Name: Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Aprenda microscopia correlativa para análise estrutural 3D de interações dinâmicas entre partículas de HIV-1 e células HeLa. Este método integra microscopia de fluorescência e tomografia criogênica.

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Os autores gostariam de agradecer Travis Wheeler ea loja de máquina do Departamento de Biologia Celular e Fisiologia da Universidade de Pittsburgh para a construção do palco amostra crio-fluorescência, Changlu e Tao Cheng Xu, da Universidade de Ciência e Tecnologia da China para técnico assistência, e Dr. Teresa Brosenitsch para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (GM082251 &amp; GM085043).

1. Cultura de células HeLa em revestido de carbono, EM Localizador Grids ouro <ol><li> Descarga luminescente do lado de carbono de um R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil ouro EM localizador grade com menos de 25 mA para 25 seg. </li><li> Brasão da grade EM com fibronectina, flutuando-lo, do lado do carbono para baixo, em uma gota de 40 mL de 50 mg / ml solução fibronectina, em seguida, desinfectá-lo sob a luz UV por 2 horas em uma capa de cultura de tecidos. </li><li> As células HeLa placa na grade a uma densidade de 2 x 4 10 células / ml (total de 2 ml de cultura) em uma placa de cultura de vidro de fundo e crescer as células a 37 ° C, com 5% de CO2, em DMEM suplementado com 4,5 g / L de L-glutamina e glicose, 10% de soro inactivado pelo calor fetal de vitelo, 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, por aproximadamente 18 horas. As células HeLa são infectadas após S / N cultura. </li></ol> 2. HIV-1 e infecção de células imagens ao vivo <ol><li> Adicionar um rastreador celular fluorescente (CMTPX Red, 1 ml / 2 ml) para a cultura com fundo de vidroprato (a partir do passo 1.3) e incubar o prato a 37 ° C durante 10 minutos, para permitir a absorção dos do corante fluorescente. </li><li> Lavar as células com PBS e adicionar 50 ul de meio fresco pré-aquecido. </li><li> Coloque o prato sobre a câmara da célula viva, a 37 ° C, de um campo varrido microscópio confocal scanner. Selecione vários campos (10-15 posições) que contêm 1-3 células / quadrados, com as células entre duas fases de mitose quando eles estão mais espalhada e plana (ver Figuras 2C e 2D), pois requer cryoEM regiões relativamente finas do amostra. Guarde estas posições para a imagem futura (passo 2.5). </li><li> Infectar as células com VSV-G pseudo tipados HIV-1 que contêm partículas de GFP-Vpr (usamos 40 uL de uma amostra contendo 40 ng / ml de p24). Quando a adição das partículas de vírus na parte inferior do prato, ter o cuidado de não perturbar a grade EM, uma vez que as posições para a imagiologia já foram seleccionados e armazenados. </li><li> Imediatamente após a adição de viriões, recolher time-lapse de alta velocidade imagens confocal 3D, nas posições previamente selecionadas (a partir do passo 2.3) para 20-40 min. </li><li> Imagens confocal foram adquiridos usando MetaMorph e analisados ​​pelo rastreamento de partículas 3D automatizado para a dinâmica de partículas individuais, utilizando software Imaris (veja a Figura 1). Uma vez que estamos relacionando o comportamento dinâmico de difração limitada HIV-1 com partículas ultra celular, time-lapse de imagens ao vivo de células e de rastreamento de partículas 3D são fundamentais para os resultados. No entanto, para uma estrutura grande e estática, uma imagem de fluorescência simples (sem células viva) seria suficiente para a análise correlativos. </li></ol> 3. Frozen-hidratado EM Preparação de Amostras Para minimizar o atraso de tempo entre a colheita da última imagem confocal e crio-fixação da amostra, a FEI Vitrobot (ou outro dispositivo de vitrificação) deve ser iniciado e preparado para imersão de congelamento durante a recolha de imagens ao vivo de células de fluorescência confocal.<ol><li> Ligue o dispositivo de vitrificação e definir a sua temperatura ambiente até 22 ° C, a humidade alvo de 100%, o tempo de blotting para 7 seg, e o tempo de espera e tempo para drenar um seg. </li><li> Coloque a caixa de armazenamento da rede no êmbolo Dewar e preparar etano líquido frio. Monte o Dewar para o dispositivo vitrificação. </li><li> Imediatamente após imagens de células ao vivo confocal (seção 2), coloque o prato de cultura em um bloco de cobre resfriado e transferi-lo para a sala de preparação de amostras cryoEM. Coloque a grade de EM para a pinça especializados e rapidamente apagar afastado todos os meios de comunicação sobre a grade. O mata-borrão é feito manualmente, com papel de filtro, após o que 4 ul de solução de 15 nm de ouro grânulo misturado com microesferas fluorescentes de 0,2 um é imediatamente colocada na grelha. As contas de ouro são utilizados como marcadores fiduciais para auxiliar a recolha de dados tomográficos e alinhamento. As microesferas fluorescentes são usadas para ajudar correlação entre as imagens fluorescentes e cryoEM (Veja Figuras 2c-2F). </li><li> Coloque as pinças para o dispositivo de vitrificação e instruir o dispositivo para apagar e mergulhar congelamento em etano líquido 16. Os parâmetros optimizados blotting para alcançar o melhor resultado são: tempo blot, 7 seg; blot deslocamento, 0; tempo de drenagem, 1 s, a temperatura de 22 ° C, e humidade de 100%. </li><li> Transferir a grade congelado-hidratado a um detentor cryoEM para imagiologia cryoET imediata, ou para um armazenamento de azoto líquido para posterior utilização do dewar. </li></ol> 4. Cryo-fluorescência Microscopia de Luz Um sistema de home-built, câmara de amostra crio-fluorescência e fase (Figura 3) é necessária para levar a cabo os passos 4,1-4,10. As especificações detalhadas e descrição da fase pode ser encontrada em junho et al. 15. <ol><li> Encha um líquido auto-pressurizado nitrogênio Dewar com nitrogênio líquido, pelo menos 2 horas antes de começar a microscopia de luz crio-fluorescência (ver Figura 3A). </li><li> Montar uma homebuilt crio-ffase de amostra luorescence 15 (Figura 3) num microscópio de fluorescência invertida de luz, tal como