Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética para Detecção de Complexos de Fator de Transcrição-DNA

Proteínas reguladoras, como fatores de transcrição, reconhecem e se ligam a sequências específicas de DNA em regiões promotoras, regulando a expressão gênica.

Para detectar interações específicas do fator de transcrição-DNA usando o ensaio de mudança de mobilidade eletroforética, comece com um tubo contendo um fator de transcrição desejado e sondas de DNA marcadas com corante fluorescente e infravermelho curtas específicas em um tampão de ligação. Incubar no escuro, evitando o fotobranqueamento do corante.

A força iônica e o pH do tampão fornecem condições adequadas para o fator de transcrição identificar e ligar sequências de ligação específicas na sonda de DNA. Os íons de magnésio no tampão estabilizam ainda mais os complexos proteína-DNA.

Adicione um corante de carga adequado à mistura, ajudando a visualizar a progressão da eletroforese. Carregue esta mistura e sondas de DNA nos poços de um gel de poliacrilamida pré-moldado e não desnaturante.

Realize eletroforese no escuro.

O campo elétrico aplicado faz com que sondas de DNA de baixo peso molecular, não ligadas e carregadas negativamente se movam através do gel em direção a ânodos carregados positivamente. No entanto, os grandes complexos de sonda proteína-DNA - com maior peso molecular - migram lentamente, levando a uma migração atrasada e mudança na mobilidade do DNA no gel.

Após a eletroforese, escaneie o gel usando um sistema de imagem infravermelha, visualizando as sondas de DNA marcadas com corante fluorescente infravermelho.

Uma banda de sonda de DNA livre está na parte inferior do gel, enquanto os complexos proteína-DNA aparecem como uma banda deslocada no gel, indicando a formação do complexo proteína-DNA.

Prepare 1 mililitro de tampão de ligação 5X misturando Tris-HCl, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, EDTA, DTT, BSA e água bidestilada

Antes de configurar as reações de ligação, execute previamente o gel de poliacrilamida nativo a 5% em 0,5X TBE e glicerol a 2,5% para remover todos os vestígios de persulfato de amônio a 80 volts por 30 minutos a 1 hora ou até que a corrente não varie mais com o tempo.

Em seguida, misture 4 microlitros de tampão de ligação 5X, 80 a 200 nanogramas de proteína A purificada, 1 microlitro de sonda conjugada com corante 0,1 micromolar e água bidestilada Incube a mistura em temperatura ambiente no escuro por 15 minutos.

Após a incubação, carregue toda a reação de ligação no gel e execute o gel a 10 volts por centímetro até a distância desejada. Cubra o aparelho de gel com alumínio para manter o gel no escuro o máximo possível.

Limpe o leito do scanner de um sistema de imagem infravermelha com água destilada. Seque com um pano de fundo as placas de vidro que contêm o gel e coloque-as na base do scanner. Abra o software de imagem infravermelha e clique na guia "Adquirir".

Para placas mais grossas, use as configurações de '700' para "Canal", 'Auto' para "Intensidade", '84 micrômetros' para "Resolução", 'Médio' para "Qualidade" e '3.5 milímetros' para "Deslocamento de foco". Selecione a área que o gel ocupa no scanner. Por fim, clique em "Iniciar" para iniciar a verificação.