Name: Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprenda a realizar ensaios de mobilidade eletroforética com sondas de DNA marcadas com corante infravermelho fluorescente. Este método não radioativo detecta interações proteína-DNA de forma segura e eficiente em biologia molecular.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa Alfred P. Sloan (para C.-F.C.) e uma bolsa NIH R01 (5R01GM098026-05 para C.-F.C.). Agradecemos a David Crowe pelo acesso ao avançado sistema de imagem infravermelha.

NOTA: EMSAs usando sondas de DNA marcadas com fluorescência ou outras formas de ADN marcado partilham os mesmos protocolos para a preparação de proteína ou extracto celular, reacção de ligação proteína-ADN, e a preparação de gel de PAGE e execução (Figura 1A). As principais diferenças são procedimentos de ADN de rotulagem, etapas de processamento gel pós-run, e métodos de detecção. 1. Preparação do gel <ol><li> Prepare 5% de gel de poliacrilamida nativa contendo TBE 0,5x (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM) e 2,5% de glicerol, usando um sistema de mini-gel de proteína (8,3 cm de largura x 7,3 centímetros de espessura comprimento x 0,75 mm). <ol><li> Para preparar 30 mL da solução de gel durante 4 géis, mistura 5 mL de 30% de acrilamida / bis (37,5: 1), 3 mL de 5x TBE (0,45 M Tris-borato, EDTA 10 mM), 1,5 mL de glicerol a 50%, 300 mL de 10% de persulfato de amónio, 15 ul de TEMED e 20,2 ml de ddH2O completamente. NOTA: A acrilamida é prejudicial e tóxico, lidar com equipamento de protecção individual adequado. </li&gt; </ol></li><li> Lançai a solução de gel imediatamente. Após a polimerização, enrole os géis no envoltório de plástico transparente pré-molhado com TBE 0,5x e armazená-los a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparação de Sondas Infrared corante fluorescente-etiquetados NOTA: Mantenha os oligonucleotídeos marcados com corante fluorescente no infravermelho longe da luz, tanto quanto possível, durante a preparação, armazenamento e experiências. <ol><li> Planejar e ativar oligonucleotídeos. <ol><li> Projetar longo oligonucleotídeo para ~ 51-meros. NOTA: A sequência de oligonucleotídeo longo do / SOX-2 sonda LIM-4 é TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. oligonucleotídeos longos não exigem PAGE ou purificação HPLC. </li><li> Conceber oligonucleótidos curtos complementares para ~ 14-meros com corante fluorescente no infravermelho modificação no terminal 5 &#39;(5&#39;Dye) e uma temperatura de fusão acima de 37 ° C. NOTA: A sequência de oligonucleotídeo curto do LIM-4 / SOX-2 sonda é 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG. A escala mínima síntese de oligonucleotídeos curtos 5&#39;Dye-rotulados é de 100 nm. Portanto, os oligonucleótidos requerem purificação por HPLC. </li></ol></li><li> oligonucleótidos Ressuspender em 1x tampão de Tris-EDTA (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM) até uma concentração final de 100 uM. </li><li> Anneal curta (5&#39;Dye) e oligonucleotídeos longas. <ol><li> Misture 0,6 mL de 5&#39;Dye Curto-oligo (100 uM), 1,2 ul de oligo comprida (100 uM), e 28,2 mL de cloreto de sódio tampão de Tris-EDTA (STE: 100 mM de NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM) num tubo de 1,5 mL. </li><li> Colocar o tubo em água a ferver durante 5 min. Desligue a fonte de calor e deixe a água com os oligos recozidos esfriar O / N no escuro. </li></ol></li><li> Preencha saliências 5 &#39;de recozidos 5&#39;Dye-Short / oligos longos com DNA polimerase Klenow para fazer sondas de DNA de cadeia dupla. <ol><li> Preparar a mistura de reacção através30 uL de recozidos curtas de comprimento / oligos com 5&#39;Dye tag, 8,5 ul de tampão Klenow 10x, 1,7 ul de dNTPs 10 mM, 1,7 ul de Klenow (3 &#39;-&gt; 5&#39; exo) (5 U / uL), e 43,1 uL de ddH2O em um tubo de 0,2 mL de PCR. </li><li> Incubar 60 min a 37 ° C numa máquina de PCR. </li><li> Adicionar 3,4 uL de EDTA 0,5 M para parar a reacção e inactivam calor a 75 ° C durante 20 minutos numa máquina PCR. </li></ol></li><li> Diluir sondas preenchidos (0,7 uM) em STE para a concentração final de 0,1 uM. </li><li> oligos armazenar a -20 ° C no escuro até que esteja pronto para uso. Oligos podem ser armazenadas por até um ano nesta condição. NOTA: Para gerar sondas de ADN com sítios de ligação mutantes, versões mutantes de longos oligonucleótidos são hibridados com os oligonucleótidos curtos 5&#39;Dye marcados, seguido por preenchimento de 5 &#39;com Klenow saliências. Demonstrou-se que a sonda com uma cadeia marcada com um fluorescente no infravermelhocorante tem apenas 30% da intensidade da sonda com as duas cadeias marcadas com o corante. Se a intensidade do sinal deve ser reforçada, longos oligos de ambos os fios são marcados com corantes fluorescentes infravermelhos em terminais 5 &#39;e recozidos para fazer sondas marcadas com corante fluorescente no infravermelho. </li></ol> 3. Preparação de Unlabeled / frio Sondas (concorrentes) Nota: oligonucleotídeos longos de sequências complementares (longas e LongR) foram emparelhados para fazer sondas não