Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados Intestinalis Ciona

O objetivo geral das técnicas de transfecção transitória em embriões de Ciona é estudar a regulação gênica e a função necessária para formar larvas semelhantes a girinos, aproveitando sua linhagem celular invariante e genoma compacto de invertebrados, a fim de obter informações sobre as origens dos invertebrados cordados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genética molecular, como os mecanismos conservados do programa de desenvolvimento de cordados que são relevantes para a pesquisa com células-tronco e para a descoberta de medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que, com a eletroporação de embriões, você pode lidar com centenas ou milhares de embriões sincronizados em um dia.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades, por causa da descorionação do embrião frágil e porque é complicado desenvolver uma técnica de microinjeção eficiente. Comece dissecando adultos Ciona em uma sala de embriões resfriada a 18 graus Celsius. Use uma tesoura pequena para fazer uma incisão na extremidade oposta dos sifões e na lateral do sifão mais curto, sob o qual corre o oviduto e o ducto espermático.

Alongue a incisão para expor o oviduto. Em seguida, use a ponta da tesoura para fazer uma incisão precisa no oviduto. Pressione suavemente o oviduto com a tesoura fechada e retire os ovos.

Deixe os ovos caírem diretamente em uma placa de seis poços contendo água do mar artificial com HEPES. Use uma pipeta pasteur, pré-enxaguada com ASWH, para coletar e transferir os ovos restantes. Para coletar esperma, corte o ducto de esperma com a tesoura, use uma pipeta pasteur separada para coletar esperma concentrado e transfira para um tubo de 1,5 mililitro.

Ative o esperma combinando um mililitro de ASWH e 50 microlitros de Tris em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 20 microlitros de esperma concentrado, feche a tampa e misture delicadamente invertendo o tubo ou usando uma pipeta pasteur. Em seguida, adicione 100 a 200 microlitros da solução de esperma ativada a cada poço de óvulos e misture bem pipetando para cima e para baixo, de modo que os óvulos flutuem no meio.

Comece a descorionação coletando os zigotos e dispensando-os em tubos de vidro. Com a centrífuga manual, gire os zigotos a mil e duzentas vezes G por cerca de 20 segundos e, em seguida, pare lentamente a centrífuga. Remova o ASWH dos pellets com uma pipeta pasteur.

Adicione quatro mililitros de solução de descorionação ativada ao pellet em cada tubo. Suspenda os zigotos pipetando suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta pasteur tratada com água da torneira, coberta com uma pequena pêra de borracha. A solução deve ficar amarelada após 1 a 3 minutos.

Durante a descorionação, retirar uma pequena alíquota da suspensão descorionante, utilizando a pipeta pasteur. Deposite uma gota em uma lâmina e observe-a sob o microscópio de dissecação. Pipetar a suspensão do zigoto para cima e para baixo e verificar a lâmina a cada 20 a 30 segundos.

Primeiro as células foliculares se desprendem, depois o córion fica amarelo e opaco e, finalmente, se desprende dos zigotos. Os zigotos decorionados rosa afundam no fundo do tubo de vidro. Quando mais de 50% dos zigotos forem descorionados, encha o tubo com ASWH.

Centrifugue muito suavemente por cerca de 10 a 15 segundos, apenas o suficiente para sedimentar os zigotos descorionados. Pare a centrífuga lentamente. Remova quase todo o líquido do tubo de vidro, incluindo qualquer material flutuante, e substitua por ASWH.

Pipete lentamente para cima e para baixo para lavar e, em seguida, centrifugue suavemente como antes. Lave novamente até que não haja mais detritos de córion. Sedimento por gravidade da lavagem para zigotos descorionados em tubos siliconizados de 1,5 mililitro.

Após a sedimentação, remova o ASWH até a marca de 100 microlitros no tubo. Agora use uma pipeta pasteur para adicionar 250 microlitros de DNA previamente preparado em solução de manitol a um tubo de zigotos. Misture delicadamente e transfira imediatamente a mistura para uma cubeta de eletroporação de quatro milímetros.

Coloque a cubeta no suporte de eletroporação e dê um único pulso de 16 milissegundos a 50 volts. Em seguida, remova os zigotos da cubeta usando a mesma pipeta pasteur e expulse-os para uma placa de cultura contendo ASWH fresco e filtrado. Agite o prato para espalhar os zigotos.

Lave a pipeta em um béquer de ASWH e passe para a próxima amostra. Depois de elecroporing todos os zigotos, cultive os zigotos a 15 a 20 graus Celsius. Configure o micromanipulador em uma sala refrigerada a 18 graus Celsius.

Conecte o tubo de plástico e o porta-agulha a uma seringa de vidro de 10 mililitros cheia de óleo mineral. Encha o tubo e o porta-agulha com óleo e expulse as bolhas de ar. Insira a agulha de injeção contendo 0.5 microlitros de solução de injeção com corante vital verde no porta-agulhas.

E posicione o suporte no micromanipulador. Ajuste o porta-agulha para que ele se mova ao longo de uma linha reta em um ângulo de 45 graus em relação à superfície. Oriente os ovos descorionados em uma pequena placa de cultura revestida de agarose ao longo de uma reentrância, para que os ovos possam ser injetados um a um sob o microscópio de dissecação.

Se necessário, quebre a ponta da agulha empurrando suavemente a agulha contra um pedaço de lamínula de vidro, colocado sobre a agarose. Aplique uma leve pressão para verificar se a ponta da agulha está aberta. Injete os óvulos não fertilizados um por um, introduzindo primeiro a agulha no ovo e aspirando levemente para quebrar a membrana do ovo.

Em seguida, injete a solução de injeção verde no meio do ovo, até um máximo de um terço do diâmetro da célula. Depois de injetar todos os óvulos, remova a agulha, transfira os óvulos injetados e não fertilizados para uma placa de cultura fresca e incube a 15 a 18 graus Celsius até a fertilização. A microinjeção foi utilizada para estudar a regulação do fator de transcrição de mielina Ciona intestinalis ou, MyT, no estágio de gástrula de embriões de Ciona.

Monitorada por hibridização in situ, a expressão endógena é observada na sexta linha de precursores da placa neural no tipo selvagem. A microinjeção de morfolinos para derrubar fatores embrionários iniciais, como a caixa Forkhead A, um fator de transcrição, elimina a expressão geral de MyT. Por outro lado, a expressão de MyT é ativada ectopicamente após a regulação negativa do nodal, sugerindo que o nodal normalmente reprime a expressão de MyT nesses precursores do cordão nervoso lateral.

O fator de transcrição GATAa foi marcado com uma etiqueta de Vênus e eletroporado em blastômeros ectodérmicos com um driver pfog. Como visto aqui, o GATAa está localizado principalmente nos núcleos, como esperado para um fator de transcrição. Considerando que a expressão de Vênus é onipresente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a transfecção transitória por eletroporação em zigotos Ciona sincronizados, como lidar com os frágeis embriões descorionados e como encontrar o ângulo correto de microinjeção. Após seu desenvolvimento, essas técnicas abriram caminho para a genômica funcional. Explorar a função do gene, as redes reguladoras de genes e conservar os módulos de desenvolvimento, importantes para a formação de tecidos também em humanos.