Name: PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprenda a detectar mutações somáticas de baixa frequência em linfoma angioimunoblástico usando PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger. Este método de alta sensibilidade oferece uma alternativa de baixo custo para pesquisa oncológica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Otimizando a detecção de mutação de baixa frequência com PCR de bloqueio de tipo selvagem

<ol><li>Penn Medicine. Testing for measurable/minimal residual disease (MRD). , Oncolink Team. 
 <a target="_blank" href="https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd">https://www.oncolink.org/cancer-treatment/procedures-diagnostic-tests/blood-tests-tumordiagnostic-tests/testing-for-measurable-minimal-residualdisease-mrd</a> (2019).</li>
<li>Xie, Y., Elaine, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+I+diagnose+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">How I diagnose angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Am J Clin Pathol. 156, 1-14 (2021).</li>
<li>Mariko, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Cancer Treat Res. 176, 99-126 (2019).</li>
<li>Daniel, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute+lukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute lukemia.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Rita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5th+edition+of+the+World+Health+Organization+Classification+of+Haematolymphoid+Tumours+%3A+Lymphoid+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours : Lymphoid Neoplasms.</a> Leukemia. 36 (7), 1720-1748 (2022).</li>
<li>Hae, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+inactivating+mutation+in+RHOA+GTPase+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A recurrent inactivating mutation in RHOA GTPase in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (4), 371-375 (2014).</li>
<li>Lee, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHOA+G17V+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%3AA+potential+biomarker+for+cytological+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">RHOA G17V mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma:A potential biomarker for cytological assessment.</a> Exp Mol Pathol. 110, 104294(2019).</li>
<li>Mamiko, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Somatic RHOA mutation in angioimmunoblastic T cell lymphoma.</a> Nat Genet. 46 (2), 171-175 (2014).</li>
<li>Palomero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+epigenetic+regulators%2C+RHOA+and+FYN+kinase+in+peripheral+T+cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in epigenetic regulators, RHOA and FYN kinase in peripheral T cell lymphomas.</a> Nat Genet. 46 (2), 166-170 (2014).</li>
<li>Fujisawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RHOA-VAV1+signaling+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Activation of RHOA-VAV1 signaling in angioimmunoblastic T-cell lymphoma.</a> Leukemia. 32 (3), 694-702 (2018).</li>
<li>Voena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RHO+family+GTPases+in+the+biology+of+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">RHO family GTPases in the biology of lymphoma.</a> Cells. 8 (7), 646(2019).</li>
<li>Shendure, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+an+40%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing an 40: past, present and future.</a> Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).</li>
<li>Athanasios, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Sanger+sequencing%2C+pyrosequencing%2C+and+melting+curve+analysis+for+the+detection+of+KRAS+mutations%3A+diagnostic+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications.</a> J Mol Diagn. 12 (4), 425-432 (2010).</li>
<li>Wu, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+enrichment+of+rare+DNA+variants+via+sequence-selective+and+temperature-robust+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiplexed enrichment of rare DNA variants via sequence-selective and temperature-robust amplification.</a> Nat Biomed Eng. 1, 714-723 (2017).</li>
<li>John, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermodynamics+of+DNA+structural+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The thermodynamics of DNA structural motifs.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 415-440 (2004).</li>
<li>Coren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+methods+for+the+enrichment+of+minority+alleles+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations.</a> Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).</li>
<li>Eliza, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+in+B-cell+lymphoma%3A+technical+advances%2C+clinical+applications%2C+and+perspectives+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA in B-cell lymphoma: technical advances, clinical applications, and perspectives for translational research.</a> Leukemia. 36 (9), 2151-2164 (2022).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot-spot-specific+probe+%28HSSP%29+for+rapid+and+accurate+detection+of+KRAS+mutations+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Hot-spot-specific probe (HSSP) for rapid and accurate detection of KRAS mutations in colorectal cancer.</a> Biosensors. 12 (8), 597(2022).</li>
<li>Matsubara, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+G17V+RHOA+mutation+in+angioimmunoblastic+T-cell+lymphoma+and+related+lymphomas+using+quantitative+allele-specific+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of the G17V RHOA mutation in angioimmunoblastic T-cell lymphoma and related lymphomas using quantitative allele-specific PCR.</a> PLoS One. 9 (10), e109714(2014).</li>
<li>Dieffenbach, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+concepts+for+PCR+primer+design%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">General concepts for PCR primer design.</a> PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).</li>
<li>Applied Biosystems. User Guide for Applied Biosystems. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%223730%2F3730xl+DNA+Analyzer%22">3730/3730xl DNA Analyzer</a>. , (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Extrator automático de DNA</td><td>9001301</td> detector de ácido nucleico <td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Thermo fisher</td><td></td></tr><tr><td>PCR kit de amplificação P4600</td><td></td><td>merck</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td> instrumento <td>C1000 Touch</td><td>Biorad</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K solução</td><td>D3001-2-A</td><td>zymo pesquisa</td><td></td></tr><tr><td>proteinase K tampão de armazenamento</td><td>D3001-2-C</td><td>zymo pesquisa</td><td></td></tr><tr><td>sequenciamento amplificação enzima kit</td><td>P7670-FIN</td><td>Qiagen</td><td></td></tr></tbody></table>