marcadas para análise da concorrência com sondas marcadas com corante fluorescente no infravermelho. <ol><li> Misturar 20 uL de 100 uM longo, de 20 uL de 100 uM LongR oligonucleótidos, e 60 uL de STE num tubo de 1,5 mL. </li><li> Colocar o tubo em água fervente por 5 min, desligue a fonte de calor e deixe a água com os oligos recozidos arrefecer durante a noite. </li></ol> 4. reação de ligação e Eletroforese <ol><li> Prepare 1 ml de tampão de ligação 5x por mistura de 50 uL60; de M de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 10 ul de NaCl 5 M; 200 mL de KCl 1 M, 5 mL de 1 M de MgCl2, 10 ul de EDTA 0,5 M, pH 8,0; 5 ul de DTT 1 M; 25 uL de 10 mg / mL de BSA, e 695 uL de ddH 2 O. NOTA: O 5x tampão de ligação pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -20 ° C. Outro ponto a considerar é que fatores de transcrição diferentes terão diferentes modificações para o tampão de ligação. </li><li> Logo antes da criação de reacções de ligação, pré-correr em gel de poliacrilamida nativa a 5% em TBE 0,5x + 2,5% de glicerol para remover todos os vestígios de persulfato de amónio a 80 V durante 30 - 60 minutos, ou até que a corrente não varia com o tempo. </li><li> Configurar a reação de ligação no volume final de 20 mL. <ol><li> Mistura-se 4 uL de tampão de ligação 5x, 80-200 ng de proteína purificada A (em glicerol a 50%, ou seja, SOX-2), 1 ul de 0,1 uM sonda conjugado com corante (concentration: 5 nM), e ddH 2 O. </li><li> Opcional: Quando são necessárias concorrentes de sondas frias, adicionar várias concentrações (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) de sondas frias. </li><li> Opcional: Quando a interacção entre as proteínas A e B (ou seja, SOX-2 e LIM-4) é testado, adicionar 80-200 ng de proteína purificada B (em glicerol a 50%, ou seja, LIM-4). </li><li> Opcional: Quando a preparação de extracto nuclear é utilizada e a ligação específica de proteína A é para ser validado, adicionar o anticorpo específico para a proteína A (ou seja, anti-6xHis, anti-FLAG, etc). </li><li> Incubar em R / T no escuro durante 15 min. </li></ol></li><li> Carga em toda a reacção de ligação sobre o gel e correr o gel a 10 V / cm a uma distância desejada. </li></ol> 5. Imagiologia NOTA: O gel foi digitalizado directamente nas placas de vidro com um sistema de imagem de infravermelhos avançada. Por conseguinte, o gel pode ser resolvida adicionalmente e rastreados repetidamente (Figuras 1C e <strong&gt; 2). Um sistema de imagiologia fluorescente no infravermelho próximo principalmente para Western blots também foi testado para verificar o gel, mas apenas o sistema de imagem infravermelha avançada foi capaz de digitalizar o gel com boa resolução. A metodologia descrita é específico para um software de imagiologia de infravermelhos em particular, embora possam ser utilizados outros pacotes de software. <ol><li> Limpar o leito do scanner com DDH 2 O e secar bem antes da digitalização. Secar as placas de vidro do gel e colocar as placas contendo o gel sobre a superfície do scanner. </li><li> Abra o software de imagem de infravermelhos e vá para a guia &#39;Acquire&#39;. Quando a placa mais fino (1 mm) é colocado na mesa do scanner, use as configurações do Canal: 700, Intensidade: Auto, resolução: 169 mm, Qualidade: médio, e Focus offset: 1,5 mm. Quando a placa mais espessa (3 mm) é colocado na mesa do scanner, use as configurações do Canal: 700, Intensidade: Auto, resolução: 84 mm, Qualidade: médio, e Focus offset: 3,5 mm. compensada foco depende doespessura da placa de vidro. </li><li> Seleccione a área que o gel ocupa no scanner. Clique em &quot;Iniciar&quot; para iniciar a digitalização. </li><li> Repetir electroforese e digitalizar, adicionalmente, como necessário. </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA%2C+ssDNA+or+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li>
<li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li>
<li>Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-color+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+detecting+both+nucleic+acids+and+protein+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels.</a> Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).</li>
<li>Alqadah, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+diversification+of+olfactory+neuron+types+is+mediated+by+differential+activities+of+the+HMG-box+transcription+factor+SOX-2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2.</a> EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).</li>
<li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUEGO%3A+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li>
<li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li>
<li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li>
<li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+competitor+poly%28dI-dC%29.poly%28dI-dC%29+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li>
<li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li>
<li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li>
<li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

