Name: Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a induzir encefalomielite autoimune experimental em camundongos para estudar esclerose múltipla. Este método utiliza citometria de fluxo e PCR quantitativo para avaliar distribuição de células imunes e níveis de citocinas em diferentes tecidos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Grupo de Treinamento em Pesquisa Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) da Fundação Else Kröner-Fresenius (EKFS) e pelo "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" do Estado de Hesse.

ÉTICA DECLARAÇÃO: Nossos procedimentos experimentais são aprovados pelo Comitê do Regierungspräsidium Darmstadt (Alemanha) Ética e confirme com os regulamentos nacionais e europeias. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais e reduzir o número de animais utilizados. 1. EAE Modelo <ol><li> Indução do modelo de EAE <ol><li> Use fêmea 129S4 / SvJae × ratinhos C57BL / 6 de 10 a 13 semanas de idade, para a indução de EAE. </li><li> Dar aos ratos uma injecção subcutânea, na parte superior e inferior das costas, da encef MOG 35 - peptídeo 55 (mielina de oligodendrócitos glicoproteína) (200 ug), emulsificado em 200 uL de adjuvante completo Freund`s (CFA) contendo 400 ug de Mycobacterium tuberculosis. Observação: Como um controlo simulado negativo, não-indução da doença, o adjuvante incompleto de Freund contendo Mycobacterium tuberculosis, no mesmo volume e pela mesma via, pode ser utilizado. </li><li> TherEDepois, e novamente 24 horas mais tarde, os ratinhos dar uma injecção intraperitoneal de toxina da tosse convulsa (no total 0,2 mg, diluído em 200 ul de solução salina tamponada com fosfato, PBS). Use ratos não tratados como grupo de controlo, para poder comparar doentes com animais saudáveis. Nota: É também possível induzir EAE com 200-300 ug MOG 35-55 péptido, 300-500 ug de Mycobacterium tuberculosis em CFA e 0,2 - 0,3 fig de toxina da tosse convulsa, em um volume de 0,1 - 0,2 ml por injecção. </li><li> Começando uma semana após a injecção, examine ratinhos diariamente para sintomas clínicos (ver o passo 1.2.1) Nota: No dia de início da doença varia em diferentes experimentos, mas nas condições em nosso laboratório, este é por volta do dia 11 e, portanto, aqui dia 14 é definida como 3 dias após o início da doença. Todos os ratinhos no presente estudo desenvolvido sintomas clínicos. </li></ol></li><li> Scoring dos ratos <ol><li> Classificar os sintomas clínicos por escores clínicos como segue:0) não há sinais, 0,5) paralisia distal da cauda, ​​1) paralisia completa da cauda, ​​1.5) da cauda flácida e leve fraqueza das patas posteriores, 2) da cauda flácida e fraqueza grave de patas traseiras, 2.5) da cauda flácida e paralisia do uma perna, 3) da cauda flácida e paralisia de ambas as patas traseiras, 3.5) paralisia de ambos os membros posteriores e fraqueza de um dos membros tona (ratos alcançar este resultado foram sacrificados, de acordo com diretrizes éticas locais). </li></ol></li></ol> 2. Preparação de células individuais para Análise de Citometria de Fluxo Nota: A mistura de anticorpo consiste de um uL de CD45-Vioblue, 2 ul CD8-eFluor650, 0,5 ul CD11b-eFluor605, 0,5 ul F4 / 80-PE-Cy7, 1 ul CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 ul CD11c -AlexaFluor700, 1 uL de CD19-APC-H7 e 1 ul Ly6G-APC-Cy7. Nota: Se você tomar sangue, gânglios linfáticos, baço e medula espinhal, em seguida, o procedimento é o seguinte: Os ratos são profundamente anestesiados com uma combinação de isoflurane (2% em carbogénio por minuto) e cetamina (100 mg / kg de peso corporal). Em seguida, abra o tórax, remover o sangue com uma vara de intracardíaca e perfundir ratos intracardial com PBS frio. Em seguida, remover os nódulos linfáticos e baço, seguido por, finalmente, a medula espinhal. Se você não precisa perfundir os ratos intracardial então eutanásia os ratos sob anestesia profunda de luxação do pescoço. <ol><li> Isolamento de esplenócitos <ol><li> Anestesiar ratos com uma combinação de isoflurano (2% em carbogénio por minuto) e cetamina (100 mg / kg de peso corporal). </li><li> área da incisão molhado com 80% isopropanol para evitar qualquer contaminação com cabelos e abrir o tórax longitudinal, sem perfurar tecidos mais profundos, com uma tesoura. </li><li> Perfundir ratos intracardial com PBS frio pH 7.0 23. Nota: O baço está localizado no quadrante abdominal superior, esquerda abaixo da caixa torácica. Se apenas o baço é para ser estudada, esse órgão pode ser removido antes da perfusão, a fim de Retain todos os tipos de células de interesse. </li><li> Remover o baço e cortado aproximadamente 1/8 e pesá-lo. Conservar a amostra em PBS em gelo. </li><li> Espremer o tecido do baço através de uma peneira de malha de 70 um (colocada sobre um tubo de 50 ml), utilizando o êmbolo de uma seringa de 2 ml. </li><li> Lava-se a malha com 5 ml de PBS. Centrifugar a 1.800 xg durante 3 min. Ressuspender o sedimento em 500 ul de solução de lise. Nota: Nesta fase, pode ser necessário fazer uma contagem de células diferenciais se, depois, um método de análise FACS alternativa é usado que não empregam contas (ver secção 3). </li><li> Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (TA) e adicionar 500 ul de PBS. Centrifuga-se durante 6 min a 650 x g à temperatura ambiente (TA). </li><li> Repita o passo de lavagem com 500 mL PBS. Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 100 uL de 0,2% de albumina de soro bovino (BSA) / PBS, adiciona-se 2 ul de um receptor Fc (FcRI) tampão de bloqueamento e incubar durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 13 ul ummistura tibody, incubar 15 min a RT no escuro, adicionar 500 ul de PBS e centrifuga-se durante 6 min a 650 xg à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante. Nota: O procedimento de coloração do fabricante recomenda uma única lavagem, mas a redução da coloração de fundo adicional pode ser conseguida por, opcionalmente, repetir o passo de lavagem mais uma ou duas vezes. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS (tampão ou, possivelmente, funcionando para a separação de proteínas, para, potencialmente, reduzir a aglutinação de células) e transferi-lo para o tubo de citometria de fluxo. Manter as células no gelo. </li></ol></li><li> Isolamento de células dos nódulos linfáticos <ol><li> Anestesiar ratos com uma combinação de isoflurano (2% em carbogénio por minuto) e cetamina (100 mg / kg de peso corporal). </li><li> área da incisão molhado com 80% de isopropanol e abrir o tórax longitudinalmente com uma tesoura. Perfundir ratos intracardial com PBS frio pH 7.0 23. </li><li> Para isolar o linfonodo inguinal, remova cuidadosamente a pele na região do oip e escolher o linfonodo com cuidado para fora do tecido gorduroso com uma pinça. Pesar o linfonodo inguinal e armazenar a amostra em PBS em gelo. Nota: Foram utilizados linfonodos inguinais em nossos estudos porque O`Connor et al. descobriram que um elevado número de monócitos activados, macrófagos, neutrófilos e células T estavam todos presentes nos nódulos linfáticos inguinais, após a indução da EAE 24. </li><li> Espremer o nó de linfa através de uma peneira de malha de 70 um (colocada sobre um tubo de 50 ml) usando o êmbolo de uma seringa de 2 ml. </li><li> Lava-se a malha com 5 ml de PBS. Centrifugar a 2400 xg durante 8 minutos. Ressuspender o sedimento celular em 100 uL de 0,2% de BSA / PBS, adiciona-se 2 ul de tampão de bloqueio FcRI e incubar durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 13 ul de mistura de anticorpo, incubar 15 min a RT no escuro, adicionar 500 mL de PBS e centrifuga-se durante 6 min a 650 xg à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 300 ul de PBS (ou um tampão de corrida adequado) e transferi-lopara um tubo de citometria de fluxo. </li></ol></li><li> O isolamento de células de sangue <ol><li> Adicionar 50 ul de HEPES 20 mM e 50 uL de sangue (estabilizada com EDTA) e adicionar 500 ul de solução de lise. Incubar durante 10 min à TA e adicionar 500 ul de PBS. Centrifuga-se durante 6 min a 650 xg à temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante e repita o passo de lavagem. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 100 uL de 0,2% de BSA / PBS, adiciona-se 2 ul de tampão de bloqueio FcRI e incubar durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 13 ul de mistura de anticorpo, incubar 15 min a RT no escuro, adicionar 500 mL de PBS e centrifuga-se durante 6 min a 650 xg à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 300 ul de PBS e transferi-lo para o tubo de citometria de fluxo. </li></ol></li><li> Isolamento de células da espinal medula <ol><li> Anestesiar ratos com uma combinação de isoflurano (2% em carbogénio por minuto) e cetamina (100 mg / kg de peso corporal). </li><li> área da incisão molhado com 80% de isopropanol e o tórax aberto longitudinalmentecom uma tesoura. Perfundir ratos intracardial com PBS frio pH 7.0 23. </li><li> Molhar área da incisão no dorso e fazer de novo um corte longitudinal, com um bisturi e remover a pele. </li><li> Cortar a parte lombar da coluna vertebral (o qual inerva as patas traseiras) e lave-o com uma seringa PBS-cheia para extrair a medula espinhal. Cortar aproximadamente 1/3 da medula lombar, pesar isso e armazenar a amostra em PBS em gelo. </li><li> Centrifuga-se a 250 xg durante 2 min a 4 ° C. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 500 ul de solução de separação celular e HBSS (1: 1). Adiciona-se 3 mg / ml de colagenase A e 1 unidade / ml de ADNase I, as células de degolar repetido cima e para baixo de pipetagem e incubar durante 30 minutos com agitação a 37 ° C a 400 rpm. Nota: Se preferido, a suspensão de células podem ser eliminados de contaminar a mielina e os restos celulares por centrifugação em gradiente de densidade, que pode melhorar a sensibilidade da medição de citometria de fluxo, deste modo, reduzir o fundo de um autofluorescênciad o número de eventos que precisam ser adquiridos (ver secção 3.5). </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 1 ml de 10% de soro fetal de vitelo (FCS) / meio Dulbecco mínimo essencial (DMEM) e degolar as células novamente repetido por cima e para baixo de pipetagem. </li><li> Centrifugar a 250 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Repita o passo de lavagem. