Processo para o Adaptive Laboratório Evolução de microrganismos utilizando um quimiostato
20 de setembro de 2016
Aqui, apresentamos um protocolo para obter a evolução adaptativa laboratório de microrganismos em condições usando cultura quemostato. Além disso, é discutida análise genômica da estirpe evoluiu.
O objetivo geral deste procedimento é permitir que um microrganismo evolua em condições de laboratório. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de microbiologia, como relações na função adrenal, respostas ao estresse, engenharia metabólica e, é claro, evolução. A principal vantagem desta técnica é a seleção contínua do descendente mais bem-sucedido sob condições específicas de laboratório.
Inicie este procedimento com a preparação do equipamento, bem como do meio inicial, meio de estresse e meio de alto estresse, conforme descrito no protocolo textual. Inocule uma única colônia ou E. coli tipo selvagem em um tubo de ensaio de 15 mililitros contendo quatro mililitros de meio inicial. Incube o tubo de ensaio em um incubador rotativo por 12 horas a 37 graus celsius e 220 rpm.
Incube o frasco do quimostato com aeração e agitação a 37 graus celsius por seis horas. Após a incubação, conecte assépticamente a extremidade da tubulação de silicone das bombas ao frasco do quimostato. Transfira assépticamente um mililitro da pré-cultura para o frasco do quimostato.
Inicie a bomba de saída e colete a cultura na fase exponencial. Verifique a densidade óptica a 600 nanômetros da cultura proveniente da tubulação de saída. Em seguida, inicie a bomba de entrada.
Verifique a densidade óptica do cultivo a 600 nanômetros a partir da tubulação de saída a cada 24 horas. Após operar o quimiostato por 96 horas, o que corresponde a 9,6 volumes totais de renovação, troque o reservatório para o meio de maior estresse na menor concentração. Quando você trocar o reservatório para um meio de maior estresse, as células podem sofrer choque.
Se a densidade celular for muito baixa, interrompa a alimentação com o meio de maior estresse por algum tempo para restabelecer a densidade celular. Se a densidade óptica for inferior a 0,2, pare a bomba de alimentação de entrada por seis horas. Reinicie a bomba de entrada e verifique se a densidade óptica está acima de 0,2.
Aumente gradualmente a concentração do agente de estresse alterando progressivamente para um reservatório contendo uma concentração mais alta do agente de estresse. Colete amostras da cultura adaptada sempre que ela atingir um marco de adaptação ao agente de estresse e armazene-as para análises genômicas posteriores. Para o armazenamento das amostras, misture 0,5 mililitro da amostra de cultura com 0,5 mililitros de uma solução esterilizada de glicerol a 80% e armazene a 80 graus celsius.
Prepare um meio sólido contendo 1,6% de ágar com o mesmo agente de estresse na mesma concentração do meio. Plaque 0,1 mililitro da cultura de saída do quimostato e incube a 37 graus Celsius por 16 horas. Após a incubação, selecione colônias isoladas da placa utilizando um palito estéril e inóculo-as em tubos de ensaio de 15 mililitros contendo o mesmo agente de estresse e na mesma concentração de meio utilizada no quimostato.
Incube por seis horas. Transfira um mililitro do caldo de cultura para um frasco erlenmeyer de 250 mililitros contendo 50 mililitros de meio. Colete 0,5 mililitros do caldo de cultura a cada hora e meça a densidade óptica a 600 nanômetros.
Compare a taxa de crescimento da linhagem adaptada com a da linhagem selvagem na presença do agente estressante. A linhagem selvagem de E.coli foi evoluída em condição de estresse elevado por succinato durante 270 dias, o que corresponde a aproximadamente 930 gerações. Sempre que foi adicionado estresse maior por succinato, a concentração de biomassa foi imediatamente reduzida e depois restaurada.
É mostrado aqui um diagrama esquemático do quimiostato com um mutante que é tolerante ao alto estresse de succinato. A maioria das células do tipo selvagem é lavada sob as condições de estresse e o mutante cresce mais. Eventualmente, a população do descendente mutante aumenta.
As segunda e terceira mutações são continuamente selecionadas e eventualmente dominam o quimiostato. Esta figura mostra que a linhagem adaptada cresceu sem atraso sob condições de estresse elevado de succinato, enquanto a linhagem selvagem não cresceu. Uma estratégia semelhante pode ser aplicada à evolução laboratorial adaptativa utilizando um quimiostato com variação de agentes estressores.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como adquirir e evoluir o microrganismo sob uma condição específica. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em alguns meses. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de não eliminar as células do quimostato adicionando muito estresse de uma só vez e lembrar-se de verificar a densidade óptica todos os dias.
