Name: Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Aprenda a evoluir microrganismos em laboratório usando quimiostato com E. coli. Este protocolo permite estudar respostas ao estresse e engenharia metabólica através de seleção contínua de descendentes adaptados.

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Este estudo foi apoiado financeiramente pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro da Coreia (programa do Centro de Biologia Sintética Inteligente 2012M3A6A8054887). P. Kim foi apoiado por uma bolsa da Universidade Católica da Coreia (2015).

1. Preparação Equipamento <ol><li> Obter um frasco quimiostato (150-250 ml) ou num balão de Erlenmeyer (250 ml) contendo uma abertura de entrada e uma porta de saída. Ligue as portas com tubo de silicone que permite taxas de fluxo de 10-100 ml / hr. Opcionalmente, usar um respiradouro de ar, uma porta de saída de ar, e portas de entrada e saída de água de temperatura controlada. </li><li> Obter um dispositivo adequado para o frasco quimiostato que fornece para agitação e controlo da temperatura (ou usar um incubador com agitação rotativa). </li><li> Obter duas bombas peristálticas de modo a fornecer meio fresco e recolher a cultura. </li><li> Obter um frasco reservatório (10-20 L) contendo um orifício de saída médio e uma porta de entrada de ar. </li><li> Obter tubo de silicone adequado para a taxa de diluição (isto é, identificação de 0,8 milímetros, a gama de fluxo 0,06-36 mL / min; L / S 13 tubos). </li></ol> 2. Médio Preparação e Esterilização <ol><li> meio inicial <ol><li> Dissolve-se 0,3 g de glucose, 0,08 g de NH 4Cl, 0,05 g de NaCl, 0,75 g de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, e 0,3 g de KH 2 PO 4 em 90 ml de água destilada (DW) em um frasco de quimiostato. </li><li> Selar o frasco quemostato junto com a tubulação usando grampos. Não selar a abertura de ar. </li><li> Esteriliza-se o frasco quimiostato numa autoclave a 121 ° C durante 15 min. Após a esterilização, armazenar o frasco quimiostato à temperatura ambiente. </li><li> Dissolve-se 0,02 g de MgSO 4 · 7H 2 O, 0,01 g de CaCl2, e 0,1 mg de tiamina em 10 ml de DW (solução A). </li><li> Filtrar a solução A, utilizando uma seringa e um filtro de seringa pré-esterilizados (um filtro de 0,45 um de poro). </li><li> Adicionar a solução A filtrados para o frasco quemostato. </li></ol></li><li> Média Tensão <ol><li> Dissolve-se 30 g de glucose, 8 g de NH 4 Cl, 5 g de NaCl, 75 g de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 30 g de KH 2 PO 4, e 300 g de succinato dissódico hexa-hidratado (Na 2 · · succinato 6H &lt;sub&gt; 2 O; o estressor utilizado neste experimento) em 9,9 L DW em um frasco reservatório. </li><li> Selar o frasco reservatório junto com a tubulação usando grampos. Não selar a abertura de ar. </li><li> Esteriliza-se o frasco reservatório em autoclave a 121 ° C durante 15 min. Após a esterilização, armazenar o frasco à temperatura ambiente. </li><li> Dissolve-se 2 g de MgSO 4 7H 2 O ·, 1 g de CaCl2, e 10 mg de tiamina em 100 ml de DW (solução A). </li><li> Filtrar a solução A com uma seringa e um filtro de seringa pré-esterilizados (um filtro de 0,45 um de poro). </li><li> Adicionar a solução A filtrados para o frasco reservatório. </li><li> Assepticamente conectar o tubo de silicone esterilizados para o frasco reservatório e anexar as bombas peristálticas. </li></ol></li><li> Médio-Alto estresse <ol><li> Prepare o meio como na secção 2.2, mas com uma maior concentração de estressor (ou seja, 3-5 g / L maior na adaptação succinato). Nota: Este protocolo é para adaptação a um estresse thno pode ser entregue através do meio. No caso de factores de stress físicos, tais como a temperatura, agitação, ou iluminação, o cultivo deve ser concebido em conformidade. </li></ol></li></ol> 3. cultivo inicial <ol><li> Inocular uma única colônia de tipo selvagem E. coli em um tubo de ensaio de 15 mL contendo 4 mL de meio inicial. </li><li> Incubar o tubo de ensaio num incubador com agitação durante 12 h a 37 ° C e 220 rpm. </li><li> Transfira assepticamente 1 ml de pré-cultura para o frasco quemostato. </li><li> Incubar o frasco quimiostato, fornecendo para arejamento (ar de 50 ml / min) e agitação (200 rpm), a 37 ° C durante 6 h. </li></ol> Adaptação 4. Estresse <ol><li> Assepticamente ligue a extremidade do tubo de silicone das bombas para o frasco quemostato. </li><li> Inicie a bomba de saída (10 ml / h ou superior) e recolher a cultura. Nota: A cultura deve estar na fase exponencial, tipicamente 4-8 horas após o cultivo inicial. </li><li> CHeck a densidade óptica (600 nm) da cultura a partir do tubo de saída. </li><li> Iniciar a bomba de entrada (10 ml / h, correspondendo a uma taxa de diluição de 0,1 hr -1). </li><li> Verifique a densidade óptica da cultura a 600 nm da tomada da tubagem a cada 24 h. </li><li> Operar o quimiostato durante 96 horas (volume 9,6 vezes) ou mais. Se a densidade óptica é estável, trocar o reservatório que contém o meio de alta tensão. Se a densidade óptica é inferior a 0,2, parar a bomba de entrada alimenta durante 6 h. Reinicie a bomba de entrada e verifique se a densidade óptica é superior a 0,2. </li><li> Aumentar gradualmente a concentração do estressor alterando a um reservatório que contém uma concentração mais elevada estressor. </li><li> Retirar amostras da cultura adaptada quando ela atinge um marco (por exemplo, uma estirpe adaptada a 100 g / L de stress succinato), e armazenamento para posterior análise genómica. </li><li> Para o armazenamento da amostra, misturar a amostra de cultura (0,5 ml) com um soluti esterilizado glicerol 80%na (0,5 ml) e armazená-lo a -80 ° C. Nota: Se o microorganismo adquire a capacidade de degradar o estressor durante o processo de ALE, a concentração estressor no frasco de fermentação não é a mesma que no reservatório fresco. </li></ol> 5.-colônia Único isolamento da estirpe adaptada-Stress <ol><li> Preparar o meio da placa de agar (1,6% de agar) contendo a mesma estressor e na mesma concentração do meio. </li><li> Placa da cultura de saída (0,1 ml) a partir do quimiostato, e incuba-se a 37 ° C durante 16 horas. </li><li> Escolha colónias isoladas da placa utilizando um palito esterilizado e inocular-los em 15 ml de tubos de ensaio que contêm o mesmo estressor e na mesma concentração forma como no quimiostato, e incuba-se durante 6 h. </li><li> Transferir 1 ml do caldo de cultura num balão de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio. Colheita de 0,5 ml do caldo de cultura a cada um de RH, e medir a DO a 600 nm. Compare a taxa de crescimento do strai adaptadaN ao da estirpe de tipo selvagem dado o estressor. </li></ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
<li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15(2014).</li>
<li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li>
<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
<li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+dynamics+during+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os microrganismos são capazes de se adaptar a quase todos os ambientes, devido à sua rápida taxa de crescimento e diversidade genética. evolução laboratório adaptável permite microorganismos a evoluir em condições destinadas, que fornece uma maneira de selecionar organismos individuais que abrigam mutações espontâneas que são benéficos nas condições dadas. A técnica quimiostato é mais robusto para a realização evolução de forma artificial do que as técnicas de transferência, pelas seguintes ...