fEMSAs são um instrumento eficaz para investigar interacções DNA-proteínas, e são uma alternativa à marcação radioactiva de ADN. corantes fluorescentes, tais como corantes de infravermelho estão comercialmente disponíveis, e proporcionar um método mais seguro e respeitador do ambiente em relação a marcação de ADN radioactivo. EMSAs usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante não requerem etapas de processamento gel postrun, e, portanto, economizar tempo e custo em comparação com outras técn...

EMSAs são utilizados para a análise da interacção entre o ADN e as proteínas nativas usando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver uma mistura de uma proteína de interesse e uma sonda de ADN marcado contendo potenciais locais alvo da proteína 1. Uma sonda de ADN ligado com proteína migrarão mais lenta em comparação com uma sonda de ADN livre, e é, por conseguinte, retardado na sua migração através de uma matriz de poliacrilamida. A radiomarcação de ADN por 32 P tem sido o método predominante para a detecção em EMSAs. Embora a aplicação de marcação radioactiva na pesquisa bioquímica tem sido benéfica, os métodos de rotulagem DNA alternativa com sensibilidade comparável estão sendo empregados devido aos riscos de saúde e segurança associados com a manipulação de radioatividade. Estes métodos alternativos incluem a conjugação de ADN com biotina ou digoxigenina 2 (DIG) 3 (ambos os quais são então detectados por sistemas quimioluminescentes), SYBR verde de coloração dos géis página 4,ou detecção direta de conjugados de corante de ADN fluorescente por digitalizar a 5,6 gel. Os géis resolvidos de EMSAs usando sondas de DNA marcadas radioactivamente requerem processamento postrun através de filmes auto-radiografia ou um sistema de phosphorimager para detectar sinais radioativos 1,7. Géis de EMSAs utilizando biotina ou 2-DIG conjugados com as sondas de ADN 3 também devem ser processados e transferidos para uma membrana adequada e, em seguida, detectados por quimioluminescência 6. SYBR coloração verde do gel requer coloração de gel postrun e um scanner fluorescente 4. Uma vez que as etapas de processamento de gel postrun são necessários para EMSAs utilizando estas técnicas de marcação de ADN, o gel pode ser resolvido ensaiados apenas uma vez. Em contraste, as sondas de ADN marcadas com fluoróforos pode ser detectada directamente no gel no interior das placas de vidro por um scanner. Portanto, as interacções ADN-proteína podem ser monitorizadas e ensaiado várias vezes a diferentes pontos de tempo durante a execução, quereduz significativamente o tempo e custo. Os conjugados de corante de ADN fluorescente que têm sido utilizados para EMSAs incluem 6,8 Cy3, Cy5 6,8, 9 fluoresceína, e corantes fluorescentes infravermelhos 4-6. A regulação transcricional requer interacções proteína-ADN de factores de transcrição e os seus genes-alvo. A coordenação dessas interações gera diversos tipos de células a partir de um antepassado comum durante o desenvolvimento animal. Uma frente tela genética não distorcida identificada uma mutação sem