Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

O objetivo geral deste ensaio é detectar interações proteína-DNA utilizando sondas não radioativas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biologia molecular e bioquímica, como a determinação da sequência alvo de DNA de proteínas. A principal vantagem desta técnica é que ela representa uma alternativa fácil, segura e que economiza tempo em comparação com o uso de sondas radioativas.

Para iniciar este procedimento, prepare um gel nativo de poliacrilamida a 5% contendo TBE (tris borato EDTA) 0,5x e glicerol a 2,5%, utilizando um sistema de gel proteico mini. Para preparar 30 mililitros da solução de gel para quatro géis, misture água destilada, TBE, persulfato de amônio, TEMED, acrilamida-bis e glicerol. Passe imediatamente a solução do gel.

Após a polimerização, enrole os géis em filme plástico transparente previamente umedecido com TBE 0,5x e armazene-os a quatro graus Celsius. Em seguida, projete um oligonucleotídeo longo com cerca de 51 mers. Projete oligonucleotídeos curtos complementares com cerca de 14 mers, com modificação por corante fluorescente no infravermelho no extremo cinco primário.

Uma vez que os oligonucleotídeos tenham sido preparados, reconstitua-os em tampão Tris-EDTA 1x até uma concentração final de 100 micromolar. Para o emparelhamento, misture 0,6 microlitro do oligonucleotídeo curto marcado com corante na extremidade 5', 1,2 microlitro do oligonucleotídeo longo e 28,2 microlitros de tampão Tris-EDTA com cloreto de sódio em um tubo de 1,5 mililitro. Coloque o tubo em água fervente por cinco minutos, desligue então a fonte de calor e deixe a água com os oligonucleotídeos emparelhados esfriar durante a noite no escuro.

Para produzir sondas de DNA de dupla fita, misture 30 microlitros dos oligonucleotídeos anelados com dNTPs, tampão Klenow, marcador corante Klenow cinco primas e água bidestilada em um tubo PCR de 0,2 mililitro. Incube a mistura por 60 minutos a 37 graus Celsius em uma máquina de PCR. Em seguida, adicione 3,4 microlitros de EDTA 0,5 molar para interromper a reação e inative pelo calor a 75 graus Celsius por 20 minutos na máquina de PCR.

Em seguida, dilua as sondas preenchidas com tampão de cloreto de sódio Tris-EDTA até uma concentração final de 0,1 micromolar. Armazene os oligonucleotídeos a menos 20 graus Celsius, no escuro, até o momento do uso. Para preparar as sondas não marcadas, misture 20 microlitros de oligonucleotídeo longo, 20 microlitros do oligonucleotídeo Long R e 60 microlitros de tampão de cloreto de sódio Tris-EDTA em um tubo de 1,5 mililitro.

Coloque o tubo em água fervente por cinco minutos, depois desligue a fonte de calor e deixe a água com os oligos anelados esfriar durante a noite. Prepare um mililitro de tampão de ligação 5x misturando Tris HCl, Cloreto de Sódio, Cloreto de Potássio, Cloreto de Magnésio, EDTA, DTT, BSA e água bidestilada. Antes de montar as reações de ligação, faça uma pré-eletroforese do gel de poliacrilamida nativo 5% em TBE 0,5x e glicerol 2,5% para remover todos os vestígios de persulfato de amônio, aplicando 80 volts por 30 minutos a uma hora, ou até que a corrente não varie mais com o tempo.

Em seguida, misture quatro microlitros de tampão de ligação 5x, 80 a 200 nanogramas da proteína A purificada, um microlitro da sonda conjugada com corante 0,1 micromolar e água bidestilada. Incube a mistura à temperatura ambiente, no escuro, por 15 minutos. Após a incubação, carregue toda a reação de ligação no gel e eletroforese o gel a 10 volts por centímetro até a distância desejada.

Cubra o aparelho de eletroforese com alumínio para manter o gel na escuridão o máximo possível. Limpe a plataforma de um sistema de imagem infravermelha com água destilada. Seque com pano macio as placas de vidro contendo o gel e coloque-as sobre a plataforma do escâner.

Abra o software de imagem infravermelha e clique na guia Adquirir. Para placas mais espessas, use as configurações de 700 para o canal, automático para intensidade, 84 micrômetros para resolução, média para qualidade e 3,5 milímetros para deslocamento de foco. Selecione a área que o gel ocupa no scanner.

Por fim, clique em Iniciar para começar a varredura. O progresso da eletroforese pode ser visualizado com o corante de carga Orange G, enquanto o azul de bromofenol é detectado durante a varredura e, portanto, interfere na análise de imagem. A adição de dI-dC à reação de ligação aboliu a ligação do 6xHis-SOX-2 purificado com as sondas de DNA marcadas com corante no extremo 5’.

O mutante LIM-4 e a sonda fria SOX-2 com o sítio de ligação do LIM-4 mutado são tão eficientes quanto a sonda fria do tipo selvagem na competição com a sonda marcada com corante fluorescente no infravermelho pela ligação ao 6xHis-SOX-2. No entanto, a eficiência de competição da sonda fria duplamente mutante em LIM-4 e SOX-2, com o sítio de ligação do SOX-2 mutado, é muito menor do que a da sonda fria do tipo selvagem na ligação ao 6xHis-SOX-2. Ensaios de supershift do complexo DNA-SOX-2 utilizando epítopos 6xHis e flag resultaram em uma banda de DNA-SOX-2 supershiftada.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a quatro horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as sondas de infravermelho no escuro. Após este procedimento, outros métodos, como a edição do genoma com CRISPR cas9, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como a importância de uma sequência específica de ligação ao DNA.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de bioquímica explorarem interações proteína-DNA em diversos organismos modelo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar interações proteína-DNA utilizando marcadores de DNA não radioativos. Não se esqueça de que trabalhar com acrilamida pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamentos de proteção individual, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.