uma Olympus IX 71. </li><li> Ligação a entrada de azoto líquido da fase de crio-amostra ao Dewar auto-pressurizado e colocar a tomada de protecção de sobrecarga de azoto líquido para um recipiente adequado. Conecte uma linha de gás nitrogênio seco a uma luva colocada sobre a lente objetiva manter a lente quente e livre de geada. </li><li> Depositar uma plataforma de bloco de cobre (seta preta na Figura 3b) para a câmara de-fase de crio para o carregamento da grelha amostra congelada-hidratado. Esfriar e encha a câmara de estágio crio cobre com nitrogênio líquido através da linha de entrada da auto-pressurizado Dewar enchimento. </li><li> Quando o estágio crio atinge a temperatura de nitrogênio líquido (em ~ 4-6 min), a transferência de caixa de armazenamento da rede (a partir do passo 3.5) para o estágio crio. </li><li> Coloque a grade de amostra congelada hidratado no cartucho espécime EM sobre o bloco de cobre e clipe da glivrar no local usando um anel C (se estiver usando um cartucho de microscópio Polara), ou colocar um anel de cobre pré-arrefecido na parte superior (seta preta na figura 3d), para manter a grade no lugar e também para facilitar a recuperação da rede após imagem crio-fluorescência (se, por um não-Polara microscópio crio-eletrônico). </li><li> Coloque o cartucho (a partir do passo 4.6) na câmara interior do crio-fase (seta branca na Figura 3b). </li><li> Procurar e encontrar as mesmas partículas virais a partir dos dados de imagem em células vivas. Desde a grade EM tem um índice, é fácil de localizar a mesma partícula no grid em ambas as imagens de células ao vivo e imagens de crio-florescence. </li><li> Adquirir crio-DIC e imagens GFP nas posições identificadas de acordo com crio-condição, utilizando um microscópio de luz com um longo trabalho (2,7-4 mm) lente objetiva. Durante a imagem crio-fluorescência, verificar periodicamente o nível de nitrogênio líquido no estágio crio e recarregá-lo, se necessário, para manter a fase de amostra abaixo -170° C. </li><li> Após a conclusão da imagiologia crio-fluorescência, cuidadosamente devolver o cartucho de amostra até a plataforma de bloco de cobre e armazenar o cartucho num vaso Dewar de azoto líquido para análise futura cryoET com um sistema Polara. Se estiver usando um não-Polara microscópio crio-eletrônico, retire o anel de cobre, recuperar a malha amostral, coloque-o em uma caixa de armazenamento de rede, e armazenar a amostra em nitrogênio líquido Dewar até que a amostra é analisada por cryoET. </li><li> Para a análise de dados, se sobrepõem os crio-DIC e GFP imagens obtidas a partir do passo (4.9, ver figura 4b) e correlacionar as posições dos sinais de GFP na imagem crio-fluorescência com aqueles obtidos na série de imagens ao vivo de células. </li></ol> 5. Cryo-elétron Tomografia <ol><li> Coloque o cartucho de amostra para a estação de um microscópio eletrônico equipado com uma arma de emissão de campo, como Polara G2 microscópio crio-transferência. </li><li> Em modo de baixa-dose-pesquisa com uma ampliação de 140X, identify e salvar as quadrículas associadas (a partir do passo 4.11) em um arquivo de palco. </li><li> Sob o modo de baixa dose busca em uma ampliação de 3.500 X, insira um 100 mM objetivo abertura, busca e salvar todos os cargos correlacionados com sinais GFP em um segundo arquivo de palco. </li><li> Sob o modo de baixa dose de exposição, encontrar uma área em branco para ajustar a intensidade do feixe a uma dose de 1 ou 2 e - / a 2 e refinar o eixo de inclinação, usando a função y palco, pela queima de longe o gelo em uma região de carbono sem importância com várias contas de ouro. </li><li> No modo de baixa dose de focagem, ajuste a distância focal para ~ 3 mM e ajustar o ângulo de alinhamento da direcção do foco a ser paralelo ao eixo de inclinação. </li><li> Sob o modo de baixa dose-pesquisa, lembre-se posições salvas (a partir do passo 5.3), ajuste a altura eucentric amostra e verificar a faixa de inclinação para a área de interesse. Adquirir uma imagem de projeção com muito baixa dose de elétrons (~ 1 e - / a 2) entre 8 e 10 um desfocagem, em exposiçõesmodo ure, para confirmar as partículas do vírus correlatos para tomografia crio-eletrônico. </li><li> Mude para o modo de baixa dose-foco. No menu de funções de auto TEM, preceder a altura eucentric automatizada e concentrar funções na área do foco. </li><li> Configurar os parâmetros para a aquisição de uma série de inclinação. Para Figura 4 neste artigo, ângulos de inclinação variando ± 70 °, abaixo e acima de 45 °, a 3 ° e 2 ° de inclinação incrementos, respectivamente, foram utilizados, com 6 um desfocar e aproximadamente 70 e - / uma dose de 2 total. </li><li> Repita os passos 5.7 e 5.8 para todos os cargos salvos. Batch tomografia software pode ser utilizado para a recolha automática de dados em múltiplas posições para aumentar o rendimento. </li></ol> 6. Reconstrução tridimensional usando IMOD 17 <ol><li> Inspecione a série tilt-prima para ajustar os valores mínimos e máximos de densidade e determinar se há qualquer ponto de vista a ser excluído devido à mudança de imagem grande. </li><li> Comece eTomo e painel tomogram configuração usando o tipo de eixo, tamanho do pixel, diâmetro fiducial, etc. Em seguida, crie pt scripts. </li><li> Configurar o intervalo principal de tal forma que várias fases do cálculo tomogram pode ser ajustado / seguido simultaneamente. Modificar os parâmetros necessários e executar os programas específicos que são exigidos por cada etapa de processamento (Veja eTomo tutorial, <a href="http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html" target="_blank">http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html</a> ). </li><li> Na fase final, criar uma pilha alinhada completo (com uma média de erro residual inferior a 0,6) e reconstruir tomografias utilizando um algoritmo de projecção de trás ponderada em IMOD. </li><li> DeNoise áreas potenciais de interesse utilizando um programa de reforço da borda de difusão anisotrópica não linear implementado em 3D IMOD com parâmetros apropriados para aumentar o contraste e clareza. </li></ol>