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de PBS e espremer medula espinal por meio de uma peneira de malha de 70 um (colocada sobre um tubo de 50 ml) usando o êmbolo de uma seringa de 2 ml. </li><li> Lava-se a malha com 4 ml de PBS. Centrifugar a 1.800 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 100 uL de 0,2% de BSA / PBS, adiciona-se 2 ul FcRI reagente de bloqueio e incubar durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 13 ul de mistura de anticorpo, incubar 15 min a RT no escuro, adicionar 500 mL de PBS e centrifuga-se durante 6 min a 650 xg à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante, ressuspender o pelle celulart em 500 ul de PBS (ou um tampão de corrida adequado) e transferi-lo para o tubo de citometria de fluxo. </li></ol></li></ol> 3. análise citométrica de fluxo <ol><li> Titular todos os anticorpos de antemão para determinar as concentrações ideais, como descrito por Olesch et al. 25. </li><li> Use esferas de compensação de captura de anticorpos para a compensação de cor única para criar matrizes de compensação multi-cor de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Controlar a calibração do instrumento diária usando esferas específicas de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Directamente antes da citometria de fluxo de medição, adicionar 30 ul de citometria de fluxo padrão de contagem absoluta para as células (para o isolamento ver secção 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) para determinar as contagens de células absolutos. Em vez de usar esferas de contagem as células podem ser contadas. </li><li> Tome-se amostras (células de baço, nódulo linfático e sangue: 100.000 eventos, medula espinhal: 500.000 eventos) em um citômetro de fluxo umND analisar usando o software específico citometria de fluxo. <ol><li> Abra o software de citometria de fluxo e adicionar FCS 3,0 arquivos pressionando o botão &quot;adicionar as amostras&quot;. </li><li> Abra o arquivo adicionado clicando duas vezes. Ajuste os canais para o x e eixo y. Para seleccionar as populações de células de interesse criar um portão (ver Figura 4). </li></ol></li></ol> 4. Análise de PCR quantitativo <ol><li> O isolamento de ARNm e a transcrição para ADNc <ol><li> Extrai-se a partir de ARNm de medula espinal lombar (1/3), baço (1/8) e nódulos linfáticos inguinais por fenol-clorofórmio e precipitado com etanol 26. <ol><li> Para isso, homogeneizar o tecido em 1 ml de guanidina mistura tiocianato-fenol, incubar durante 10 min. Adicionar 200 ul de clorofórmio e incubar outra vez durante 10 min. </li><li> Após um passo de centrifugação (18.000 xg durante 15 min a 4 ° C), lava-se a fase aquosa superior é com 500 uL de isopropanol e centrifugação (18.000 xg durante 8 min a 4° C). </li><li> Lavar o sedimento com 500 ul de etanol e depois de um passo de centrifugação (18000 xg durante 5 min a 4 ° C), secar o sedimento no concentrador de vácuo (5 min a 30 ° C). Em seguida, ressuspender o sedimento em 30 ul de água. </li></ol></li><li> Para extrair o ARNm a partir de sangue, de centrífuga de 500 ul de sangue estabilizado-EDTA (300 xg, 10 min 4 ° C). <ol><li> Aqui o revestimento de Buffy, contendo células brancas do sangue, e dilui-se em 1 ml de solução (150 mM NH 4 Cl, 100 mM de NaHCO3, 0,1 mM de Na-EDTA pH 7,4) de lise. </li><li> Após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, centrifugar as células a 650 xg durante 6 minutos e depois lavar duas vezes com PBS. </li><li> Extrai-se a partir de ARNm de células brancas do sangue (leucócitos), utilizando um kit de extracção de ARN de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Realizar a síntese de ADNc utilizando um kit de síntese de ADNc incluindo hexâmeros aleatórios de acordo com as instruções do fabricante. Use 200 ng mRNA para o CDNUma síntese. </li></ol></li><li> PCR quantitativo <ol><li> Para quantificar a quantidade de um ARNm específico, usar um ADNc ul, 1 uM de avanço / recuo primário e um corante de ligação de acordo com as instruções do fabricante, 27 de ADN fluorescente. Ver Tabela 1 para as sequências para os conjuntos de iniciadores. Medir as CT-valores de IL-1β, IL-6, IL-23, IFN-y, TNFa e PPIA (peptidil-prolil isomerase), utilizando um sistema de PCR quantitativa. </li><li> Para determinar a expressão de ARNm relativa usar o método de CT (limiar de ciclo) comparativo 27. <ol><li> Para isso, normalizar CT-valores dos genes-alvo para os níveis de PPIA expressão subtraindo a média CT-valor de PPIA a partir do gene alvo, tal como descrito em estudos anteriores (Barthelmes et al. 28, SCHIFFMANN et al. 29, SCHIFFMANN et ai. 30). Posteriormente, calcular os assim chamados ΔΔCT valores, usando o que, normalizar os valores ΔCTdos genes alvo a partir de ratinhos EAE para o nível dos genes alvo de ratinhos não tratados expressão, novamente, subtraindo a média ΔCT-valor nos ratinhos não tratados a partir do valor ΔCT-EAE em ratinhos. </li><li> Para obter a expressão de ARNm relativa do gene alvo, calcular a relação com a seguinte fórmula: 2 - ΔΔct. </li></ol></li></ol></li><li> Testar a especificidade de cada iniciador. Determinar o tamanho do fragmento amplificado utilizando um gel de agarose a 2% 31. O tamanho do fragmento é apresentado na Tabela 1. </li></ol>

