajuste-a a pequenas variações na anatomia cerebral em cada autordiograma. Depois disso, clique em Relatório de Região de Exportação de Arquivos 2D para exportar os valores e tamanhos de ROD das áreas selecionadas em uma planilha.Determine a vinculação do radioligand conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a distribuição anatômica dos locais de ligação GHB de alta afinidade são visualizadas com o HOCPCA radiolatroboado análogo GHB em um cérebro de camundongo que foi cortado em seções coronais, sagitas e horizontais. Altos níveis de ligação são vistos no hipocampo e córtex, enquanto níveis de ligação mais baixos são vistos no estriado e nenhuma ligação é detectada no cerebelo.Como mostrado aqui, as estruturas anatômicas podem ser visualizadas usando diferentes planos e a integridade anatômica pode ser suportada por manchas violetas de cresito. Autordiogramas representativos de um rato, um rato e um porco ilustram a conservação evolutiva dos locais de ligação ghb de alta afinidade no cérebro mamífero. Os locais de ligação radioativa hocpca são detectados em todas as três espécies que permitem a comparação da anatomia cerebral bruta entre eles.Os sites de ligação GHB de alta afinidade são sondados com radioligands GHB que exibem diferentes afinidades para os locais de ligação, mas atividades específicas comparáveis. O HOCPCA radioativo é dotado de alta sensibilidade e excelente relação sinal/ruído. Devido à menor sensibilidade do NCS-382 radioativo, devem ser utilizadas concentrações radioligas mais elevadas para obter níveis semelhantes de vinculação.Radiolig e concentrações ainda mais altas são necessárias para que o GHB radioativo atinja níveis de ligação comparáveis. No entanto, as concentrações de radiolig e de radiolig mais altas também aumentam o nível de ligação não específica com uma relação sinal/ruído consequentemente menor. É importante otimizar as condições de ensaio, como o tempo de concentração e concentração, lavagem e exposição para obter o melhor sinal para as relações de ruído e também é muito importante lembrar de apagar a placa antes.O procedimento pode ser estendido a condições in vivo para ter uma ideia sobre a ligação composta em um animal vivo que poderia ser útil para projetos de descoberta. Lembre-se de trabalhar em um laboratório com material radioativo completo certificado e usar roupas protetoras ao manusear radioatividade ou paraformaldeído.

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Research

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Neuroscience

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Aqui, descrevemos um método de imagem de alto teor para quantificar o transporte dos mutantes rodopsina associado com retinite pigmentosa. Uma análise de múltiplos comprimentos de onda pontuação foi utilizada para quantificar proteína rodopsina na superfície da célula ou a célula inteira.

Um ensaio de transporte Rhodopsin por análise de imagem de alto teor

Aqui, nós representamos um protocolo para o radioolabelling totalmente automatizado de [11C] SNAP-7941 e a análise da cinética em tempo real deste Pet-Tracer em P-GP expressando e não-expressando pilhas.

Aspecto técnico da síntese automatizada e avaliação cinética em tempo real de [11C] SNAP-7941

Descrevemos protocolos para avaliar o grau de transdução por peptídeos penetrantes por células utilizando sistemas de imagem ex vivo seguidos de incorporação de parafina, secção e microscopia fluorescente confocal usando peptídeos cardíacos como exemplo. Em nosso protocolo, um único animal pode ser usado para adquirir ambos os tipos de avaliação de imagem dos mesmos órgãos, reduzindo o número de animais necessários para estudos pela metade.

In Vivo Imagem de Eficiências de Transdução de Peptídeo de Direcionamento Cardíaco

Este protocolo apresenta um conjunto de experimentos adotados para a avaliação de peptídeos anticâncer fotocomutáveis, que podem ser utilizados na triagem pré-clínica destes compostos. Isso inclui a avaliação da citotoxicidade em culturas de células 2D e 3D, a avaliação da eficiência de fotoisomerização ex vivo (tecido modelo) e a eficácia in vivo .

Avaliação in vitro e in vivo de compostos biologicamente ativos fotocontrolados - potenciais candidatos a fármacos para a fotofarmacologia do câncer

Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D2O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).

Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar quatro radiotraçadores de carbono-11 por meio do "método de loop" [11C]metilação. Descrevemos o procedimento para sintetizar [11C]ER-176, com dados para três radiotraçadores adicionais: [11C]MRB, [11C]mHED e [11C]PiB. O método de loop fornece uma síntese eficiente com rendimentos radioquímicos aumentados contra a metilação tradicional do vaso de reação [11C].

Aumentando a eficiência e os rendimentos de radiomarcação de radioligantes de carbono-11 para pesquisa clínica usando o método de loop

Aprenda a técnica de autoradiografia para visualizar sítios de ligação de proteínas em tecidos de camundongo com alta resolução espacial. Este método oferece uma alternativa rápida à imunohistoquímica para análises farmacológicas.

Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

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