<ol><li>Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cells+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visualizing cells at the nanoscale.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).</li>
<li>Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+3D+intermediates+of+membrane+fusion+in+herpes+simplex+virus+1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).</li>
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<li>Gousset, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+HIV-1+GAG+trafficking+in+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages.</a> PLoS Pathogens. 4, e1000015(2008).</li>
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<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+chemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr.</a> Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).</li>
<li>Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+structure+determination+of+native+mammalian+cells+using+cryo-FIB+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography.</a> Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).</li>
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<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).</li>
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<li>Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomography+of+vitreous+sections+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells.</a> Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).</li>
<li>Jun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+HIV-1+with+correlative+live-cell+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography.</a> Structure. 19, 1573-1581 (2011).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).</li>
<li>Agronskaia, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+fluorescence+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrated fluorescence and transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).</li>
<li>Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused-ion-beam+thinning+of+frozen-hydrated+biological+specimens+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 4, 215-217 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Nós apresentamos um conjunto simples de protocolos para fornecer uma abordagem correlativa avançada para analisar eventos celulares dinâmicos usando time-lapse imagens de fluorescência confocal, em células vivas seguido por cryoET. Nosso desenvolvimento metodológico para correlacionar a imagem ao vivo de células em 3D com alta resolução cryoET é fundamental para investigar muitos problemas biológicos desafiadoras, tais como a visualização, dinâmico (não estático, como relatado anteriormente), e difração limitada partícu...