sentido, G73E, no domínio de ligação ao ADN de HMG altamente conservada do factor de transcrição de Caenorhabditis elegans SOX-2. Os resultados de mutação em uma transformação identidade da célula de AWB neurônios olfativos em AWC neurônios olfativos em níveis moleculares, morfológicos e funcionais 5,10. SOX-2 diferencialmente regula a diferenciação terminal dos neurônios AWB e AWC, interagindo com fatores sócio de transcrição dependentes do contexto e respectivaLocais-alvo DNA 5,10. SOX-2 parceiros com LIM-4 (LHX) no terminal de AWB diferenciação neuronal, enquanto SOX-2 parceiros com CEH-36 (OTX / DTA) na diferenciação neuronal AWC terminal. Ensaios de repórter de luciferase mostram que SOX-2 e da SOX-2 mutantes proteínas G73E ter interações de cooperação com co-factores de transcrição LIM-4 e CEH-36 para ativar um promotor expresso em neurônios AWB e AWC. No entanto, SOX-2 e mutante SOX-2 G73E exibido propriedades de activação diferencial do promotor. Para investigar a base molecular da actividade de ligação ao ADN diferenciais de SOX-2 e SOX-2 G73E, fEMSAs foram realizados com estas proteínas e os seus locais alvo potenciais. Em primeiro lugar, uma abordagem foi feita bioinformática para identificar as sequências de ligação no interior da região promotora do 1 kb usado no ensaio de luciferase de ADN biologicamente relevante. Desde várias-2 SOX locais de ligação potenciais estavam presentes ao longo do promotor, nós nos concentramosem sítios de ligação de SOX-2 preditos adjacentes ao putativo CEH-36 ou LIM-4 locais de ligação e evolutivamente conservados entre várias espécies de nemátodos. Estas sequências foram excluídos ou mutado, e posteriormente testado in vivo para a sua actividade para expressar transgenes repórter GFP em neurónios AWB ou AWC. Através desta abordagem, identificou potenciais LIM-4 / SOX-2 e CEH-36-2 SOX locais alvo adjacentes / que são especificamente necessárias para a expressão de GFP em neurónios AWB AWC e 5, respectivamente. Nós investigamos as diferenças potenciais no DNA ligação de SOX-2 e da SOX-2 G73E usando FEMSA com as CEH-36 / SOX-2 locais alvo adjacentes identificadas LIM-4 / SOX-2 e. Nossa análise EMSA mostraram que SOX-2 G73E não se ligou a sonda de DNA contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes (necessários para a expressão do gene em AWB) tão eficientemente quanto WT SOX-2 fez. No entanto, SOX-2 e da SOX-2 G73E não tinha diferença na ligação da sonda de DNA contendo o CEH-36 / SOX-2 umsite de destino djacent (necessária para a expressão de genes em AWC) 5,10. O nosso femsa análises fornecem uma visão mecanicista para a natureza da mutação G73E SOX-2 em afectar a actividade de ligação do ADN específico para a transformação de células fenótipo identidade AWB-a-AWC. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado da Femsa usando 6xHis-SOX-2 purificadas ou 6xHis-SOX-2 G73E em conjunto com sondas de DNA marcadas com corante fluorescente no infravermelho contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes como estudo de caso para enfrentar uma importante questão biológica.