Após este procedimento, métodos como análise do genoma e análise do transcriptoma podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como qual mutação contribui para a evolução da tolerância ao estresse?
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a evolução laboratorial adaptativa de microrganismos utilizando cultivo em quimostato. Discute a análise genômica da linhagem evoluída e suas implicações na microbiologia.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Evolução em Laboratório
- Análise Genômica
Antecedentes
- A evolução laboratorial adaptativa permite que microrganismos evoluam sob condições controladas.
- Este método pode fornecer insights sobre respostas ao estresse e engenharia metabólica.
- A seleção contínua de descendentes potencializa o estudo de processos evolutivos.
- A preparação inicial do meio é crucial para a implementação bem-sucedida.
Objetivo do Estudo
- Permitir que microrganismos evoluam em um ambiente de laboratório.
- Investigar as relações entre respostas ao estresse e adaptações evolutivas.
- Facilitar estudos de engenharia metabólica.
Métodos Utilizados
- Preparação dos meios inicial, de estresse e de alto estresse.
- Inoculação de E. coli em tubo de ensaio com meio inicial.
- Incubação em incubadora com agitação nas condições especificadas.
- Monitoramento contínuo da evolução microbiana.
Resultados Principais
- Evolução bem-sucedida de microrganismos em condições controladas.
- Conhecimentos sobre os mecanismos de resposta ao estresse.
- Aplicações potenciais em engenharia metabólica.
- A análise genômica revela adaptações em cepas evoluídas.
Conclusões
- O protocolo permite a evolução laboratorial eficaz de microrganismos.
- Os resultados contribuem para a compreensão das adaptações microbianas.
- Este método pode ser aplicado a diversas questões de pesquisa em microbiologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A evolução laboratorial adaptativa utilizando cultivo em quimostato permite a seleção contínua de cepas microbianas sob condições controladas de estresse, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. Essa abordagem gera populações diversas por meio de altas taxas de divisão celular, melhorando a confiança preditiva para engenharia de cepas e otimização de vias metabólicas. O método facilita a continuidade translacional ao associar a evolução laboratorial à análise genômica e transcriptômica para identificar mutações adaptativas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da evolução induzida por estresse e da clarificação de vias.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao identificar cepas adaptativas dominantes sob pressão seletiva.
- Valor Preditivo: Gera populações mutantes diversas para validação funcional de alvos e identificação de compostos promissores.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados com fenótipos tolerantes ao estresse estabilizados para triagem subsequente.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade dos ensaios por meio de cultivo contínuo e gradientes definidos de agentes estressores.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em múltiplos agentes estressores e hospedeiros microbianos para prontidão em triagens.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona fenótipos de linhagens evoluídas a alterações genômicas, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Valor Operacional: Fornece continuidade evolutiva do estágio de descoberta até a validação pré-clínica por meio de marcos de adaptação rastreáveis.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de avanço ajustadas ao risco ao associar tolerância ao estresse a mutações específicas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses na fase inicial de descoberta até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica, com apoio de seleção contínua e saídas de análise genômica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da exposição controlada a estressores e enriquecimento de mutantes.
- Triagem: Fornece culturas prontas para ensaio e reprodutíveis, com monitoramento quantitativo da densidade óptica para comparação de cepas.
- Análises: Permite análise genômica e de transcriptoma comparativas para identificar mutações que contribuem para a tolerância ao estresse.
- Pesquisa Translacional: Conecta a evolução laboratorial à continuidade pré-clínica por meio de marcos documentados de adaptação e amostras criopreservadas.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para evoluir microrganismos sob diferentes estressores em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na engenharia de cepas ao revelar mecanismos de adaptação ao estresse.
- Valor Operacional: Reduz a intensidade de mão de obra após a configuração, por meio de cultivo contínuo automatizado e intervalos definidos de amostragem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao vincular resultados evolutivos aos fatores genômicos que determinam a aptidão.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de cepas com base em mutações adaptativas validadas e desempenho de crescimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microbiologia, operação de quimiostato e técnica asséptica.
- Depende de instrumentação para controle preciso de bomba, aeração, agitação e monitoramento da densidade óptica.
- Necessita padronização entre equipes para preparo de meios, gradientes de estresse e protocolos de amostragem.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir linhagens evoluídas para ensaios de validação em frascos agitados ou em placas.
- Inclui limitações práticas, como o risco de lavagem celular sob estresse excessivo e a necessidade de verificações diárias da densidade óptica para manter a estabilidade do cultivo.