pcr de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

Compare a sequência da amostra de teste com a sequência de referência para obter o status de mutação da amostra de teste. A tecnologia WBT-PCR baseada em BDA pode detectar a mutação RHOA G17V conhecida e outras mutações de baixa frequência no intervalo de amplificação de primers a montante e a jusante. Veja a Figura 1. Dois genes adicionais, a saber, IDH2 e JAK1, também foram analisados usando este método, Figura 2 e Figura 3, respectivamente. Os resultados mostram que este método é bastante sensível na detecção de mutações de baixa frequência.
<img alt="cromatograma de sequenciamento de DNA; PCR tradicional vs. WBT-PCR mostrando comparação de detecção de mutação RHOA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Resultado do sequenciamento para RHOA. De cima para baixo, a figura mostra a mutação de base do sítio RHOA G17 amplificada por WBT-PCR e os resultados do sequenciamento após a amplificação tradicional por PCR correspondente ao RHOA G17 do tipo selvagem. A imagem do meio mostra os resultados do sequenciamento da mutação c.50G&gt;T após amplificação com primers WBT-PCR quando a sensibilidade de detecção é de 0,5%. A imagem inferior mostra os resultados do sequenciamento da mutação c.49-50delinsTT após amplificação com primers WBT-PCR quando a sensibilidade de detecção é de 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="WBT-PCR e comparação de cromatograma de PCR tradicional, detecção de mutação c.515G&gt;A, gene IDH2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Resultado do sequenciamento para IDH2. De cima para baixo, a figura acima mostra a mutação de base do sítio IDH2 R172 amplificada por WBT-PCR e os resultados do sequenciamento após a amplificação tradicional por PCR correspondente ao IDH2 R172 do tipo selvagem. A imagem superior mostra os resultados do sequenciamento da mutação c.515G&gt;A após amplificação com primers WBT-PCR quando a sensibilidade de detecção é de 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig02largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Comparação de sequenciamento de DNA, WBT-PCR vs PCR tradicional para gráfico de análise de mutação JAK1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65647/65647fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Resultado do sequenciamento para JAK1. De cima para baixo, a figura acima mostra a mutação de base do sítio JAK1 S703 amplificada por WBT-PCR e os resultados do sequenciamento após a amplificação tradicional por PCR correspondente ao JAK1 S703 do tipo selvagem. A imagem superior mostra os resultados do sequenciamento da mutação c.2108G&gt;T após amplificação com primers WBT-PCR quando a sensibilidade de detecção é de 0,5%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65647/65647fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Cartilha</td>
			<td colspan="2">Sequência de primer</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VF</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr><tr><td>RHOA-VR</td>
			<td colspan="2">GCTGAAGACTATGAGCAAGCA</td>
		</tr><tr><td>RHOA-WTB</td>
			<td colspan="2">AGCAAGCATGTCTTTCCACAGGCAAAA</td>
		</tr><tr><td>Primer de sequenciamento</td>
			<td colspan="2">ATAACCTTTTGGTGCCAGGT</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: A lista final de primers do RHOA.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Primário IDH2 R172</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Cartilha</td>
			<td>Sequência de primer</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VF</td>
			<td>CTGGTTGAAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>IDH2-VR</td>
			<td>TACCTGGTCGCCATGGGC</td>
		</tr><tr><td>IDH2-WTB</td>
			<td>GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT</td>
		</tr><tr><td>Primer de sequenciamento</td>
			<td>CTGGTTGAAAAGATGGCGGCT</td>
		</tr><tr><td>Primer do gene JAK1</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Cartilha</td>
			<td>Sequência de primer</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VF</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr><tr><td>JAK1-VR</td>
			<td>CCATTATGGACATCAGGACATTC</td>
		</tr><tr><td>JAK1-WTB</td>
			<td>GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA</td>
		</tr><tr><td>Primer de sequenciamento</td>
			<td>ACTCTGAGGCCGAGTAGTGT</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: A lista final de IDH2 e JAK1.

PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-sanger-sequencing-for-detection

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Seqüenciamento de DNA pool é uma estratégia rápida e de custo eficaz para detectar variantes raras associadas com fenótipos complexos em grandes grupos. Aqui descrevemos a análise computacional de pool, o seqüenciamento da próxima geração de 32 genes relacionados ao câncer, utilizando o pacote de software SPLINTER. Este método é escalável, e aplicável a qualquer fenótipo de interesse.

Detecção de variantes raras genômico de Seqüenciamento combinados usando SPLINTER

Este vídeo descreve a reação em cadeia da polimerase bloqueadora do tipo selvagem, ou WTB-PCR, que detecta mutações somáticas. A técnica baseada em PCR usa um ácido nucléico bloqueado, ou LNA, um oligonucleotídeo que se liga ao seu alelo complementar do tipo selvagem e bloqueia seu alongamento. O bloqueio permite seletivamente a amplificação de alelos mutantes de baixo nível sobre suas variantes de tipo selvagem na amostra.

PCR de bloqueio de tipo selvagem para detectar mutações somáticas de baixa frequência

Nós descrevemos a preparação de bibliotecas de DNA com código de barras e posterior captura exon baseada em hibridização para a detecção de mutações associadas ao câncer de chave em amostras de tumor clínicos por sequenciamento paralelo em massa "próxima geração". Alvejado seqüenciamento exon oferece os benefícios de alto rendimento, baixo custo, e cobertura seqüência de profundidade, proporcionando assim alta sensibilidade para detecção de mutações de baixa frequência.

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

Este manuscrito descreve protocolos clínicos para dois painéis de sequenciamento de próxima geração. Um painel interroga malignidades hematológicas, enquanto o outro painel tem como alvo genes comumente mutados em tumores sólidos. A classificação molecular de mutações condutoras em malignidades humanas oferece informações prognósticas e preditivas valiosas.

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

A PCR de bloqueio do tipo selvagem seguida de sequenciamento direto oferece um método altamente sensível de detecção de mutações somáticas de baixa frequência em uma variedade de tipos de amostra.

De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Sequenciamento de próxima geração (NGS) é uma poderosa ferramenta para a caracterização do genoma que é limitada pela taxa de erro elevada da plataforma (~0.5–2.0%). Descrevemos os nossos métodos de sequenciamento de correção de erro que permitam obviar a taxa de erro NGS e detectar mutações em fracções de alelo variante tão raras como 0,0001.

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar com precisão a múltiplas alterações genéticas de uma região de destino em uma única reação usando ddPCR de entrega e um único par de testes de hidrólise.

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Este artigo descreve um método para identificar alterações clonais e subclonais entre diferentes espécimes de um determinado paciente. Embora os experimentos descritos aqui se concentrem em um tipo específico de tumor, a abordagem é amplamente aplicável a outros tumores sólidos.

Análise comparativa de lesões por meio de uma abordagem de sequenciamento direcionada

Aprenda a detectar mutações somáticas de baixa frequência em linfoma angioimunoblástico usando PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger. Este método de alta sensibilidade oferece uma alternativa de baixo custo para pesquisa oncológica.

PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência

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