MJP é consultor da Xellia e da Leo Pharmaceuticals.

O modelo de EAE descrito aqui tem recebido mais atenção como um modelo de MS e é utilizado rotineiramente em testar estratégias terapêuticas para MS 32. A doença do rato apresenta muitas características clínicas e histológicas de MS e é causada pela indução de auto-imunidade a antígenos neuronais. A sensibilidade aos antigénios de mielina está associada com disfunção cerebral barreira sangue e, desse modo, a infiltração de células imunes para o SNC. Nossos resultados mostram que as células imunes aumentar tra...

A esclerose múltipla (MS) e a sua correspondente modelo animal, a encefalomielite autoimune experimental (EAE), mostram alterações neuroinflamação auto-imunes do sistema nervoso central (SNC). Cedo lesões de EM e EAE activas são caracterizadas pela presença de células imunes infiltradas. A etiologia da EM é desconhecida, mas é amplamente consideradas como envolvendo a destruição de mielina mediada por células T auto-reactivas. Estas células T auto-reactivas secretam citoquinas pró-inflamatórias e quimiocinas que atraem outras células imunitárias tais como células B, monócitos e neutrófilos provenientes da circulação. Os monócitos diferenciam-se em macrófagos. O interferão gama (IFN-y) secretado por células T auto-reactivas polariza os macrófagos em macrófagos pró-inflamatórias. As citocinas pró-inflamatórias macrófagos de libertação e de espécies reativas de oxigênio que promovem a apoptose em oligodendrócitos. A morte de oligodendrócitos conduz a desmielinização. Além disso, as células B diferenciam-se em pcélulas LASMA e auto-anticorpos contra a libertação da bainha de mielina, resultando na degradação de mielina. A perda de mielina leva a degradação de axónios e neurónios e, assim, para a formação de locais de lesão no SNC, que representam a característica principal de um MS. No sistema nervoso periférico, as células T e as células B são activadas nos nódulos linfáticos, que proliferam no baço e migram através da circulação para o sistema nervoso central. Os monócitos e neutrófilos proliferam na medula óssea e também migram através da circulação para o sistema nervoso central. Leucócitos extravasamento a partir da medula óssea, baço e nódulos linfáticos para o sangue ou a partir da corrente sanguínea para o SNC é um processo de passos múltiplos que depende de vários factores, incluindo interacções moleculares entre leucócitos e endotélio mediadas por quimiocinas e receptores de quimiocina. A produção de quimiocinas por vários tipos de células podem ser induzidas durante a reactio imuneN por citocinas como factor de necrose tumoral-α (TNFa), IFN-y e interleucina-6 (IL-6), que, subsequentemente, recruta células imunes para o local da inflamação 2,3. Células imunes apresentar um subconjunto de receptores de quimiocina na sua superfície, dependendo do tipo de célula e via de migração para o local inflamatório. Assim, CXCR2, CCR1 e CXCR1 são expressas em neutrófilos maduros na medula óssea e no sangue 4, e a ligação dos seus ligandos, CXCL2, CCL5 ou CXCL6, respectivamente, activa os neutrófilos e promove a sua adesão ao endotélio e, subsequentemente, a migração das células tecidos em 5-9. CCL2 e CCL20 atrair monócitos e células Th1 / Th17 10, que expressam CCR2 11 e 12 CCR6, respectivamente. CCR1 e CCR5, expressas por diferentes tipos de células, incluindo células T, monócitos e macrófagos, 13, ligam-se CCL3, CCL5 e CCL7 e são regulados positivamente durante 14 MS. CXCR3 é expresso em células T e liga-se CCL9, CCL10 eCCL11 15. Uma estratégia principal no tratamento de MS é a depleção de células do sistema imunológico ou a prevenção da infiltração de células imunitárias para o SNC. Por isso, o bloqueio dos receptores de quimioquinas específicas tem sido investigada na EAE. Antagonismo ou eliminação genética de CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 ou CXCR2 19 reduz EAE patologia, ao passo que o antagonismo