Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato
20 de setembro de 2016
Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.
O objetivo geral deste procedimento é permitir que um microrganismo evolua em condições de laboratório. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como relações da função adrenal, respostas ao estresse, engenharia metabólica e, claro, evolução. A principal vantagem desta técnica é a seleção contínua do descendente mais persuadido em condições laboratoriais específicas.
Inicie este procedimento com a preparação do equipamento, bem como o meio inicial, o meio de tensão e o meio de alta tensão, conforme descrito no protocolo de texto. Inocular uma única colônia ou E.coli do tipo selvagem em um tubo de ensaio de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio inicial. Incube o tubo de ensaio em uma incubadora agitada por 12 horas a 37 graus Celsius e 220 rpm.
Incubar o frasco de quimiostato proporcionando aeração e agitação a 37 graus Celsius por seis horas. Após a incubação, conecte assepticamente a extremidade do tubo de silício das bombas ao frasco de quimiostato. Transfira assepticamente um mililitro de pré-cultura para o frasco de quimiostato.
Ligue a bomba de saída e colete a cultura na fase exponencial. Verifique a densidade óptica a 600 nanômetros da cultura da tubulação de saída. Em seguida, ligue a bomba de entrada.
Verifique a densidade óptica da cultura a 600 nanômetros da tubulação de saída a cada 24 horas. Depois de operar o quimiostato por 96 horas, que é uma rotatividade total de 9,6, troque o reservatório para a concentração mais baixa de meio de alta tensão. Quando você troca o reservatório por um meio de estresse mais alto, as células podem ficar chocadas.
Se a densidade celular for muito baixa, pare de alimentar o meio de estresse mais alto por algum tempo para restaurar a densidade celular. Se a densidade óptica for inferior a 0,2, pare a bomba de entrada de alimentação por seis horas. Reinicie a bomba de entrada e verifique se a densidade óptica é superior a 0.2.
Aumente gradualmente a concentração do estressor mudando gradualmente para um reservatório contendo uma concentração de estressor mais alta. Colete amostras da cultura adaptada sempre que atingir um marco de adaptação do estressor e armazene para análise genômica adicional. Para armazenamento de amostras, misture a amostra de cultura de 0,5 mililitro com 0,5 mililitros de uma solução esterilizada de glicerol a 80% e armazene-a a 80 graus Celsius.
Prepare o meio da placa 1.6%ager contendo o mesmo estressor na mesma concentração que no meio. Coloque 0,1 mililitros da cultura de saída do quimiostato e incube a 37 graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, retire as colônias individuais da placa usando um palito estéril e inocule-as em tubos de ensaio de 15 mililitros contendo o mesmo estressor e na mesma concentração média do quimiostato.
Incubar por seis horas. Transferir um mililitro do caldo de cultura para um erlenmeyer de 250 mililitros contendo 50 mililitros de meio. Colha 0,5 mililitros do caldo de cultura a cada hora e meça a densidade óptica em 600 nanômetros.
Compare a taxa de crescimento da cepa adaptada com a da cepa do tipo selvagem dado o estressor. A cepa de E.coli do tipo selvagem evoluiu em uma condição de estresse de alto succinato por 270 dias, o que corresponde a quase 930 gerações. Sempre que maior estresse de succinato foi adicionado, a concentração de biomassa foi imediatamente reduzida e depois restaurada.
Aqui é mostrado um diagrama esquemático do quimiostato com um mutante que é tolerante ao alto estresse do succinato. A maioria das células do tipo selvagem é lavada sob as condições de estresse e o mutante cresce mais. Eventualmente, a população do descendente mutante é aumentada.
A segunda e a terceira mutações são continuamente selecionadas e, eventualmente, dominam o quimiostato. Esta figura mostra que a cepa adaptada cresceu sem demora sob condições de alto estresse de succinato, enquanto a cepa do tipo selvagem não. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada à evolução laboratorial adaptativa usando um quimiostato com uma variação de estressores.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como adquirir e evoluir o microrganismo sob uma condição especificada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em alguns meses. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não lavar as células do quimiostato adicionando muito estresse de uma só vez e lembre-se de verificar a densidade óptica todos os dias.
Seguindo este procedimento, métodos como análise do genoma e análise do transcriptoma podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual mutação contribui para a evolução tolerante ao estresse?
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a evolução laboratorial adaptativa de microrganismos usando cultura em quimióstato. Discute a análise genômica da cepa evoluída e suas implicações em microbiologia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Evolução Laboratorial
- Análise Genômica
Fundamento
- A evolução laboratorial adaptativa permite que os microrganismos evoluam sob condições controladas.
- Este método pode fornecer insights sobre respostas ao estresse e engenharia metabólica.
- A seleção contínua de descendentes melhora o estudo dos processos evolutivos.
- A preparação inicial do meio é crucial para a implementação bem-sucedida.
Propósito do Estudo
- Permitir que os microrganismos evoluam em um ambiente laboratorial.
- Investigar as relações entre respostas ao estresse e adaptações evolutivas.
- Facilitar estudos de engenharia metabólica.
Métodos Utilizados
- Preparação de meio inicial, meio de estresse e meio de alto estresse.
- Inoculação de E. coli em um tubo de ensaio com meio inicial.
- Incubação em um incubador agitador em condições especificadas.
- Monitoramento contínuo da evolução microbiana.
Principais Resultados
- Evolução bem-sucedida de microrganismos sob condições controladas.
- Insights sobre mecanismos de resposta ao estresse.
- Potenciais aplicações em engenharia metabólica.
- A análise genômica revela adaptações em cepas evoluídas.
Conclusões
- O protocolo permite uma evolução laboratorial eficaz de microrganismos.
- Os resultados contribuem para a compreensão das adaptações microbianas.
- Este método pode ser aplicado a várias questões de pesquisa em microbiologia.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Adaptive laboratory evolution using chemostat culture enables continuous selection of microbial strains under controlled stress conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach generates diverse populations through high cell division rates, improving predictive confidence for strain engineering and pathway optimization. The method facilitates translational continuity by linking laboratory evolution to genomic and transcriptomic analysis for identifying adaptive mutations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through stressor-induced evolution and pathway clarification.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying dominant adaptive strains under selective pressure.
- Predictive Value: Generates diverse mutant populations for functional target validation and lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stabilized stress-tolerant phenotypes for downstream screening.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through continuous culture and defined stressor gradients.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple stressors and microbial hosts for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects evolved strain phenotypes to genomic changes, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Provides evolutionary continuity from discovery through preclinical validation via traceable adaptation milestones.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking stress tolerance to specific mutations.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supported by continuous selection and genomic analysis outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through controlled stressor exposure and mutant enrichment.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cultures with quantitative optical density monitoring for strain comparison.
- Analytics: Enables comparative genomic and transcriptome analysis to identify mutations contributing to stress tolerance.
- Translational Research: Connects laboratory evolution to preclinical continuity through documented adaptation milestones and cryopreserved samples.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evolving microorganisms under varying stressors across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in strain engineering by revealing mechanisms of stress adaptation.
- Operational Value: Reduces labor intensity post-setup through automated continuous culture and defined sampling intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking evolutionary outcomes to genomic drivers of fitness.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated adaptive mutations and growth performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, chemostat operation, and aseptic technique.
- Depends on instrumentation for precise pump control, aeration, agitation, and optical density monitoring.
- Necessitates cross-team standardization for media preparation, stressor gradients, and sampling protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring evolved strains to shake-flask or plate-based validation assays.
- Includes practical limitations such as cell washout risk under excessive stress and the need for daily optical density checks to maintain culture stability.