Os microrganismos podem sobreviver e se adaptar a diversos ambientes. Sob forte estresse, a adaptação pode ocorrer por meio de aquisição de fenótipos benéficos por mutações genómicas aleatórias e posterior selecção positiva 1-3. Portanto, as células microbianas podem se adaptar mudando metabólica ou redes de regulação para o crescimento ideal, que é chamado de &quot;evolução adaptativa&quot;. tendências microbianas importantes recentes, como surtos de superbactérias e a ocorrência de cepas microbianas robustos, estão intimamente relacionadas com adaptativa evolução sob condições estressantes. Em condições de laboratório definidos, somos capazes de estudar os mecanismos de evolução molecular e até mesmo controlar a direção da evolução microbiana para várias aplicações. Ao contrário de organismos multicelulares, organismos unicelulares estão bem adaptados à evolução laboratório adaptativo (ALE), pelas seguintes razões: eles regeneram rapidamente, eles manter grandes populações, e é fácil de criar e manter homambientes ogeneous. Combinado com os recentes avanços em técnicas de sequenciação de ADN e tecnologias de alto rendimento, ALE permite a observação direta de alterações genômicas que levam a mudanças regulatórias sistémicos. dinâmica de mutação e uma diversidade da população também são observáveis. Estratégias de engenharia genética pode ser determinado a partir da análise de estirpes de AEA 4,5. Cultura em quimiostato é um método usado para obter as células em estado estacionário e aumentar a produtividade em processos de fermentação 6. Adiciona- se meio fresco e caldo de cultura é colhida durante o processo (este último inclui médio e de biomassa). Quimiostato cultura de longo prazo, no entanto, muda a produtividade de estado estacionário da cultura e provoca a acumulação de mutações espontâneas e selecção durante a cultura (Figura 1a). Sob várias pressões de seleção (estressores), o acúmulo de mutações é reforçada. Um aumento gradual de estresse em um longo prazo<html> quimiostato prevê uma selecção contínua de mutações que trabalham contra os factores de stress dadas, tais como temperatura, pH, pressão osmótica, inanição nutriente, oxidação, produtos finais tóxicos, etc. Colony transferência a partir de um meio sólido e de transferência em série de um meio líquido (repetido cultura lote) também permitirá aos investigadores obter microorganismos evoluídos (Figura 1B e 1C). Embora a cultura em quimiostato requer métodos complicados, a piscina de diversidade (número de repetições, e o tamanho da população) é maior do que a obtida por técnicas de transferência em série de transferência de colónia e. A exposição ao estresse estável para células individuais e diminuição da variação no estado celular durante a cultura em quimiostato (estado estacionário) são outros benefícios do ALE em comparação com técnicas baseadas em culturas de diluição. ALE induzida pelo estresse de Escherichia coli submetida a altas condições succinato é introduzido neste artigo. iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Métodos de laboratório evolução adaptativa (A) quimiostato;. (B) a transferência de série; (C) a transferência de colónia. As figuras de topo ilustrar o conceito dos métodos para ALE, e as figuras de fundo ilustrar o número de células que cresceram durante a ALE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Fermentador de mini-quimiostato</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>fabricado por encomenda especial</td></tr><tr><td>tubo de silício</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L / S 13</td><td>tamanho da tubulação pode ser variado dependendo da taxa de diluição e do tamanho do frasco do fermentador.</td></tr><tr><td>frasco reservatório</td><td>Bellco</td><td>Garrafa de armazenamento de mídia</td><td>20 L</td></tr><tr><td>produtos químicos</td><td>Sigma-Aldrich-grau</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>reagente glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Reagente ACS</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>para biologia molecular, adequado para cultura de células, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>reagente ACS, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98,5-101%</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>reagente ACS, etc; 99%</td></tr> <tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>reagente ACS, &ge; 98%</td></tr> <tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>reagente ACS, &ge; 96%</td></tr><tr><td>tiamina&middot; HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>grau de reagente, &ge; 99%</td></tr><tr><td>Na2&middot; succinato&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &ge; 99% de sucesso</td></tr></tbody></table>

