Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

O objetivo geral do modelo de Encefalomielite Autoimune Experimental ou EAE é facilitar o estudo dos potenciais mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento da esclerose múltipla. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da esclerose múltipla, como: em que estágio da doença as células imunes se infiltram no sistema nervoso central? A principal vantagem dessa técnica é que o modelo EAE mimetiza muitas das principais características da esclerose múltipla, como desmielinização e infiltração de células imunes.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia da esclerose múltipla, pois os medicamentos testados com esse método já foram aprovados para essa doença. Geralmente, indivíduos novos neste método teriam dificuldades porque existem condições completas que devem ser levadas em consideração ao induzir EAE. Os camundongos devem ser mantidos em um ambiente livre de estresse e uma toxina da coqueluche deve ser preparada na hora.

A demonstração oficial desse método é crítica, pois o isolamento dos gânglios linfáticos e a extração da medula espinhal são difíceis de aprender apenas pela descrição. Comece injetando por via subcutânea camundongos fêmeas de 10 a 13 semanas de idade com 200 microgramas de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina. emulsionado em 200 microlitros de adjuvante de Freund completo, contendo 400 microgramas de mycobacterium tuberculosis.

Imediatamente e 24 horas depois, injetar intraperitonealmente nos camundongos 0,2 microgramas de toxina da coqueluche em 200 microlitros de PBS. É essencial que os camundongos tenham sido adaptados tanto ao manuseio quanto ao ambiente experimental antes da indução da EAE para induzir o estresse que pode prevenir o desenvolvimento de sintomas clínicos. Uma semana após a injeção, examine os camundongos diariamente quanto a sintomas clínicos, conforme descrito na tabela.

Para avaliar a população de células imunes linfonodais induzida por EAE, no momento apropriado pós-indução, umedeça a área da incisão com 80% de isopropanol e remova cuidadosamente a pele sobre a região do quadril. Usando uma pinça, remova cuidadosamente o linfonodo inguinal do tecido adiposo. Em seguida, pesar o nó e colocar a amostra em PBS no gelo.

Para analisar as células da medula espinhal, molhe o dorso do animal com isopropanol e use um bisturi para fazer um corte longitudinal na coluna. Em seguida, remova a pele e disseque a porção lombar da coluna, inervando os membros posteriores. Lave a coluna com uma seringa cheia de PBS para extrair a medula espinhal.

Depois de remover aproximadamente 1/3 da medula lombar, pese o fragmento da coluna vertebral e armazene o tecido em PBS no gelo. Para analisar a população de células imunes esplênicas, abra o tecido para ter acesso à parte inferior do abdômen. Em seguida, remova o baço e corte aproximadamente 1/8 do tecido.

Pese o fragmento do baço e armazene o tecido em PBS no gelo. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa de dois mL para macerar o resto do tecido através de uma peneira de malha de 70 mícrons em um tubo de 50 mililitros, seguido por uma lavagem PBS de cinco mililitros do filtro. Centrifugue as células filtradas.

Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de lise celular e transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro. Após 10 minutos em temperatura ambiente, lave as células duas vezes em 500 microlitros de PBS. Após a segunda lavagem, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de 0,2% BSA em PBS e adicione dois microlitros de tampão bloqueador do receptor Fc um às células.

Após 15 minutos no escuro em temperatura ambiente, rotule as células com 13 microlitros de coquetel de anticorpos por mais 15 minutos em temperatura ambiente no escuro. No final da incubação, lave as células pelo menos duas vezes em 500 microlitros de PBS e ressuspenda o pellet final em 500 microlitros de PBS fresco. Em seguida, transfira as células para um tubo de citometria de fluxo no gelo.

Finalmente, para analisar as amostras por citometria de fluxo, diretamente antes da medição da citometria de fluxo, adicione 30 microlitros de padrão de contagem absoluta de citometria de fluxo às células para determinar as contagens absolutas de células. Em seguida, analise as amostras no citômetro de fluxo. Como esta figura ilustra, um aumento transitório em todas as populações de células imunes dentro dos linfonodos é observado durante a fase aguda da indução do EAE.

No baço, no entanto, apenas macrófagos, células B, células T e neutrófilos demonstram uma infiltração aumentada. No sangue, todas as populações de células imunes demonstram um aumento transitório em sua circulação periférica durante a fase pré-clínica que corresponde a um aumento dependente da doença semelhante na medula espinhal lombar durante a fase aguda da doença, excluindo a população de monócitos, que presumivelmente se diferencia em macrófagos após a entrada na medula espinhal. Aqui, a estratégia de gating para a avaliação das diferentes populações de células é mostrada.

O número de células está relacionado à quantidade de tecido ou volume sanguíneo analisado, refletindo a contagem absoluta de células. Nos linfonodos, a expressão de mRNA de IL-23 é aumentada durante a fase pré-clínica, enquanto a expressão de IL-6 aumenta de maneira dependente da doença. No baço, a expressão de IL-6 e IL-23 aumenta na fase pré-clínica, enquanto a expressão de mRNA de IL-1 beta não é afetada até o início da doença.

No sangue, a expressão apenas do mRNA de TNF-alfa é regulada positivamente e de maneira dependente da doença. Na medula espinhal lombar, TNF-alfa, IL-1 beta e interferon gama são induzidos durante a fase aguda, enquanto a IL-6 é regulada positivamente apenas durante a fase inicial da doença. Uma vez dominado, o modelo EAE, o isolamento celular subsequente e a análise de efeitos podem ser concluídos em oito horas para dez camundongos, se forem executados corretamente.

Após este procedimento, outros métodos como Western Blot ou ELISA podem ser realizados para confirmar os resultados da análise da expressão de mRNA. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da esclerose múltipla explorarem o mecanismo de desmielinização no sistema nervoso central. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir o modelo EAE e como isolar células imunes para obter resultados de citometria de fluxo reprodutíveis.

Não se esqueça de que trabalhar com o adjuvante completo de Freund pode ser extremamente perigoso, e precauções adicionais como levantar a pele do camundongo e garantir a penetração completa da pele pela seringa devem ser tomadas durante a execução deste procedimento.