<table><tbody><tr><td>Solução de Acrilamida/Bis a 30%, 37.5:1&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Acrilamida é prejudicial e tóxico.</td></tr><tr><td>6x-His Epitope Tag Anticorpo (HIS. H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 anticorpo&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA) grau de biologia molecular</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5'IRDye700-labeled DNA Oligos</td><td>Integrated DNA</td> Technologies <td>Custom DNA oligo</td><td>Estes são referidos como "5'Dye-labeled ou infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" no manuscrito. A empresa sintetizará de forma personalizada oligonucleotídeos de DNA marcados com IRDye de 5 '. Requer mínimo de 100&nbsp; &mu; Síntese em escala M e purificação por HPLC.</td></tr><tr><td>Fragmento Klenow (3'-->5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Célula de Eletroforese Vertical</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&nbsp;</td><td>Isso é referido como um 'sistema de mini proteína gel' no manuscrito. Qualquer sistema eletroforético pode ser usado, desde que sejam placas de vidro transparente com menos de 25 cm x 25 cm de tamanho.</td></tr><tr><td>Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx</td><td>LI-COR Biotecnologia</td><td>Odyssey CLx Sistema de imagem infravermelha</td><td>Isso é referido como um 'sistema avançado de imagem infravermelha' no manuscrito.</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem Odyssey Fc</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Sistema de imagem de modo duplo</td><td>Isso é referido como um 'sistema de imagem fluorescente de infravermelho próximo principalmente para Western blots' no manuscrito.</td></tr><tr><td>Software Image Studio (versão 4.0)</td><td>Software LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio&nbsp;</td><td>Isso é referido como um 'software de imagem específico' no manuscrito.&nbsp;</td></tr><tr><td>Laranja G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Corante</td><td></td><td></td> de carregamento laranja <td>0,25% Laranja G; 30% Glicerol</td></tr><tr><td>0,5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borato; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Tampão</td><td></td><td></td> <td>de ligação50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM TDT; 250 &#956; g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos infrared corante fluorescente-etiquetados

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Ensaios de deslocamento da mobilidade electrof orética (EMSA) são uma ferramenta fundamental para caracterizar as interacções entre proteínas e suas sequências de ADN alvo. A radioactividade tem sido o método predominante de marcação de ADN em EMSAs. No entanto, avanços recentes em corantes fluorescentes e métodos de verificação ter solicitado o uso de marcação fluorescente de ADN como uma alternativa para radioactividade para as vantagens de fácil manuseamento, economia de tempo, reduzindo o custo, e melhorando a segurança. Nós temos usado recentemente EMSA fluorescente (Femsa) para tratar com sucesso uma questão biológica importante. Nossa análise FEMSA oferece uma visão mecanicista sobre o efeito de uma mutação missense, G73E, no altamente conservada fator de transcrição HMG SOX-2 no tipo de neurônio diversificação olfativo. Descobrimos que mutantes SOX-2 proteína G73E altera a atividade de ligação específica de DNA, causando transformação neurônio identidade olfativa. Aqui, apresentamos um otimizado e rentável passo-a-passo protocolopara FEMSA usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes e proteínas purificadas SOX-2 (WT e as proteínas mutantes G73E SOX-2) como um exemplo biológico.

Orange G corante de carga (6x: 0,12 g Laranja G em 100 ml de glicerol a 30%) pode ser adicionada à reacção de ligação antes do carregamento para visualizar o progresso da electroforese. Outros corantes de carga, incluindo azul de bromofenol vai ser detectadas durante a análise e, portanto, interferir com a análise de imagem (Figura 1B). Em alguns casos de EMSAs, especialmente se a preparação de extracto nuclea...

Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

O objetivo geral deste ensaio é detectar interações proteína-DNA utilizando sondas não radioativas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia molecular e bioquímica, como a determinação da sequência alvo de DNA de proteínas. A principal vantagem desta técnica é que ela representa uma alternativa fácil, segura e que economiza tempo em comparação com o uso de sondas radioativas.Para iniciar este procedimento, prepare um gel nativo de poliacrilamida a 5% contendo TBE (tris borato EDTA) 0,5x e glicerol a 2,5%, utilizando um sistema de gel proteico mini. Para preparar 30 mililitros da solução de gel para quatro géis, misture água destilada, TBE, persulfato de amônio, TEMED, acrilamida-bis e glicerol. Passe imediatamente a solução do gel.Após a polimerização, enrole os géis em filme plástico transparente previamente umedecido com TBE 0,5x e armazene-os a quatro graus Celsius. Em seguida, projete um oligonucleotídeo longo com cerca de 51 mers. Projete oligonucleotídeos curtos complementares com cerca de 14 mers, com modificação por corante fluorescente no infravermelho no extremo cinco primário.Uma vez que os oligonucleotídeos tenham sido preparados,