ou eliminação genética de CCR1 20, CCR5 20 ou CXCR3 21 não reduziu a patologia. Assim, a expressão de receptores específicos de quimiocinas nos leucócitos é crucial para a infiltração do último para o SNC e determina o curso da EAE. A depleção de células imunes é uma estratégia de tratamento eficaz para pacientes com EM, porque as células imunitárias infiltrados libertar citocinas, tais como TNFa, IL-6 e IL-1β, que, por sua vez, promovem o processo inflamatório ou a degradação dos neurónios 22. Além disso, auto-células Th1 IFN-y reactivos solte, que por sua vez estimula os macrófagos para libertar o TNFa, IL-1β e IL-23. Este manuscrito descreve a indução de EAE, a determinação da distribuição de células imunitárias e os níveis de citocinas (ARNm) em vários tecidos em ratinhos EAE. As células foram isoladas em diferentes pontos de tempo durante o curso da doença para fornecer uma visão geral dependente do tempo dos processos inflamatórios que conduzem finalmente à formação de lesões no sistema nervoso central.

<table><tbody><tr><td>Sistema de Detecção de Sequência ABI Prism 7500</td><td>Applied Biosystems, Austin, EUA</td><td></td><td>sistema de PCR quantitativo</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma Aldrich Munique, Alemanha</td><td>A6964</td><td>solução de desprendimento de células</td></tr><tr><td>CD3-PE-CF594</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td>562286</td><td></td></tr><tr><td>CD4-V500</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td>560782</td><td></td></tr><tr><td>CD8-eFluor650</td><td>eBioscience, Frankfurt, Alemanha</td><td>95-0081-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-eFluor605</td><td>eBioscience, Frankfurt, Alemanha</td><td>93-0112-42</td><td></td></tr><tr><td>CD11c-AlexaFluor700</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td>560583</td><td></td></tr><tr><td>CD19-APC-H7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD45-Vioblue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-092-910</td><td></td></tr><tr><td>CompBeads</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td>552843</td><td>contas de compensação</td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Sigma Aldrich Munique, Alemanha</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de contagem absoluta citométrica&nbsp;</td><td>Polyscience, Eppelheim, Alemanha</td><td>BLI-580-10</td><td></td></tr><tr><td>Configuração do citômetro e rastreamento de contas&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich Munique, Alemanha</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit</td><td>Hooke Laboratories, Lawrence, EUA</td><td>EK2110</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE-Cy7&nbsp;</td><td>BioLegend, Fell, Alemanha</td><td>123114</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Síntese de cDNA First Strand&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha</td><td>K1612</td><td></td></tr><tr><td>Fc receptor-1 tampão de bloqueio&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Padrão de contagem absoluta de citometria de fluxo</td><td>Polyscience, Eppelheim, Alemanha</td><td>580</td><td></td></tr><tr><td>Software FlowJo v10&nbsp;</td><td>Treestar, Ashland, EUA</td><td></td><td>software de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>LSRII/Fortessa&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td></td><td>citômetro de fluxo</td></tr><tr><td>Ly6G-APC-Cy7&nbsp;</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td>560600</td><td></td></tr><tr><td>Solução de lisagem</td><td>BD, Heidelberg, Alemanha</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>Maxima SYBR Green&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Alemanha</td><td>K0221</td><td>corante de ligação de DNA fluorescente&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini Kit RNeasy&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>74104</td><td>Kit de extração de RNA</td></tr></tbody></table>

indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

A esclerose múltipla é presumido ser uma doença auto-imune inflamatória, que é caracterizada pela formação de lesões no sistema nervoso central (SNC), resultando na deterioração cognitiva e motora. encefalomielite auto-imune experimental (EAE) é um modelo animal útil de EM, uma vez que também é caracterizada pela formação de lesões no sistema nervoso central, perturbações do motor e também é accionado por meio de reacções auto-imunes e inflamatórias. Um dos modelos de EAE é induzida com um péptido derivado da proteína de mielina de oligodendrócitos (MOG) 35-55 em ratos. Os ratos EAE desenvolver um curso doença progressiva. Este curso é dividido em três fases: a fase pré-clínica (dia 0-9), o início da doença (dia 10-11) e a fase aguda (dias 12-14). MS e EAE são induzidas por células T auto-reactivas que se infiltram no SNC. Estas células T segregam citocinas e quimiocinas que conduzem ao recrutamento de outras células do sistema imunológico. Por conseguinte, a distribuição de células imunes na medula espinal durante as três fases da doença foi investigado. Para realçar o ponto de tempo de doença em que a activação / proliferação / acumulação de células T, células B e monócitos é iniciado, a distribuição de células imunes em nódulos linfáticos, baço e sangue foi também avaliada. Além disso, foram determinados os níveis de diversas citocinas (IL-1, IL-6, IL-23, TNFa, IFN-y) nas três fases da doença, para ganhar conhecimento sobre os processos inflamatórios da doença. Em conclusão, os dados fornecem uma visão geral do perfil funcional das células imunitárias durante EAE patologia.

A Figura 1 apresenta uma visão esquemática dos diferentes métodos descritos neste artigo. 1) Os ratos recebem uma injecção de 35-55 antígeno MOG e desenvolver sintomas clínicos iniciais após 10,7 ± 0,3 dias 28. Um curso da doença representativo de ratos EAE é mostrado na Figura 1. 2) de vários tecidos (baço, nódulos linfáticos, lombar da medula espinal) e no sangue são extraídos a partir de ratinhos...