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) é uma técnica de imagem poderosa que permite a visualização tridimensional (3D) de células e tecidos e fornece insights sobre a organização de organelas nativas e estruturas celulares com resolução molecular em um de perto o estado fisiológico 1. No entanto, a natureza inerentemente não corado de baixo contraste amostra congelada-hidratado, combinada com a sua sensibilidade à radiação, torna difícil localizar áreas de interesse dentro de uma célula e, subsequentemente, realizar a série de inclinação com êxito, sem danificar a zona alvo. A fim de superar estes problemas, uma abordagem que combina correlativo microscopia óptica e electrónica é necessária. Especificidades destacadas por meio de rotulagem fluorescente são identificados e localizado por microscopia de fluorescência de luz, e, em seguida, as suas coordenadas são transferidos para o microscópio electrónico de aquisição de dados estruturais de alta resolução em 3D. Este método correlativo ajuda para localizar o alvo de umreas de interesse a serem abordados. Devido à limitação da espessura da amostra com cryoEM (&lt;300 nm), actualmente apenas as regiões periféricas da célula são adequadas para análise estrutural por CryoET 3D. Reduzindo ainda mais a espessura das amostras congeladas hidratadas por vítreo secção 8 ou crio-concentrado feixe de íons (FIB) moagem 9 iria expandir a capacidade de imagem correlativa. Anteriormente, os métodos correlatos foram utilizados principalmente para facilitar a aquisição de dados cryoET para grandes e estática das estruturas 10-13. Nestes estudos, crio etapas foram implementadas para aceitar grades cryoEM e caber em cada um microscópio vertical ou um microscópio invertido 10,11,14. Embora a mudança grades parece bastante simples em seus projetos, há adicional de transferência etapas envolvidas para a grade de EM, aumentando a chance de que a grade pode ser deformada, danificada e contaminada. Recentemente, demonstrou um avanço técnico emmicroscopia correlativa que nos permite visualizar diretamente os eventos dinâmicos que são, por natureza, difícil de capturar, como o HIV-1 e as interações da célula hospedeira em estágios iniciais da infecção 15. Conseguimos isso através da concepção e implementação de um estágio da amostra crio-microscopia de luz que adapta um sistema de cartucho para minimizar os danos espécime devido ao manuseio da rede, facilitando assim a correlação. Nosso projeto inclui um suporte integrado cartucho espécime, permitindo que tanto crio-microscopia de luz e crio-eletrônico a ser realizado, em seqüência, no mesmo suporte da amostra, sem transferência de amostras, agilizando assim o processo correlato. Além disso, também implementado um procedimento de correlação exacta e fiável utilizando esferas de látex fluorescentes como marcadores fiduciais.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L Glicose com L-Glutamina</td><td>Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>F1141-1MG</td><td>Cultura de células HeLa em grades EM</td></tr><tr><td>Rastreador de células</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>C34552</td><td>Conjugados</td></tr> <tr><td></td><td>de ouro da proteína A CMTPX vermelhaTed Pella, Inc., Redding, CA</td><td>15822-1</td><td>15 nm diâmetro</td></tr><tr><td>0,2 &mu; m microesferas fluorescentes</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>F8811</td><td>Fluorescência amarelo-esverdeada</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino de bezerro inativado por calor</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura com fundo de vidro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Localizador de quantifoil de ouro EM grades</td><td>Quantifoil Micro Tools, Jena, Alemanha</td><td>R2 / 2 Au NH2 200 mesh</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4 ">Equipment</td></tr><tr><td>Dispositivo de descarga de brilho 100X</td><td>EMS, Hatfield, PA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico Tecnai Polara G2 com uma pistola de emissão de campo</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td>300 keV</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI, Hillsboro, OR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio Olympus IX 71</td><td>Olympus America Inc., Center Valley, PA</td><td></td><td>LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (distância de trabalho de 2.7-4 mm) lente objetiva</td></tr><tr><td>Nikon TiE microscópio Nikon</td><td>Instruments, Melville, NY</td><td></td><td>usando uma lente objetiva de imersão em óleo 60X/1.35 NA</td></tr><tr><td>Microscópio confocal Sweptfield</td><td>Prairie Technologies, Middleton, WI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tokai Atingiu a câmara de célula viva</td><td>Tóquio, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estágio de amostra de criofluorescência</td><td>Feito</td><td></td> em <td>casa Construído em casa por oficina mecânica, consulte a referência 15 para o design.</td></tr></tbody></table>

