Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

O objetivo geral do modelo de encefalomielite autoimune experimental, ou EAE, é facilitar o estudo dos potenciais mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento da esclerose múltipla. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da esclerose múltipla, como, em qual estágio da doença as células imunes infiltram o sistema nervoso central? A principal vantagem desta técnica é que o modelo EAE imita muitas das características principais da esclerose múltipla, tais como desmielinização e infiltração de células imunes.

As implicações desta técnica estendem-se à terapia da esclerose múltipla, pois medicamentos testados com este método já foram aprovados para esta doença. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica teriam dificuldades, pois existem condições rigorosas que precisam ser consideradas ao induzir EAE. Os camundongos devem ser mantidos em um ambiente livre de estresse, e a toxina da coqueluche deve ser preparada recentemente.

A demonstração oficial deste método é fundamental, pois o isolamento dos linfonodos e a extração da medula espinhal são difíceis de aprender apenas por meio de descrição. Comece injetando subcutaneamente em camundongos fêmeas com 10 a 13 semanas de idade 200 microgramas de glicoproteína oligodendrocítica da mielina, emulsionados em 200 microlitros de adjuvante completo de Freund, contendo 400 microgramas de micobactéria tuberculosa.

Imediatamente e 24 horas depois, injete intraperitonealmente os camundongos com 0,2 microgramas de toxina da coqueluche em 200 microlitros de PBS. É essencial que os camundongos tenham sido adaptados tanto ao manuseio quanto ao ambiente experimental antes da indução de EAE, a fim de minimizar o estresse, que pode impedir o desenvolvimento de sintomas clínicos. Uma semana após a injeção, examine os camundongos diariamente quanto aos sintomas clínicos, conforme descrito na tabela.

Para avaliar a população de células imunes do linfonodo induzida por EAE, no ponto temporal apropriado após a indução, umedecer a área da incisão com isopropanol a 80% e remover cuidadosamente a pele sobre a região do quadril. Usando pinças, remover cuidadosamente o linfonodo inguinal do tecido adiposo. Em seguida, pesar o linfonodo e colocar a amostra em PBS sobre gelo.

Para analisar as células da medula espinhal, umedecer as costas do animal com isopropanol e usar um bisturi para fazer um corte longitudinal ao longo da coluna vertebral. Em seguida, remover a pele e dissecar a porção lombar da coluna, que inerva as patas traseiras. Lavar a coluna com uma seringa cheia de PBS para extrair a medula espinhal.

Após remover aproximadamente 1/3 da medula lombar, pese o fragmento medular e armazene o tecido em PBS sobre gelo. Para analisar a população de células imunes do baço, abra o tecido para obter acesso à parte inferior do abdômen. Em seguida, remova o baço e corte cerca de 1/8 do tecido.

Pese o fragmento de baço e armazene o tecido em PBS sobre gelo. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa de dois mL para macerar o restante do tecido através de uma peneira de malha de 70 mícon em um tubo de 50 mililitros, seguido por uma lavagem da peneira com cinco mililitros de PBS. Centrifugue as células filtradas.

Resuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de lise celular e transfira as células para um tubo de 1,5 mililitro. Após 10 minutos em temperatura ambiente, lave as células duas vezes em 500 microlitros de PBS. Após a segunda lavagem, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de BSA 0,2% em PBS e adicione dois microlitros de tampão bloqueador do receptor Fc um às células.

Após 15 minutos no escuro à temperatura ambiente, marque as células com 13 microlitros de coquetel de anticorpos por mais 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Ao final da incubação, lave as células pelo menos duas vezes em 500 microlitros de PBS e ressuspenda o pellet final em 500 microlitros de PBS fresco. Em seguida, transfira as células para um tubo de citometria de fluxo sobre gelo.

Por fim, para analisar as amostras por citometria de fluxo, adicione diretamente antes da medição em citometria de fluxo 30 microlitros do padrão absoluto para contagem em citometria de fluxo às células, para determinação das contagens absolutas de células. Em seguida, analise as amostras no citômetro de fluxo. Como esta figura ilustra, observa-se um aumento transitório em todas as populações de células imunes nos linfonodos durante a fase aguda da indução de EAE.

No baço, no entanto, apenas macrófagos, células B, células T e neutrófilos demonstram um aumento na infiltração. No sangue, todas as populações de células imunes demonstram um aumento transitório na sua circulação periférica durante a fase pré-clínica, o que corresponde a um aumento semelhante, dependente da doença, na medula espinhal lombar durante a fase aguda da doença, com exceção da população de monócitos, que presumivelmente se diferencia em macrófagos após a entrada na medula espinhal. Aqui, é apresentada a estratégia de seleção para a avaliação das diferentes populações celulares.

Os números de células estão relacionados à quantidade de tecido ou volume sanguíneo analisado, refletindo a contagem absoluta de células. Nos linfonodos, a expressão de mRNA de IL-23 aumenta durante a fase pré-clínica, enquanto a expressão de IL-6 aumenta de maneira dependente da doença. No baço, a expressão de IL-6 e IL-23 aumenta na fase pré-clínica, ao passo que a expressão de mRNA de IL-1 beta não é afetada até o início da doença.

No sangue, a expressão de apenas o mRNA da TNF-alfa é aumentada e de maneira dependente da doença. Na medula espinhal lombar, a TNF-alfa, a IL-1 beta e o interferon gama são induzidos durante a fase aguda, enquanto a IL-6 é aumentada somente durante a fase de início da doença. Uma vez dominado, o modelo de EAE, o isolamento celular subsequente e a análise dos efeitos podem ser concluídos em oito horas para dez camundongos, se forem realizados corretamente.

Após este procedimento, outros métodos como Western Blot ou ELISA podem ser realizados para confirmar os resultados da análise de expressão de mRNA. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área da esclerose múltipla explorarem o mecanismo de desmielinização no sistema nervoso central. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir o modelo de EAE e como isolar células imunes para obter resultados reprodutíveis em citometria de fluxo.

Não se esqueça de que trabalhar com adjuvante completo de Freund pode ser extremamente perigoso, e precauções como levantar a pele do camundongo e garantir a penetração completa da pele pela seringa devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.