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Research

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Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve o método para analisar a interação proteína-ligante por eletroforese capilar de afinidade de mudança de mobilidade. Este método pode ser usado para caracterizar o comportamento de ligação de uma proteína com vários ligantes carregados.

Eletroforese capilar de afinidade por deslocamento de mobilidade: um método para analisar as interações amostra-ligante dependendo da migração diferencial de complexos proteína-ligante

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética para detectar interações proteína-DNA usando sondas de DNA marcadas com fluorescência infravermelha. Quando a proteína se liga à sonda de DNA, ela forma um grande complexo que migra lentamente e aparece como uma banda deslocada no gel.

Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética para Detecção de Complexos de Fator de Transcrição-DNA

Estudos de biomoléculas in vivo são cruciais para a compreensão da função molecular em um contexto biológico. Aqui descrevemos um novo método que permite a internalização de biomoléculas fluorescentes, como DNA ou proteínas, em microrganismos vivos. A análise de dados in vivo registrados por microscopia de fluorescência também é apresentada e discutida.

Internalização e Observação de Fluorescent Biomoléculas em microorganismos vivos via Eletroporação

Aqui apresentamos um protocolo para analisar as interações RNA/proteína. O ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética (EMSA) é baseado na migração diferencial de complexos de RNA/proteína e RNA livre durante a eletroforese em gel nativo. Usando uma sonda de RNA radiomarcada, os complexos RNA/proteína podem ser visualizados por autorradiografia.

Electrophoretic Mobility Turno Assay (EMSA) para o estudo das interações RNA em proteínas: O IRE / IRP Exemplo

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

A eletroforese em gel de poliacrilamida nativa é uma ferramenta fundamental para analisar as interações RNA-proteína. Tradicionalmente, a maioria das experiências usou géis verticais. No entanto, os géis horizontais oferecem várias vantagens, como a oportunidade de monitorar complexos durante a eletroforese. Nós fornecemos um protocolo detalhado para gerar e usar eletroforese em gel nativo horizontal.

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Este protocolo descreve a caracterização da síntese de DNA polimerase do ADN modificado através da observação de alterações para o infravermelho próximo fluorescente etiquetada DNA usando electroforese em gel e gel de imagem. Géis de acrilamida são utilizados para geração de imagens de alta resolução da separação de curtos ácidos nucleicos, que migram em taxas diferentes dependendo do tamanho.

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

Aqui, apresentamos um protocolo para usar tiazol laranja para a detecção de DNA em experimentos de electroforese do gel. O uso de laranja tiazol permite a eliminação do brometo de etídio, e detecção de fluorescência pode ser obtida com UV ou luz azul.

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

Aqui, é apresentado um protocolo para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, usando exemplos de enzimas ligase, nuclease e polimerase. O ensaio utiliza oligonucleotídeos marcados e não marcados com fluorescência que podem ser combinados para formar duplexes que imitam danos ao RNA e/ou DNA ou intermediários da via, permitindo a caracterização do comportamento enzimático.

Usando oligonucleotídeos sintéticos modificados para testar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Este protocolo descreve o projeto de sondas de hibridização dividida utilizando o aptâmero de luz fluorescente DAP-10-42 como repórter de sinal e sua aplicação para detecção de ácido nucleico e diferenciação entre alvos com substituições de nucleotídeo único.

Sonda de hibridização dividida utilizando um aptâmero de luz fluorescente de DNA como repórter de sinal para análise de ácido nucleico de sequência específica

Aprenda a realizar ensaios de mobilidade eletroforética com sondas de DNA marcadas com corante infravermelho fluorescente. Este método não radioativo detecta interações proteína-DNA de forma segura e eficiente em biologia molecular.

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados (Vídeo) | JoVE Journal

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

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