microscopia correlativo para análise estrutural 3d de interações dinâmicas

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) permite a visualização em 3D de estruturas celulares com resolução molecular em um estado próximo do fisiológico 1. No entanto, a visualização directa de complexos virais individuais no seu ambiente celular do hospedeiro com cryoET é um desafio 2, devido à natureza pouco frequentes e dinâmica de entrada viral, especialmente no caso do VIH-1. Enquanto lapso de tempo de imagem de células vivas produziu uma grande quantidade de informações sobre muitos aspectos do ciclo de HIV-janeiro 03-07 de vida, a resolução oferecida por microscopia de células vivas é limitado (~ 200 nm). Nosso trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método de correlação que permite a visualização direta dos eventos iniciais da infecção pelo HIV-1 pela combinação de microscopia de luz fluorescente de células vivas, crio-microscopia fluorescente e cryoET. Deste modo, os sinais vivo de células e crio-fluorescente pode ser utilizada para orientar a amostragem de precisão cryoET. Além disso, a informação estrutural obtida a partir de cryoET pode be complementado com os dados funcionais dinâmicos adquirida através de imagens ao vivo de células de alvo marcado fluorescente. Neste artigo de vídeo, nós fornecemos métodos detalhados e protocolos para investigação estrutural do HIV-1 e interações célula hospedeira usando imagens ao vivo de células em 3D correlativo de alta velocidade e análise estrutural cryoET de alta resolução. As células HeLa infectadas com o HIV-1 partículas foram caracterizadas pela primeira vez por microscopia confocal em células vivas, e a região contendo a mesma partícula viral foi então analisado por tomografia crio-electrónica para detalhes estruturais 3D. A correlação entre dois conjuntos de dados de imagem, de imagem óptica e eletrônica de imagem, foi realizada através de microscopia de luz fase crio-fluorescência construídos em casa. A abordagem aqui pormenorizadas serão úteis não só para o estudo das interacções das células do vírus-hospedeiro, mas também para várias aplicações em biologia celular, tais como sinalização, o tráfico de receptor de membrana da célula, e em muitos outros processos celulares dinâmicas. &lt;/ P&gt;

Para caracterizar o comportamento dinâmico das partículas de vírus, as células HeLa infectadas com o HIV-1 foram visualizados por meio de microscopia confocal de células vivo de alta velocidade e os movimentos das partículas foram analisadas por rastreamento automatizado de partículas 3D (Figura 1). Para evitar que o lapso de tempo de vários minutos, que pode ocorrer entre a colheita da última imagem ao vivo de células confocal e de imersão de congelação (o que pode ser suficiente para perder correlacio...