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

O objetivo geral do modelo de encefalomielite autoimune experimental, ou EAE, é facilitar o estudo dos potenciais mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento da esclerose múltipla. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da esclerose múltipla, como, em qual estágio da doença as células imunes infiltram o sistema nervoso central? A principal vantagem desta técnica é que o modelo EAE imita muitas das características principais da esclerose múltipla, tais como desmielinização e infiltração de células imunes.As implicações desta técnica estendem-se à terapia da esclerose múltipla, pois medicamentos testados com este método já foram aprovados para esta doença. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica teriam dificuldades, pois existem condições rigorosas que precisam ser consideradas ao induzir EAE. Os camundongos devem ser mantidos em um ambiente livre de estresse, e a toxina da coqueluche deve ser preparada recentemente.A demonstração oficial deste método é fundamental, pois o isolamento dos linfonodos e a extração da medula espinhal são difíceis de aprender apenas por meio de descrição. Comece injetando subcutaneamente em camundongos fêmeas com 10 a 13 semanas de idade 200 microgramas de glicoproteína oligodendrocítica da mielina, emulsionados em 200 microlitros de adjuvante completo de Freund, contendo 400 microgramas de micobactéria tuberculosa.Imediatamente e 24 horas depois, injete intraperitonealmente os camundongos com 0,2 microgramas de toxina da coqueluche em 200 microlitros de PBS. É essencial que os camundongos tenham sido adaptados tanto ao manuseio quanto ao ambiente experimental antes da indução de EAE, a fim de minimizar o estresse, que pode impedir o desenvolvimento de sintomas clínicos. Uma semana após a injeção, examine os camundongos diariamente quanto aos sintomas clínicos, conforme descrito na tabela.Para avaliar a população de células imunes do linfonodo induzida por EAE, no ponto temporal apropriado após a indução, umedecer a área da incisão com isopropanol a 80% e remover cuidadosamente a pele sobre a região do quadril. Usando pinças, remover cuidadosamente o linfonodo inguinal do tecido adiposo. Em seguida, pesar o linfonodo e colocar a amostra em PBS sobre gelo.Para analisar as células da medula espinhal, umedecer as costas do animal com isopropanol e usar um bisturi para fazer um corte longitudinal ao longo da coluna vertebral. Em seguida, remover a pele e dissecar a porção lombar da coluna, que inerva as patas traseiras. Lavar a coluna com uma seringa cheia de PBS para extrair a medula espinhal.Após remover aproximadamente 1/3 da medula lombar, pese o fragmento medular e armazene o tecido em PBS sobre gelo. Para analisar a população de células imunes do baço, abra o tecido para obter acesso à parte inferior do abdômen. Em seguida, remova o baço e corte cerca de 1/8 do tecido.Pese o fragmento de ba&ccedil;o e armazene o tecido em PBS sobre gelo. Em seguida, use o &ecirc;mbolo de uma seringa de dois mL para macerar o restante do tecido atrav&eacute;s de uma peneira de malha de 70 m&iacute;con em um tubo de 50 mililitros, seguido por uma lavagem da peneira com cinco mililitros de PBS. Centrifugue as c&eacute;lulas filtradas.Resuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de lise celular e transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro. Após 10 minutos em temperatura ambiente, lave as células duas vezes em 500 microlitros de PBS. Após a segunda lavagem, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de BSA 0,2% em PBS e adicione dois microlitros de tampão bloqueador do receptor Fc um às células.Após 15 minutos no escuro à temperatura ambiente, marque as células com 13 microlitros de coquetel de anticorpos por mais 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Ao final da incubação, lave as células pelo menos duas vezes em 500 microlitros de PBS e ressuspenda o pellet final em 500 microlitros de PBS fresco. Em seguida, transfira as células para um tubo de citometria de fluxo sobre gelo.Por fim, para analisar as amostras por citometria de fluxo, adicione diretamente antes da medição em citometria de fluxo 30 microlitros do padrão absoluto para contagem em citometria de fluxo às células, para determinação das contagens absolutas de células. Em seguida, analise as amostras no citômetro de fluxo. Como esta figura ilustra, observa-se um aumento transitório em todas as populações de células imunes nos linfonodos durante a fase aguda da indução de EAE.No ba&ccedil;o, no entanto, apenas macr&oacute;fagos, c&eacute;lulas B, c&eacute;lulas T e neutr&oacute;filos demonstram um aumento na infiltra&ccedil;&atilde;o. No sangue, todas as popula&ccedil;&otilde;es de c&eacute;lulas imunes demonstram um aumento transit&oacute;rio na sua circula&ccedil;&atilde;o perif&eacute;rica durante a fase pr&eacute;-cl&iacute;nica, o que corresponde a um aumento semelhante, dependente da doen&ccedil;a, na medula espinhal lombar durante a fase aguda da doen&ccedil;a, com exce&ccedil;&atilde;o da popula&ccedil;&atilde;o de mon&oacute;citos, que presumivelmente se diferencia em macr&oacute;fagos ap&oacute;s a entrada na medula espinhal. Aqui, &eacute; apresentada a estrat&eacute;gia de sele&ccedil;&atilde;o para a avalia&ccedil;&atilde;o das diferentes popula&ccedil;&otilde;es celulares.Os números de células estão relacionados à quantidade de tecido ou volume sanguíneo analisado, refletindo a contagem absoluta de células. Nos linfonodos, a expressão de mRNA de IL-23 aumenta durante a fase pré-clínica, enquanto a expressão de IL-6 aumenta de maneira dependente da doença. No baço, a expressão de IL-6 e IL-23 aumenta na fase pré-clínica, ao passo que a expressão de mRNA de IL-1 beta não é afetada até o início da doença.No sangue, a expressão de apenas o mRNA da TNF-alfa é aumentada e de maneira dependente da doença. Na medula espinhal lombar, a TNF-alfa, a IL-1 beta e o interferon gama são induzidos durante a fase aguda, enquanto a IL-6 é aumentada somente durante a fase de início da doença. Uma vez dominado, o modelo de EAE, o isolamento celular subsequente e a análise dos efeitos podem ser concluídos em oito horas para dez camundongos, se forem realizados corretamente.Após este procedimento, outros métodos como Western Blot ou ELISA podem ser realizados para confirmar os resultados da análise de expressão de mRNA. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da esclerose múltipla explorarem o mecanismo de desmielinização no sistema nervoso central. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir o modelo de EAE e como isolar células imunes para obter resultados reprodutíveis em citometria de fluxo.Não se esqueça de que trabalhar com adjuvante completo de Freund pode ser extremamente perigoso, e precauções como levantar a pele do camundongo e garantir a penetração completa da pele pela seringa devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o placar de indução e clínicos de um modelo animal de esclerose múltipla: doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental em ratos DA. A doença, induzida pela imunização ratos com uma emulsão contendo medula espinhal de ratos inteiros e adjuvante de Freund completo, apresenta sinais clínicos semelhantes à doença humana.

