Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

Autordiografia é uma técnica poderosa e simples para estudar a distribuição de sítios de ligação proteica em tecidos usando radiolig e para o alvo. Também é uma alternativa adequada à imunohistoquímica. Esta técnica visualiza a expressão proteica com resolução espacial através de imagens digitais que é mais rápida do que a exposição cinematográfica tradicional.

Também pode ser usado para análise farmacológica de alvos proteicos. O método envolve tecidos de camundongos montados em vidro, mas podem ser estendidos a outras espécies ou até mesmo a células cultivadas em deslizamentos de tampas. Demonstrando que o procedimento será de Nane Griem-Krey, uma estudante de doutorado no meu laboratório.

Para começar, submergir o tecido em gelo seco em pó para congelá-lo. Transfira o tecido congelado diretamente para um criostat que é definido para menos 20 graus Celsius. Deixe o tecido aclimatar a menos 20 graus Celsius no criostat por 20 minutos.

Em seguida, cubra o suporte tecidual com o meio de incorporação fora do criostat e coloque rapidamente a amostra de tecido congelado na orientação desejada enquanto o meio de incorporação ainda é líquido. Transfira o suporte tecidual de volta para o criostat e exponha o meio de incorporação a temperaturas abaixo de menos 10 graus Celsius para endurecimento. Posicione o suporte tecidual no microtome do criostat.

Ajuste a orientação do tecido para evitar seções inclinadas. Corte o tecido com a orientação de um atlas estereotaxico em seções de espessura desejada e desdobre a seção com uma pequena escova, se necessário. Descongele a seção em um slide de microscópio.

Em seguida, recolhem sequencialmente as seções da região de interesse para a repetição técnica desejada. Deixe as seções nos slides secarem por uma hora antes de manusear mais. Em um laboratório de radioatividade certificado, use um lápis para rotular os slides com as condições experimentais.

Coloque os slides horizontalmente em bandejas de plástico. Aplique cuidadosamente um volume apropriado de tampão SA ajustado ao alvo em questão às seções montadas nos slides. Certifique-se de que cada seção está completamente coberta.

Para a determinação de vinculação não específica, suplemente o tampão SA com uma concentração relevante de composto não rotulado. Em seguida, cubra as bandejas com tampas para evitar a evaporação. Pré-incubar a uma temperatura relevante por 30 minutos em um agitador de placas definido a 20 rpm.

Em seguida, despeje o líquido de pré-incubação de cada slide e transfira os slides de volta para a bandeja de plástico. Cubra imediatamente as seções completamente com a concentração relevante de radiolig e no buffer SA. Para a determinação de vinculação não específica, complemente radiolig e solução com uma concentração relevante de composto não rotulado.

Cubra as bandejas com tampas e incubar sob as condições desejadas com agitação suave constante a 20 rpm. Depois disso, despeje a solução de incubação e transfira os slides para um rack de slides de microscópio. Lave imediatamente os slides.

Para o protocolo GHB, lave duas vezes com o tampão SA gelado por 20 segundos e enxágue duas vezes mergulhando o rack de slides em bandejas cheias de água gelada e destilada. Posicione os slides verticalmente em racks e o ar seque por pelo menos uma hora. Em seguida, transfira os slides para um fixador contendo paraformaldeído para fixação durante a noite à temperatura ambiente.

No dia seguinte, transfira os slides para uma caixa de desiccator contendo gel de sílica à temperatura ambiente. Deixe os slides na caixa do desiccator por três horas para eliminar a umidade. Primeiro, coloque as seções em uma fita de placa de imagem protegida por radiação com o tecido virado para cima.

Inclua uma microescala radioativa em cada para quantificação subsequente de radiolig e vinculação. Imediatamente antes do uso, carregue a placa de imagem de fósforo sensível ao trítio na máquina de imagem fosfora e exponha-a à luz infravermelha visível de acordo com as instruções do fabricante para apagá-la. Em seguida, remova a placa de imagem da máquina de imagem fosfora e coloque-a imediatamente sobre as seções do.

Certifique-se de que o está completamente fechado. Exponha as seções à placa de imagem fosfora para o tempo de exposição otimizado à temperatura ambiente enquanto estiver protegido da luz. Após a exposição, abra cuidadosamente o no escuro e transfira imediatamente a placa de imagem para a caixa escura de um imager fosforo.

Escaneie a placa na mais alta resolução possível para obter uma imagem digital. Para começar, abra um programa de análise de imagem apropriado. Determine as densidades ópticas relativas para cada padrão de calibração selecionando a determinação da região do item do menu.

Selecione a ferramenta para criação de região e use-a para selecionar uma área de tamanho igual para cada ponto da microescala radioativa. Atribua um número a cada área selecionada clicando no número no rótulo do item do menu. Clique em Exportação de Arquivos e, em seguida, Relatório de Região 2D para exportar os valores OD para cada ponto do padrão de calibração.

No software de imagem proprietário, use uma ferramenta de criação de região para selecionar a região de interesse em cada seção e medir seus ODs para começar a realizar a quantificação dos autoradiogramas. Selecione a mesma região em cada seção criando um modelo para a região de interesse e copie e ajuste-a a pequenas variações na anatomia cerebral em cada autordiograma. Depois disso, clique em Relatório de Região de Exportação de Arquivos 2D para exportar os valores e tamanhos de ROD das áreas selecionadas em uma planilha.

Determine a vinculação do radioligand conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a distribuição anatômica dos locais de ligação GHB de alta afinidade são visualizadas com o HOCPCA radiolatroboado análogo GHB em um cérebro de camundongo que foi cortado em seções coronais, sagitas e horizontais. Altos níveis de ligação são vistos no hipocampo e córtex, enquanto níveis de ligação mais baixos são vistos no estriado e nenhuma ligação é detectada no cerebelo.

Como mostrado aqui, as estruturas anatômicas podem ser visualizadas usando diferentes planos e a integridade anatômica pode ser suportada por manchas violetas de cresito. Autordiogramas representativos de um rato, um rato e um porco ilustram a conservação evolutiva dos locais de ligação ghb de alta afinidade no cérebro mamífero. Os locais de ligação radioativa hocpca são detectados em todas as três espécies que permitem a comparação da anatomia cerebral bruta entre eles.

Os sites de ligação GHB de alta afinidade são sondados com radioligands GHB que exibem diferentes afinidades para os locais de ligação, mas atividades específicas comparáveis. O HOCPCA radioativo é dotado de alta sensibilidade e excelente relação sinal/ruído. Devido à menor sensibilidade do NCS-382 radioativo, devem ser utilizadas concentrações radioligas mais elevadas para obter níveis semelhantes de vinculação.

Radiolig e concentrações ainda mais altas são necessárias para que o GHB radioativo atinja níveis de ligação comparáveis. No entanto, as concentrações de radiolig e de radiolig mais altas também aumentam o nível de ligação não específica com uma relação sinal/ruído consequentemente menor. É importante otimizar as condições de ensaio, como o tempo de concentração e concentração, lavagem e exposição para obter o melhor sinal para as relações de ruído e também é muito importante lembrar de apagar a placa antes.

O procedimento pode ser estendido a condições in vivo para ter uma ideia sobre a ligação composta em um animal vivo que poderia ser útil para projetos de descoberta. Lembre-se de trabalhar em um laboratório com material radioativo completo certificado e usar roupas protetoras ao manusear radioatividade ou paraformaldeído.