processo para o adaptive laboratório evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

A evolução natural envolve diversidade genética, como mudanças ambientais e uma seleção entre pequenas populações. A evolução laboratorial adaptativa (ALE) refere-se à situação experimental em que a evolução é observada usando organismos vivos sob condições e estressores controlados; Os organismos são, portanto, artificialmente forçados a fazer mudanças evolutivas. Os microrganismos estão sujeitos a uma variedade de estressores no ambiente e são capazes de regular certas proteínas induzíveis por estresse para aumentar suas chances de sobrevivência. Mutações espontâneas que ocorrem naturalmente provocam mudanças no genoma de um microrganismo que afetam suas chances de sobrevivência. A exposição prolongada à cultura de quimiotato provoca um acúmulo de mutações espontâneas e torna dominante a cepa mais adaptável. Em comparação com os métodos de transferência de colônias e transferência serial, a cultura de quimiostato envolve o maior número de divisões celulares e, portanto, o maior número de populações diversas. Embora a cultura de quimiostato para ALE exija dispositivos de cultura mais complicados, ela é menos trabalhosa quando a operação começa. Análises genômicas e transcriptômicas comparativas da cepa adaptada fornecem pistas evolutivas sobre como os estressores contribuem para mutações que superam o estresse. O objetivo do presente artigo é trazer a evolução acelerada de microrganismos sob condições controladas de laboratório.

Para adaptação ao estresse de alta succinato, o tipo selvagem E. coli W3110 estirpe foi cultivada num quimiostato em D = 0,1 h -1 durante 270 dias (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Figura 2: adaptação ao estresse de alta succinato de E. coli W3110 usando cultura quemostato. setas finas indicam os tempos em que a concentração de estressor foi aument...