Indução e pontuação clínica de doenças crônico-recidivante encefalomielite autoimune experimental

O vídeo demonstra a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo injetando uma combinação de glicoproteínas de oligodendrócitos de mielina e Mycobacterium tuberculosis inativado. O modelo permite que os pesquisadores estudem os mecanismos da doença e testem intervenções terapêuticas.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Este vídeo demonstra o método de indução de encefalomielite autoimune experimental (EAE) injetando peptídeos derivados de mielina com um adjuvante para ativar células T autorreativas, que migram para o cérebro. A toxina da coqueluche é administrada para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que essas células T e outras células imunológicas entrem no cérebro. Essas células imunes causam desmielinização, levando ao comprometimento da transmissão nervosa e ao...

Geração de encefalomielite autoimune experimental em modelo de camundongo

Neste vídeo, um modelo de camundongo com esclerose múltipla é estabelecido usando encefalomielite autoimune experimental (EAE). O camundongo é injetado com uma emulsão contendo um peptídeo neuronal e um adjuvante, desencadeando uma resposta imune que ativa as células T autorreativas. Isso é seguido por uma injeção de toxina coqueluche (PTX) para aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica, permitindo que as células T autorreativas se infiltrem no cérebro. Essa infiltração inicia uma...

Este protocolo descreve como determinar se os tratamentos farmacológicos para encefalomielite autoimune experimental mostram proteção do SNC como consequência da supressão da infiltração de células imunes ou são neuroprotetores durante o ataque de infiltração de células imunes.

Determinar a supressão imune Sistema contra CNS Proteção para farmacológicos intervenções na desmielinização auto-imune

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

O presente protocolo descreve a indução de encefalomielite autoimune experimental em um modelo de camundongo utilizando glicoproteína de oligodendrócitos de mielina e monitorando o processo da doença usando um sistema de pontuação clínica. Os sintomas experimentais relacionados à encefalomielite autoimune são analisados usando tomografia microcomputadorizada de fêmur de camundongo e teste de campo aberto para avaliar o processo da doença de forma abrangente.

Indução e Diversos Indicadores de Avaliação da Encefalomielite Autoimune Experimental

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

A encefalomielite autoimune experimental é um dos modelos murinos de esclerose múltipla mais utilizados. No protocolo atual, camundongos C57BL/6J de ambos os sexos são imunizados com peptídeo glicoproteico oligodendrócito de mielina, resultando principalmente em paresia ascendente da cauda e membros. Aqui discutimos o protocolo de indução e avaliação da EAE.

Modelagem da Esclerose Múltipla em Dois Sexos: Encefalomielite Autoimune Experimental Induzida por MOG35-55

A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo animal de esclerose múltipla (EM), que compartilha com a doença humana uma resposta autoimune humoral robusta. Aqui, relatamos um protocolo ELISA simples e flexível para quantificar autoanticorpos no soro de camundongos imunizados com EAE.

Quantificação de anticorpos autorreativos em camundongos após encefalomielite autoimune experimental

Aprenda a induzir encefalomielite autoimune experimental em camundongos para estudar esclerose múltipla. Este método utiliza citometria de fluxo e PCR quantitativo para avaliar distribuição de células imunes e níveis de citocinas em diferentes tecidos.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos (Vídeo) | JoVE Journal

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

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