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar a utilização do método correlativo de microscopia de fluorescência e microscopia crioeletrônica por meio da obtenção de imagens de partículas pequenas e dinâmicas do HIV-1 interagindo com células hospedeiras HeLa. Isso é realizado primeiramente cultivando células HeLa sobre uma grade EM com marcador de ouro em uma placa de cultura com fundo de vidro e infectando as células HeLa com partículas do HIV-1 marcadas com GFP. O segundo passo consiste em coletar imagens confocais tridimensionais em tempo real e alta velocidade de células infectadas pelo HIV-1 e analisar essas imagens por meio de rastreamento automatizado de partículas em 3D para estudar a dinâmica de partículas individuais após a vitrificação.A amostra, as mesmas partículas virais dos dados de microscopia de imagem em células vivas, é localizada em imagens criofluorescentes para análise adicional por tomografia eletrônica criogênica tridimensional de alta resolução. O passo final consiste em coletar séries de projeções criogênicas com inclinação para todas as posições identificadas contendo partículas do HIV-1 e reconstruir tomografias 3D com um algoritmo de retroprojeção po

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Quadridimensional (4D) de imagem é utilizada para estudar o comportamento e as interacções entre os dois tipos de endossomas em terminais nervosos vertebrado vivo. O movimento destas pequenas estruturas é caracterizado em três dimensões, permitindo a confirmação de eventos, tais como a fusão do endossoma e exocitose.

Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

Aqui, apresentamos um método, cocem3D, para desvendar a ultraestrutura de uma célula específica em seu tecido nativo por meio da microscopia eletrônica de varredura de face de bloco confocal e serial.

Correlativo Confocal e Microscopia Eletrônica 3D de uma célula sensorial específica

Para investigar as velocidades de fluxo e a direcionalidade da actina filamentosa na sinapse imunológica das células T, a imagem de super-resolução de células vivas é combinada com fluorescência de reflexão interna total e quantificada com espectroscopia de correlação de imagem espaço-temporal.

Cortical actina Fluxo nas células T quantificada pela correlação espacial e temporal Imagem Espectroscopia de iluminação estruturada Microscopia Dados

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de três cores de smFRET e sua análise com um ensemble 3D Hidden Markov modelo. Com esta abordagem, cientistas podem extrair informações cinéticas de sistemas complexos proteína, incluindo cooperatividade ou interações correlacionadas.

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Este protocolo explica como preparar e montar amostras bacterianas para imagens tridimensionais vivas e como reconstruir a forma tridimensional de E. coli a partir dessas imagens.

Imagem tridimensional de células bacterianas para representações celulares precisas e localização precisa de proteínas

O presente protocolo descreve um método para visualizar e medir anéis de actina e outros componentes do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial do axônio usando neurônios hipocampais de ratos cultivados e microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM).

Propriedades de medição do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial de axônio usando microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM)

Aqui, um ensaio de reconstituição in vitro baseado em microscopia TIRF é apresentado para quantificar e comparar simultaneamente a dinâmica de duas populações de microtúbulos. Um método é descrito para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplas proteínas associadas a microtúbulos em feixes de microtúbulos interligados e microtúbulos únicos.

Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Apresentamos um protocolo para a implementação de microscopia de reflexão de interferência e microscopia de reflexão interna-fluorescência para a imagem simultânea de microtúbulos dinâmicos e proteínas fluorescentes rotuladas como microtubulas.

Reflexão de Interferência Simultânea e Microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total para Microtúbulos Dinâmicos de Imagem e Proteínas Associadas

A microscopia dinâmica diferencial (DDM) combina características de dispersão dinâmica de luz e microscopia. Aqui, é apresentado o processo de utilização do DDM para caracterizar redes de citoesqueleto reconstituídas quantificando a dinâmica subdiffusiva e enjaulada de partículas em redes de vimentina e o movimento balístico de compostos ativos de actin-microtubulos movidos a miose.

Quantificando a Dinâmica do Citoesqueleto usando microscopia dinâmica diferencial

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

Este protocolo descreve em detalhes como construir um microscópio de fluorescência de lâmina de luz de objetiva única e seu uso para visualizar redes de citoesqueleto.

Projeto e Construção de um Microscópio de Fluorescência de Lâmina de Luz Personalizável, de Objetiva Única para a Visualização de Redes de Citoesqueleto

Aprenda microscopia correlativa para análise estrutural 3D de interações dinâmicas entre partículas de HIV-1 e células HeLa. Este método integra microscopia de fluorescência e tomografia criogênica.

Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

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