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

O objetivo geral deste procedimento é permitir que um microrganismo evolua em condições de laboratório. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de microbiologia, como relações na função adrenal, respostas ao estresse, engenharia metabólica e, é claro, evolução. A principal vantagem desta técnica é a seleção contínua do descendente mais bem-sucedido sob condições específicas de laboratório.Inicie este procedimento com a preparação do equipamento, bem como do meio inicial, meio de estresse e meio de alto estresse, conforme descrito no protocolo textual. Inocule uma única colônia ou E. coli tipo selvagem em um tubo de ensaio de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio inicial. Incube o tubo de ensaio em um incubador rotativo por 12 horas a 37 graus celsius e 220 rpm.Incube o frasco do quimostato com aeração e agitação a 37 graus celsius por seis horas. Após a incubação, conecte assépticamente a extremidade da tubulação de silicone das bombas ao frasco do quimostato. Transfira assépticamente um mililitro da pré-cultura para o frasco do quimostato.Inicie a bomba de saída e colete a cultura na fase exponencial. Verifique a densidade óptica a 600 nanômetros da cultura proveniente da tubulação de saída. Em seguida, inicie a bomba de entrada.Verifique a densidade óptica do cultivo a 600 nanômetros a partir da tubulação de saída a cada 24 horas. Após operar o quimiostato por 96 horas, o que corresponde a 9,6 volumes totais de renovação, troque o reservatório para o meio de maior estresse na menor concentração. Quando você trocar o reservatório para um meio de maior estresse, as células podem sofrer choque.Se a densidade celular for muito baixa, interrompa a alimentação com o meio de maior estresse por algum tempo para restabelecer a densidade celular. Se a densidade óptica for inferior a 0,2, pare a bomba de alimentação de entrada por seis horas. Reinicie a bomba de entrada e verifique se a densidade óptica está acima de 0,2.Aumente gradualmente a concentração do agente de estresse alterando progressivamente para um reservatório contendo uma concentração mais alta do agente de estresse. Colete amostras da cultura adaptada sempre que ela atingir um marco de adaptação ao agente de estresse e armazene-as para análises genômicas posteriores. Para o armazenamento das amostras, misture 0,5 mililitro da amostra de cultura com 0,5 mililitros de uma solução esterilizada de glicerol a 80% e armazene a 80 graus celsius.Prepare um meio sólido contendo 1,6% de ágar com o mesmo agente de estresse na mesma concentração do meio. Plaque 0,1 mililitro da cultura de saída do quimostato e incube a 37 graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, selecione colônias isoladas da placa utilizando um palito estéril e inóculo-as em tubos de ensaio de 15 mililitros contendo o mesmo agente de estresse e na mesma concentração de meio utilizada no quimostato.Incube por seis horas. Transfira um mililitro do caldo de cultura para um frasco erlenmeyer de 250 mililitros contendo 50 mililitros de meio. Colete 0,5 mililitros do caldo de cultura a cada hora e meça a densidade óptica a 600 nanômetros.Compare a taxa de crescimento da linhagem adaptada com a da linhagem selvagem na presença do agente estressante. A linhagem selvagem de E.coli foi evoluída em condição de estresse elevado por succinato durante 270 dias, o que corresponde a aproximadamente 930 gerações. Sempre que foi adicionado estresse maior por succinato, a concentração de biomassa foi imediatamente reduzida e depois restaurada.É mostrado aqui um diagrama esquemático do quimiostato com um mutante que é tolerante ao alto estresse de succinato. A maioria das células do tipo selvagem é lavada sob as condições de estresse e o mutante cresce mais. Eventualmente, a população do descendente mutante aumenta.As segunda e terceira mutações são continuamente selecionadas e eventualmente dominam o quimiostato. Esta figura mostra que a linhagem adaptada cresceu sem atraso sob condições de estresse elevado de succinato, enquanto a linhagem selvagem não cresceu. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada à evolução laboratorial adaptativa utilizando um quimiostato com variação de agentes estressores.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como adquirir e evoluir o microrganismo sob uma condição específica. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em alguns meses. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de não eliminar as células do quimostato adicionando muito estresse de uma só vez e lembrar-se de verificar a densidade óptica todos os dias.Após este procedimento, métodos como análise do genoma e análise do transcriptoma podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como qual mutação contribui para a evolução da tolerância ao estresse?

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Fonte: Jian, X., et al., Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando o Sistema de Cultura de Microgotículas Microbianas (MMC). J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra o uso de um sistema de cultura de microgotículas microbianas para impulsionar a evolução adaptativa das bactérias em direção à tolerância ao metanol. Ao misturar culturas bacterianas modificadas com um meio de estresse de alto teor de metanol e segmentá-las em microgotículas, o sistema seleciona mutantes que...

