Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o uso do método de microscopia de luz fluorescente e crioeletrônica correlata por meio de imagens dinâmicas de pequenas partículas de HIV interagindo com células hela hospedeiras. Isso é feito primeiro plaqueando e cultivando células heela na grade EM do localizador de ouro em uma placa de cultura com fundo de vidro e infectando células heela com partículas de HIV marcadas com GFP. O segundo passo é coletar imagens confocais de células vivas 3D de alta velocidade com lapso de tempo de células infectadas pelo HIV e analisar as imagens por rastreamento automatizado de partículas 3D para dinâmica de partícula única após a vitrificação.

A amostra, as mesmas partículas virais dos dados de imagem de células vivas, estão localizadas em imagens criofluorescentes para análise adicional de tomografia crioeletrônica 3D de alta resolução. A etapa final é coletar séries de projeção criogênica EM inclinadas para todas as posições identificadas contendo partículas de HIV um e reconstruir toms 3D com um algoritmo de projeção reversa ponderado usando o software imad. Em última análise, a microscopia de fluorescência de células vivas correlatas 3D avançada e a tomografia crioeletrônica de alta resolução são usadas para visualizar diretamente as partículas virais limitadas por difração dinâmica e suas interações com as células hospedeiras.

Nosso trabalho visa desenvolver um método de correlação que permita a visualização direta de apenas eventos de infecção pelo HIV uma Ao combinar fluorescentes de células vivas como microscopia, microscopia criofluorescente e tomografia crioeletrônica dessa maneira, os sinais de células vivas e criofluorescentes podem ser usados para orientar bastante a amostragem na tomografia crioeletrônica. Além disso, as informações estruturais obtidas da tomografia crioeletrônica podem ser complementadas com os dados funcionais dinâmicos disponíveis por meio de imagens de estilo de vida de alvos marcados com fluorescência. A principal vantagem desta técnica ou método existente é que a imagem de estilo de vida 3D correlativa avançada de alta velocidade com abordagem de tomografia eletrônica de coral 3D de alta resolução é aplicada para estudar eventos dinâmicos que são, por natureza, difíceis de detectar, como HIV tipo um e interações de células hospedeiras no estágio inicial da infecção.

Para preparar a grade para o brilho da cultura de células, descarregue o lado de carbono de uma folha de 200 mesh R dois sobre dois quanti, grade localizadora de EM dourada abaixo de 25 miliamperes por 25 segundos. Cubra a grade EM com nin de fibra, flutuando-a com o lado do carbono para baixo em uma gota de 40 microlitros de 50 microgramas por solução de nin de fibra de mililitro. Deixe-o em uma capa de cultura de tecidos sob luz ultravioleta por duas horas para desinfecção das células da placa na grade a uma densidade de duas vezes 10 elevado ao quarto de células por mililitro em uma placa de cultura com fundo de vidro.

Em DMEM com suplementos apropriados, incubar células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por aproximadamente 18 horas antes da infecção pelo HIV uma antes da infecção pelo HIV, adicionar um rastreador de células fluorescentes às células hela na placa de cultura com fundo de vidro e incubar a placa a 37 graus Celsius por 10 minutos para permitir a absorção do corante fluorescente, lave as células com PBS e adicione 50 microlitros de meio fresco pré-aquecido. Coloque o prato na câmara de células vivas a 37 graus Celsius de um microscópio de scanner confocal de campo varrido. Uma vez que o EM criogênico requer regiões relativamente finas da amostra.

Selecione vários campos que contenham de uma a três células por quadrado com as células entre duas fases de mitose quando elas estão mais espalhadas e planas, armazene essas posições com o software de elemento NIS para imagens futuras. Em seguida, infecte as células com VSVG, partículas pseudotipadas do HIV um que contêm G-F-P-V-P-R e as partículas do vírus no fundo do prato, tomando cuidado para não perturbar a grade EM. Uma vez que as posições para a imagem já foram selecionadas e armazenadas imediatamente após a adição dos varians, colete imagens confocais 3D de alta velocidade com lapso de tempo nas posições previamente selecionadas por 20 a 40 minutos.

Imediatamente após a imagem confocal de células vivas, coloque a placa de cultura em um bloco de cobre resfriado com gelo e transfira-a para a sala de preparação de amostras criogênicas EM. Carregue a grade EM nas pinças especializadas, seque rapidamente o meio de cultura residual com papel de filtro e coloque imediatamente na grade para microlitros de uma solução de esferas de ouro de 15 nanômetros misturada com microesferas fluorescentes de 0,2 mícron. As microesferas fluorescentes são usadas para auxiliar na correlação entre fluorescente e crio-EM.

Carregue as pinças no dispositivo de vitrificação para congelamento por imersão com os parâmetros de borrão otimizados para obter os melhores resultados. Para iniciar o procedimento de microscopia de luz de criofluorescência, conecte uma linha de gás nitrogênio seco a uma luva colocada sobre a lente objetiva para manter a lente quente e livre de gelo, monte um estágio de amostra de criofluorescência construído em casa em um microscópio de luz de fluorescência invertida. Conecte a entrada de nitrogênio líquido do cryos sample stage ao fazedor autopressurizado e coloque a saída de proteção contra transbordamento de nitrogênio líquido em um recipiente apropriado.

