Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso do método de microscopia de luz fluorescente e crioeletrônica correlata por meio de imagens dinâmicas de pequenas partículas de HIV interagindo com células hela hospedeiras. Isso é feito primeiro plaqueando e cultivando células heela na grade EM do localizador de ouro em uma placa de cultura com fundo de vidro e infectando células heela com partículas de HIV marcadas com GFP. O segundo passo é coletar imagens confocais de células vivas 3D de alta velocidade com lapso de tempo de células infectadas pelo HIV e analisar as imagens por rastreamento automatizado de partículas 3D para dinâmica de partícula única após a vitrificação.

A amostra, as mesmas partículas virais dos dados de imagem de células vivas, estão localizadas em imagens criofluorescentes para análise adicional de tomografia crioeletrônica 3D de alta resolução. A etapa final é coletar séries de projeção criogênica EM inclinadas para todas as posições identificadas contendo partículas de HIV um e reconstruir toms 3D com um algoritmo de projeção reversa ponderado usando o software imad. Em última análise, a microscopia de fluorescência de células vivas correlatas 3D avançada e a tomografia crioeletrônica de alta resolução são usadas para visualizar diretamente as partículas virais limitadas por difração dinâmica e suas interações com as células hospedeiras.