Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

O objetivo geral deste procedimento é permitir que um microrganismo evolua em condições de laboratório. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da microbiologia, como relações da função adrenal, respostas ao estresse, engenharia metabólica e, claro, evolução. A principal vantagem desta técnica é a seleção contínua do descendente mais persuadido em condições laboratoriais específicas.

Inicie este procedimento com a preparação do equipamento, bem como o meio inicial, o meio de tensão e o meio de alta tensão, conforme descrito no protocolo de texto. Inocular uma única colônia ou E.coli do tipo selvagem em um tubo de ensaio de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio inicial. Incube o tubo de ensaio em uma incubadora agitada por 12 horas a 37 graus Celsius e 220 rpm.

Incubar o frasco de quimiostato proporcionando aeração e agitação a 37 graus Celsius por seis horas. Após a incubação, conecte assepticamente a extremidade do tubo de silício das bombas ao frasco de quimiostato. Transfira assepticamente um mililitro de pré-cultura para o frasco de quimiostato.

Ligue a bomba de saída e colete a cultura na fase exponencial. Verifique a densidade óptica a 600 nanômetros da cultura da tubulação de saída. Em seguida, ligue a bomba de entrada.

Verifique a densidade óptica da cultura a 600 nanômetros da tubulação de saída a cada 24 horas. Depois de operar o quimiostato por 96 horas, que é uma rotatividade total de 9,6, troque o reservatório para a concentração mais baixa de meio de alta tensão. Quando você troca o reservatório por um meio de estresse mais alto, as células podem ficar chocadas.

Se a densidade celular for muito baixa, pare de alimentar o meio de estresse mais alto por algum tempo para restaurar a densidade celular. Se a densidade óptica for inferior a 0,2, pare a bomba de entrada de alimentação por seis horas. Reinicie a bomba de entrada e verifique se a densidade óptica é superior a 0.2.

Aumente gradualmente a concentração do estressor mudando gradualmente para um reservatório contendo uma concentração de estressor mais alta. Colete amostras da cultura adaptada sempre que atingir um marco de adaptação do estressor e armazene para análise genômica adicional. Para armazenamento de amostras, misture a amostra de cultura de 0,5 mililitro com 0,5 mililitros de uma solução esterilizada de glicerol a 80% e armazene-a a 80 graus Celsius.

Prepare o meio da placa 1.6%ager contendo o mesmo estressor na mesma concentração que no meio. Coloque 0,1 mililitros da cultura de saída do quimiostato e incube a 37 graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, retire as colônias individuais da placa usando um palito estéril e inocule-as em tubos de ensaio de 15 mililitros contendo o mesmo estressor e na mesma concentração média do quimiostato.

Incubar por seis horas. Transferir um mililitro do caldo de cultura para um erlenmeyer de 250 mililitros contendo 50 mililitros de meio. Colha 0,5 mililitros do caldo de cultura a cada hora e meça a densidade óptica em 600 nanômetros.

Compare a taxa de crescimento da cepa adaptada com a da cepa do tipo selvagem dado o estressor. A cepa de E.coli do tipo selvagem evoluiu em uma condição de estresse de alto succinato por 270 dias, o que corresponde a quase 930 gerações. Sempre que maior estresse de succinato foi adicionado, a concentração de biomassa foi imediatamente reduzida e depois restaurada.

Aqui é mostrado um diagrama esquemático do quimiostato com um mutante que é tolerante ao alto estresse do succinato. A maioria das células do tipo selvagem é lavada sob as condições de estresse e o mutante cresce mais. Eventualmente, a população do descendente mutante é aumentada.

A segunda e a terceira mutações são continuamente selecionadas e, eventualmente, dominam o quimiostato. Esta figura mostra que a cepa adaptada cresceu sem demora sob condições de alto estresse de succinato, enquanto a cepa do tipo selvagem não. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada à evolução laboratorial adaptativa usando um quimiostato com uma variação de estressores.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como adquirir e evoluir o microrganismo sob uma condição especificada. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em alguns meses. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não lavar as células do quimiostato adicionando muito estresse de uma só vez e lembre-se de verificar a densidade óptica todos os dias.

Seguindo este procedimento, métodos como análise do genoma e análise do transcriptoma podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual mutação contribui para a evolução tolerante ao estresse?