Coloque a grade de amostra hidratada congelada no cartucho de amostra EM no bloco de cobre e coloque um anel de clipe C pré-resfriado na parte superior para manter a grade no lugar. Coloque o cartucho na câmara interna da pesquisa do estágio criogênico e encontre as mesmas partículas de vírus nos dados de imagem de células vivas. Como a grade EM tem um índice, é simples localizar a mesma partícula na grade em imagens de células vivas e imagens de criofluorescência.

Adquira imagens criogênicas DIC e de fluorescência nas posições identificadas sob condições criogênicas usando um microscópio de luz com uma lente objetiva longa e funcional. Durante a imagem de criofluorescência, verifique periodicamente o nível de nitrogênio líquido no estágio criogênico e reabasteça-o com um agente autopressurizado conforme necessário para manter o estágio de amostra abaixo de 170 graus Celsius negativos para tomografia crioeletrônica. Carregue a grade de amostra na estação de transferência criogênica de um microscópio eletrônico equipado com uma pistola de emissão de campo no modo de busca de baixa dose com uma ampliação de 140 x.

Identifique as regiões ou quadrados de grade onde as imagens de criofluorescência foram adquiridas. Grave uma imagem criogênica EM de baixa ampliação da área correlacionada e salve a posição em um arquivo de palco em um modo de pesquisa de baixa dose com uma ampliação de 3.500 x. Insira uma pesquisa de abertura de objetiva de 100 mícrons e salve todas as posições correlacionadas com os sinais GFP em um arquivo de segundo estágio.

Configure os parâmetros de tomografia para adquirir uma série de inclinação, incluindo faixa de ângulo de inclinação, dose de elétrons, valor de desfocagem e esquemas de inclinação. Adquira séries de inclinação para todas as posições salvas para iniciar este procedimento. Configure a janela principal de forma que várias etapas do cálculo Tomo Graham possam ser ajustadas ou seguidas simultaneamente, modifique os parâmetros necessários e execute os programas específicos exigidos por cada etapa de processamento.

No estágio final, crie uma pilha totalmente alinhada com um erro residual principal menor que 0,6 e reconstrua Toms usando um algoritmo de retroprojeção ponderado. Em Im mod para caracterizar o comportamento dinâmico das partículas de vírus. As células Hela infectadas com HIV um foram fotografadas por microscopia confocal de células vivas de alta velocidade e os movimentos das partículas foram analisados por rastreamento automatizado de partículas 3D.

Nesta figura representativa, uma única partícula viral fluorescente verde indicada pela ponta da seta amarela foi rastreada em pilhas confocais 3D com um intervalo de tempo de três minutos entre os quadros para evitar o lapso de tempo de vários minutos. Isso pode ocorrer entre a coleta da última imagem confocal de células vivas e o congelamento por imersão. Um estágio de microscopia de luz de fluorescência criogênica foi projetado e construído para obter imagens de amostras hidratadas congeladas dentro de cartuchos criogênicos EM.

Em microscópios de luz, o painel A mostra um agente autopressurizado preenchido com nitrogênio líquido que é usado para resfriar o estágio de amostra criogênica de cobre. O painel B mostra a parte superior do interior view do estágio de amostra criogênica com a câmara interna indicada pela ponta de seta branca. A grade de amostra é colocada no cartucho de amostra E EM, que fica no centro de uma plataforma de bloco de cobre indicada pela seta preta.

Esta plataforma foi adicionada para uso com microscópios eletrônicos não polares. Uma vez carregados com a grade de amostra, os cartuchos foram transferidos para a câmara interna para luz de fluorescência de grito. Os painéis de microscopia C e D mostram, respectivamente, o cartucho de amostra antes e depois de colocar um anel de cobre para manter a grade no lugar para uso com um microscópio crioeletrônico não polar.

A utilidade do procedimento para microscopia avançada de células de vida correlata e tomografia crioeletrônica é demonstrada com a visualização direta de partículas de HIV V one marcadas com fluorescência interagindo com uma célula heela hospedeira. Uma imagem DIC gravada com um estágio de microscopia de luz criogênica mostrado no painel A é sobreposta com uma imagem de fluorescência criogênica de partículas marcadas com GFP mostradas no painel B. As partículas marcadas são coloridas. Os painéis vermelhos C, D e E são imagens crio-EM de baixa dose da região contendo uma partícula fluorescente circulada nos painéis B e C em 140 x 3, 500 x e 27, 500 x, respectivamente.

A inserção no painel E é uma visão ampliada registrada após a aquisição dos painéis da série de inclinação tomográfica, FG e H mostram três cortes tomográficos de quatro nanômetros de espessura separados por uma distância de 21 nanômetros na direção Z. As conexões entre a partícula e a membrana celular helo são indicadas por setas na imagem de projeção na inserção e no painel E e nas fatias tomográficas. Nos painéis F e g.

Apresentamos um conjunto simples de protocolos para fornecer uma abordagem correlativa avançada para analisar interações dinâmicas de vírus e estéreis usando imagens de fluorescência de células lipo confocais com lapso de tempo seguidas de tomografia crioeletrônica. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a correlação precisa e confiável entre a imagem fluorescente e a imagem de microscopia eletrônica é fundamental para a aquisição bem-sucedida da tomografia eletrônica de corvo. Os dados descritos por este procedimento serão úteis para inúmeras aplicações envolvendo processos celulares dinâmicos em biologia celular, como a internalização do receptor de superfície de sinalização celular.