Evolução adaptativa de bactérias usando um sistema de cultura de microgotículas microbianas

Fonte: Jeong, H., et. al. Procedimento para Evolução Laboratorial Adaptativa de Microrganismos Usando Quimóstato. J. Vis. Exp. (2016).Este vídeo demonstra o isolamento seletivo e o crescimento de bactérias adaptadas ao estresse de uma cultura exposta a condições prolongadas de estresse. A cultura é placada sobre ágar contendo estressor, e uma única colônia é selecionada para inocular um meio líquido com o estressor. A absorvância é medida em intervalos regulares para monitorar o crescimento e...

Isolamento de Bactérias Adaptadas ao Estresse por Seleção de Colônia Única

Taxa de crescimento celular é um processo regulado e um dos principais determinantes da fisiologia celular. Cultura contínua usando quimiostatos permite o controle extrínseco da taxa de crescimento celular por limitação de nutrientes facilitar o estudo de redes moleculares que controlam o crescimento celular e como essas redes de evoluir para otimizar o crescimento celular.

O Uso de quimiostatos em Microbial Biologia de Sistemas

Temos desenvolvido e validado um conjunto de pequenas dimensões de quimiostatos em miniatura construído a partir de partes prontamente disponíveis para baixo custo. Resultados evolução fisiológica e experimental foram semelhantes aos quimiostatos de maior volume. A matriz ministat fornece uma plataforma compacta, barata e acessível para experimentos quemostato tradicionais, a genômica funcional e aplicações de rastreamento de produtos químicos.

Concepção e utilização de matrizes quemostato Multiplexados

Descrevemos um morbidostato configurável de baixo custo que permite a caracterização da resistência a antibióticos ajustando dinamicamente a concentração do medicamento. O dispositivo pode ser integrado a uma plataforma microfluídica multiplexada. A abordagem pode ser ampliada para estudos laboratoriais de resistência a antibióticos.

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

A estrutura eVOLVER permite a cultura microbiana contínua de alto débito com alta resolução e controle dinâmico sobre parâmetros experimentais. Este protocolo demonstra como aplicar o sistema para realizar um experimento de condicionamento físico complexo, orientando os usuários a programar o controle automatizado sobre muitas culturas individuais, medindo, coletando e interagindo com dados experimentais em tempo real.

Projetando experimentos de crescimento de células contínuas, de alta produtividade e automatizados usando o eVOLVER

Este protocolo descreve como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa. A MMC pode cultivar e subsu cultivar microrganismos automaticamente e continuamente e monitorar on-line seu crescimento com rendimento relativamente alto e boa paraleloização, reduzindo o consumo de mão-de-obra e reagente.

Cultivo Microbiano Automatizado e Evolução Adaptativa usando Sistema de Cultura microbiana de microdroplet (MMC)

Este protocolo descreve como manter o Experimento de Evolução de Longo Prazo (LTEE) de Escherichia coli realizando suas transferências diárias e congelamentos periódicos e como conduzir ensaios de competição para medir melhorias de aptidão em bactérias evoluídas. Esses procedimentos podem servir como um modelo para pesquisadores que iniciam seus próprios experimentos de evolução microbiana.

Transferências diárias, arquivamento de populações e medição da aptidão no experimento de evolução de longo prazo com Escherichia coli

Aqui, apresentamos um protocolo de evolução experimental para adaptação em termófilos utilizando termomisturadores de bancada de baixo custo e eficiência energética como incubadoras. A técnica é demonstrada através da caracterização da adaptação à temperatura em Sulfolobus acidocaldarius, um archaeon com temperatura ótima de crescimento de 75 °C.

Adaptação nos Extremos da Vida: Evolução Experimental com o Arqueão Extremófilo Sulfolobus acidocaldarius

Apresentamos um protocolo para o dispositivo de cultura contínua milifluida (MCCD), que permite o cultivo de populações bacterianas sob condições constantes de baixo teor de nutrientes (até centenas de concentrações nanomolares) ou flutuações temporais de nutrientes em uma escala de tempo minuciosa.

Um dispositivo milifluido contínuo para cultura para o estudo de Escherichia coli sob condições nutritivas baixas e flutuantes

Aprenda a evoluir microrganismos em laboratório usando quimiostato com E. coli. Este protocolo permite estudar respostas ao estresse e engenharia metabólica através de seleção contínua de descendentes adaptados.

Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato

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